امیونوموڈولیٹری میٹابولائٹس ٹیومر مائیکرو ماحولیات (TME) کی ایک اہم خصوصیت ہیں، لیکن چند مستثنیات کے ساتھ، ان کی شناخت بڑی حد تک نامعلوم ہے۔ یہاں، ہم نے ان مختلف TME کمپارٹمنٹس کے میٹابولوم کو ظاہر کرنے کے لیے ٹیومر اور ہائی گریڈ سیروس کارسنوما (HGSC) والے مریضوں کے ٹیومر اور ٹی سیلز کا تجزیہ کیا۔ جلودر اور ٹیومر کے خلیوں میں میٹابولائٹ کے وسیع فرق ہوتے ہیں۔ جلودر کے مقابلے میں، ٹیومر میں دراندازی کرنے والے T خلیات 1-methylnicotinamide (MNA) میں نمایاں طور پر افزودہ ہوتے ہیں۔ اگرچہ T خلیات میں MNA کی سطح بلند ہے، نیکوٹینامائڈ N-methyltransferase (ایک انزائم جو S-adenosylmethionine سے nicotinamide میں میتھائل گروپس کی منتقلی کو اتپریرک کرتا ہے) کا اظہار صرف فبرو بلوسٹس اور ٹیومر خلیوں تک محدود ہے۔ عملی طور پر، ایم این اے ٹی خلیوں کو ٹیومر کو فروغ دینے والے سائٹوکائن ٹیومر نیکروسس فیکٹر الفا کو خارج کرنے کے لیے اکساتا ہے۔ لہذا، TME سے ماخوذ MNA T خلیوں کے مدافعتی ضابطے میں حصہ ڈالتا ہے اور انسانی کینسر کے علاج کے لیے ممکنہ امیونو تھراپی ہدف کی نمائندگی کرتا ہے۔
ٹیومر سے ماخوذ میٹابولائٹس اینٹی ٹیومر استثنیٰ پر گہرا روکا اثر ڈال سکتے ہیں، اور زیادہ سے زیادہ شواہد سے پتہ چلتا ہے کہ وہ بیماری کے بڑھنے کے لیے ایک اہم محرک کے طور پر بھی کام کر سکتے ہیں (1)۔ واربرگ اثر کے علاوہ، حالیہ کام نے ٹیومر خلیوں کی میٹابولک حالت اور ٹیومر مائیکرو ماحولیات (TME) کی مدافعتی حالت کے ساتھ اس کے تعلقات کو نمایاں کرنے کے لیے شروع کیا ہے۔ ماؤس ماڈلز اور انسانی ٹی سیلز کے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ گلوٹامین میٹابولزم (2)، آکسیڈیٹیو میٹابولزم (3) اور گلوکوز میٹابولزم (4) مختلف مدافعتی سیل ذیلی گروپوں پر آزادانہ طور پر کام کر سکتے ہیں۔ ان راستوں میں کئی میٹابولائٹس ٹی خلیوں کے اینٹی ٹیومر فنکشن کو روکتے ہیں۔ یہ ثابت ہوا ہے کہ coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) کی ناکہ بندی سے T خلیات کے پھیلاؤ کو نقصان پہنچ سکتا ہے، اور جسم میں BH4 کا اضافہ CD4 اور CD8 کے ذریعے ثالثی کے ذریعے ٹیومر مخالف مدافعتی ردعمل کو بڑھا سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، BH4 (5) کی انتظامیہ کی طرف سے kynurenine کے immunosuppressive اثر کو بچایا جا سکتا ہے۔ isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma میں، enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) کا سراو T سیل ایکٹیویشن، پھیلاؤ اور cytolysis کی سرگرمی (6) کو روکتا ہے۔ حال ہی میں، یہ دکھایا گیا ہے کہ methylglyoxal، glycolysis کا ایک ضمنی پروڈکٹ، myeloid اصل کے دبانے والے خلیات کے ذریعہ تیار کیا جاتا ہے، اور methylglyoxal کے T سیل کی منتقلی انفیکٹر T سیل کے کام کو روک سکتی ہے۔ علاج میں، methylglyoxal کی غیر جانبداری myeloid-derived suppressor cells (MDSC) کی سرگرمی پر قابو پا سکتی ہے اور ماؤس ماڈلز (7) میں چیک پوائنٹ بلاکڈ تھراپی کو ہم آہنگی سے بڑھا سکتی ہے۔ یہ مطالعات اجتماعی طور پر ٹی سیل فنکشن اور سرگرمی کو منظم کرنے میں TME سے ماخوذ میٹابولائٹس کے کلیدی کردار پر زور دیتے ہیں۔
ڈمبگرنتی کینسر (8) میں ٹی سیل کی خرابی کو بڑے پیمانے پر رپورٹ کیا گیا ہے۔ یہ جزوی طور پر ہائپوکسیا اور غیر معمولی ٹیومر ویسکولیچر (9) میں شامل میٹابولک خصوصیات کی وجہ سے ہے، جس کے نتیجے میں گلوکوز اور ٹرپٹوفن کو ضمنی مصنوعات جیسے کہ لیکٹک ایسڈ اور کائنورینائن میں تبدیل کیا جاتا ہے۔ ضرورت سے زیادہ ایکسٹرا سیلولر لییکٹیٹ انٹرفیرون-γ (IFN-γ) کی پیداوار کو کم کرتا ہے اور مائیلوسوپریسو سب گروپس (10، 11) کے فرق کو چلاتا ہے۔ ٹرپٹوفن کا استعمال براہ راست ٹی سیل کے پھیلاؤ کو روکتا ہے اور ٹی سیل ریسیپٹر سگنلنگ (12-14) کو روکتا ہے۔ ان مشاہدات کے باوجود، وٹرو ٹی سیل کلچر میں مدافعتی تحول کے ارد گرد بہت سارے کام آپٹمائزڈ میڈیا کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے، یا ویوو میں ہم جنس ماؤس ماڈل تک محدود، جن میں سے کوئی بھی انسانی کینسر اور فزیولوجیکل میکرو اور مائیکرو ماحول کی متفاوتیت کی مکمل عکاسی نہیں کرتا ہے۔
ڈمبگرنتی کینسر کی ایک عام خصوصیت پیریٹونیل پھیلاؤ اور جلودر کی ظاہری شکل ہے۔ جلودر میں سیل سیال کا جمع ہونا جدید بیماری اور خراب تشخیص (15) سے وابستہ ہے۔ رپورٹس کے مطابق، یہ منفرد کمپارٹمنٹ ہائپوکسک ہے، اس میں ویسکولر اینڈوتھیلیل گروتھ فیکٹر (VEGF) اور انڈولیمائن 2,3-dioxygenase (IDO) کی اعلی سطح ہوتی ہے، اور T ریگولیٹری خلیات اور myeloid inhibitory خلیات (15-18) کے ذریعے دراندازی کی جاتی ہے۔ جلودر کا میٹابولک ماحول خود ٹیومر سے مختلف ہو سکتا ہے، اس لیے پیریٹونیئل اسپیس میں ٹی سیلز کی دوبارہ پروگرامنگ غیر واضح ہے۔ اس کے علاوہ، ٹیومر کے ماحول میں موجود جلودر اور میٹابولائٹس کے درمیان کلیدی فرق اور تفاوت مدافعتی خلیوں کی دراندازی اور ٹیومر پر ان کے کام میں رکاوٹ بن سکتا ہے، اور مزید تحقیق کی ضرورت ہے۔
ان مسائل کو حل کرنے کے لیے، ہم نے خلیوں کی مختلف اقسام (بشمول CD4 + اور CD8 + T خلیات) کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک حساس خلیے کی علیحدگی اور مائع کرومیٹوگرافی ٹینڈم ماس اسپیکٹومیٹری (LC-MS/MS) کا طریقہ وضع کیا ہے اور ساتھ ہی ساتھ ٹیومر کے اندر اور درمیان اس کے میٹابولائٹس مریض کے اسیائٹس اور ٹیومر کے ماحول میں خلیات کو پھیلاتے ہیں۔ ہم اس طریقہ کو اعلی جہتی بہاؤ سائٹومیٹری اور سنگل سیل آر این اے سیکوینسنگ (scRNA-seq) کے ساتھ مل کر استعمال کرتے ہیں تاکہ ان کلیدی آبادیوں کی میٹابولک حیثیت کا انتہائی حل شدہ پورٹریٹ فراہم کیا جا سکے۔ اس طریقہ کار سے ٹیومر T خلیوں میں 1-methylnicotinamide (MNA) کی سطح میں نمایاں اضافہ کا انکشاف ہوا، اور وٹرو تجربات میں یہ ظاہر ہوا کہ T سیل کے فنکشن پر MNA کا امیونو موڈولیٹری اثر پہلے نامعلوم تھا۔ عام طور پر، یہ طریقہ ٹیومر اور مدافعتی خلیوں کے درمیان باہمی میٹابولک تعاملات کو ظاہر کرتا ہے، اور مدافعتی ضابطے کے میٹابولائٹس کے بارے میں منفرد بصیرت فراہم کرتا ہے، جو ٹی سیل پر مبنی ڈمبگرنتی کینسر کے امیونو تھراپی کے علاج کے مواقع کے علاج کے لیے مفید ہو سکتا ہے۔
ہم نے بیک وقت گلوکوز کی مقدار کو درست کرنے کے لیے اعلی جہتی بہاؤ سائٹومیٹری کا استعمال کیا [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) اور mitochondrial ایکٹیویٹی [MitoTracker (Red20, MT20)) ساتھ ساتھ مخصوص نشانات جو مدافعتی خلیات اور ٹیومر سیل کی آبادی میں فرق کرتے ہیں (ٹیبل S2 اور شکل S1A)۔ اس تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ ٹی خلیوں کے مقابلے میں، جلودر اور ٹیومر کے خلیوں میں گلوکوز کی مقدار زیادہ ہوتی ہے، لیکن مائٹوکونڈریل سرگرمی میں چھوٹے فرق ہوتے ہیں۔ ٹیومر کے خلیات [CD45-EpCAM (EpCAM)+] کا اوسط گلوکوز اٹھانا T خلیات سے تین سے چار گنا ہے، اور CD4 + T خلیات کا اوسط گلوکوز اٹھانا CD8 + T خلیات سے 1.2 گنا ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ ٹیومر انفلٹریٹنگ لیمفوسائٹس (TIL) کو بھی TMEF1 میں مختلف میٹابولک کی ضرورت ہوتی ہے)۔ اس کے برعکس، ٹیومر کے خلیوں میں مائٹوکونڈریل سرگرمی CD4 + T خلیوں کی طرح ہوتی ہے، اور دونوں قسم کے خلیوں کی mitochondrial سرگرمی CD8 + T خلیات (شکل 1B) سے زیادہ ہوتی ہے۔ عام طور پر، یہ نتائج میٹابولک سطح کو ظاہر کرتے ہیں۔ ٹیومر سیلز کی میٹابولک سرگرمی CD4+T سیلز سے زیادہ ہوتی ہے اور CD4+T سیلز کی میٹابولک سرگرمی CD8+T سیلز سے زیادہ ہوتی ہے۔ خلیوں کی اقسام میں ان اثرات کے باوجود، ٹیومر (شکل 1C) کے مقابلے میں CD4 + اور CD8 + T خلیوں کی میٹابولک حیثیت یا جلودر میں ان کے رشتہ دار تناسب میں کوئی مستقل فرق نہیں ہے۔ اس کے برعکس، CD45 سیل فریکشن میں، ٹیومر میں EpCAM+ سیلز کا تناسب جلودر (شکل 1D) کے مقابلے میں بڑھ گیا۔ ہم نے EpCAM + اور EpCAM- سیل اجزاء کے درمیان واضح میٹابولک فرق بھی دیکھا۔ EpCAM+ (ٹیومر) کے خلیوں میں EpCAM- خلیات کے مقابلے میں زیادہ گلوکوز کی مقدار اور مائٹوکونڈریل سرگرمی ہوتی ہے، جو TME میں ٹیومر خلیوں میں فائبرو بلاسٹس کی میٹابولک سرگرمی سے بہت زیادہ ہوتی ہے (شکل 1، E اور F)۔
(A اور B) گلوکوز اپٹیک کی میڈین فلوروسینس شدت (MFI) (2-NBDG) (A) اور CD4 + T خلیات کی مائٹوکونڈریل سرگرمی (MitoTracker گہرا سرخ) (B) نمائندہ گراف (بائیں) اور ٹیبلیٹڈ ڈیٹا (دائیں)، CD8 + T سیلز اور EpC4 کے طور پر CD8 + T سیلز اور EpC5 سیلز سے Epc5 سے۔ (C) جلودر اور ٹیومر میں CD4 + اور CD8 + خلیات (CD3 + T خلیات کا) کا تناسب۔ (D) جلودر اور ٹیومر (CD45−) میں EpCAM + ٹیومر خلیوں کا تناسب۔ (E اور F) EpCAM + CD45-ٹیومر اور EpCAM-CD45-میٹرکس گلوکوز اپٹیک (2-NBDG) (E) اور مائٹوکونڈریل سرگرمی (MitoTracker گہرا سرخ) (F) نمائندہ گراف (بائیں) اور ٹیبلیٹڈ ڈیٹا (دائیں) جلودر اور ٹیومر سیل۔ (G) CD25، CD137 اور PD1 اظہار کے نمائندہ گراف بہاؤ سائٹومیٹری کے ذریعے۔ (H اور I) CD4 + T خلیات (H) اور CD8 + T خلیات (I) پر CD25، CD137 اور PD1 اظہار۔ (J اور K) Naive، مرکزی میموری (Tcm)، انفیکٹر (Teff) اور انفیکٹر میموری (Tem) فینوٹائپس CCR7 اور CD45RO کے اظہار پر مبنی۔ جلودر اور ٹیومر میں CD4 + T خلیات (J) اور CD8 + T خلیات (K) کی نمائندہ تصاویر (بائیں) اور ٹیبلولر ڈیٹا (دائیں)۔ P قدریں جوڑی والے t-ٹیسٹ (*P<0.05، **P<0.01 اور ***P<0.001) کے ذریعے متعین کی جاتی ہیں۔ لائن مماثل مریضوں کی نمائندگی کرتی ہے (n = 6)۔ ایف ایم او، فلوروسینس مائنس ون؛ MFI، میڈین فلوروسینس کی شدت۔
مزید تجزیہ نے انتہائی حل شدہ ٹی سیل فینوٹائپک حیثیت کے درمیان دیگر اہم اختلافات کا انکشاف کیا۔ ٹیومر میں ایکٹیویٹڈ (فگر 1، جی ٹو آئی) اور انفیکٹر میموری (فگر 1، جے اور کے) جلودر (سی ڈی 3 + ٹی سیلز کا تناسب) کے مقابلے میں بہت زیادہ ہوتے ہیں۔ اسی طرح، ایکٹیویشن مارکر (CD25 اور CD137) اور کمی مارکر [پروگرامڈ سیل ڈیتھ پروٹین 1 (PD1)] کے اظہار کے ذریعہ فینوٹائپ کا تجزیہ کرنے سے یہ ظاہر ہوا کہ اگرچہ ان آبادیوں کی میٹابولک خصوصیات مختلف ہیں (شکل S1، B سے E)، لیکن یادداشت کے درمیان کوئی اہم فرق نہیں تھا یا میٹابولک اثر کا مشاہدہ نہیں کیا گیا۔ ذیلی سیٹ (شکل S1، F سے I)۔ سیل فینوٹائپس (21) کو خود بخود تفویض کرنے کے لیے مشین لرننگ کے طریقوں کا استعمال کرکے ان نتائج کی تصدیق کی گئی، جس سے مریض کے جلودر میں بڑی تعداد میں بون میرو سیلز (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) کی موجودگی کا مزید انکشاف ہوا (Figure S2A)۔ تمام شناخت شدہ سیل اقسام میں سے، اس مائیلائڈ سیل کی آبادی نے سب سے زیادہ گلوکوز کی مقدار اور مائٹوکونڈریل سرگرمی (شکل S2، B سے G) کو ظاہر کیا۔ یہ نتائج HGSC مریضوں میں جلودر اور ٹیومر میں پائے جانے والے متعدد سیل اقسام کے درمیان مضبوط میٹابولک فرق کو اجاگر کرتے ہیں۔
TIL کی میٹابونومک خصوصیات کو سمجھنے میں اہم چیلنج ٹیومر سے کافی پاکیزگی، معیار اور مقدار کے T سیل نمونوں کو الگ کرنے کی ضرورت ہے۔ حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ بہاؤ سائٹومیٹری کی بنیاد پر چھانٹنے اور مالا کی افزودگی کے طریقے سیلولر میٹابولائٹ پروفائلز (22-24) میں تبدیلیوں کا باعث بن سکتے ہیں۔ اس مسئلے پر قابو پانے کے لیے، ہم نے LC-MS/MS کے تجزیہ سے پہلے TIL کو جراحی سے بچائے گئے انسانی رحم کے کینسر سے الگ اور الگ کرنے کے لیے مالا کی افزودگی کے طریقہ کار کو بہتر بنایا (ملاحظہ کریں مواد اور طریقے؛ شکل 2A)۔ میٹابولائٹ تبدیلیوں پر اس پروٹوکول کے مجموعی اثرات کا اندازہ لگانے کے لیے، ہم نے اوپر کی مالا علیحدگی کے مرحلے کے بعد صحت مند عطیہ دہندگان کے ذریعے چالو کیے گئے ٹی سیلز کے میٹابولائٹ پروفائلز کا موازنہ ان خلیوں سے کیا جو مالا الگ نہیں ہوئے تھے لیکن برف پر رہے۔ کوالٹی کنٹرول کے اس تجزیے سے معلوم ہوا ہے کہ ان دو شرائط (r = 0.77) کے درمیان ایک اعلی تعلق ہے، اور 86 میٹابولائٹس کے گروپ کی تکنیکی ریپیٹ ایبلٹی میں زیادہ ریپیٹ ایبلٹی ہے (شکل 2B)۔ لہذا، یہ طریقے سیل کی قسم کی افزودگی سے گزرنے والے خلیوں میں میٹابولائٹ کا درست تجزیہ کر سکتے ہیں، اس طرح HGSC میں مخصوص میٹابولائٹس کی شناخت کے لیے پہلا ہائی ریزولوشن پلیٹ فارم فراہم کرتا ہے، اس طرح لوگوں کو سیل کی مخصوصیت کے جنسی تحول کے پروگرام کی گہرائی سے سمجھ حاصل کرنے کے قابل بناتا ہے۔
(A) مقناطیسی مالا کی افزودگی کا اسکیمیٹک خاکہ۔ LC-MS/MS کے تجزیہ سے پہلے، خلیات مقناطیسی مالا کی افزودگی کے مسلسل تین چکروں سے گزریں گے یا برف پر رہیں گے۔ (ب) میٹابولائٹس کی کثرت پر افزودگی کی قسم کا اثر۔ ہر افزودگی کی قسم ± SE کے لیے تین پیمائشوں کا اوسط۔ سرمئی لکیر 1:1 تعلق کی نمائندگی کرتی ہے۔ محور کے لیبل میں دکھائے گئے بار بار کی پیمائش کا انٹرا کلاس ارتباط (ICC)۔ NAD، نیکوٹینامائڈ ایڈنائن ڈینیوکلیوٹائڈ۔ (C) مریض میٹابولائٹ تجزیہ کے ورک فلو کا اسکیمیٹک خاکہ۔ جلودر یا ٹیومر مریضوں سے جمع کیے جاتے ہیں اور کریوپریزر ہوتے ہیں۔ ہر نمونے کے ایک چھوٹے سے حصے کا فلو سائٹومیٹری کے ذریعے تجزیہ کیا گیا، جبکہ بقیہ نمونے CD4+، CD8+ اور CD45-خلیوں کے لیے افزودگی کے تین دور سے گزرے۔ ان سیل فریکشنز کا تجزیہ LC-MS/MS کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ (D) معیاری میٹابولائٹ کی کثرت کا حرارت کا نقشہ۔ ڈینڈروگرام نمونوں کے درمیان یوکلیڈین فاصلوں کے وارڈ کے جھرمٹ کی نمائندگی کرتا ہے۔ (E) نمونے کے میٹابولائٹ نقشے کا پرنسپل جزو تجزیہ (PCA)، ہر نمونے کی تین نقلیں دکھا رہا ہے، ایک ہی مریض کے نمونے ایک لائن سے جڑے ہوئے ہیں۔ (F) مریض پر مشروط نمونے کے میٹابولائٹ پروفائل کا PCA (یعنی، جزوی فالتو پن کا استعمال)؛ نمونہ کی قسم محدب ہل کے ذریعہ محدود ہے۔ PC1، اہم جزو 1؛ PC2، اہم جزو 2۔
اس کے بعد، ہم نے اس افزودگی کے طریقہ کار کو CD4 +، CD8 + اور CD45 سیل فریکشنز میں 99 میٹابولائٹس کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا جو HGSC کے چھ مریضوں کے پرائمری ایسائٹس اور ٹیومر (شکل 2C، فگر S3A اور ٹیبل S3 اور S4) میں ہے۔ سود کی آبادی زندہ خلیوں کے اصل بڑے نمونے کے 2% سے 70% تک ہوتی ہے، اور مریضوں کے درمیان خلیوں کا تناسب بہت مختلف ہوتا ہے۔ موتیوں کو الگ کرنے کے بعد، دلچسپی کا افزودہ حصہ (CD4+, CD8+ یا CD45-) نمونے میں اوسطاً تمام زندہ خلیوں کا 85% سے زیادہ ہوتا ہے۔ افزودگی کا یہ طریقہ ہمیں انسانی ٹیومر ٹشو میٹابولزم سے سیل کی آبادی کا تجزیہ کرنے کی اجازت دیتا ہے، جو بڑے نمونوں سے کرنا ناممکن ہے۔ اس پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے طے کیا کہ l-kynurenine اور adenosine، یہ دو اچھی خصوصیات والے امیونوسوپریسی میٹابولائٹس ٹیومر ٹی سیلز یا ٹیومر سیلز (شکل S3، B اور C) میں بلند تھے۔ لہذا، یہ نتائج مریض کے بافتوں میں حیاتیاتی طور پر اہم میٹابولائٹس تلاش کرنے کے لیے ہمارے خلیے کی علیحدگی اور ماس اسپیکٹومیٹری ٹیکنالوجی کی مخلصی اور قابلیت کو ظاہر کرتے ہیں۔
ہمارے تجزیے سے مریضوں کے اندر اور ان کے درمیان سیل اقسام کی مضبوط میٹابولک علیحدگی کا بھی انکشاف ہوا ہے (شکل 2D اور شکل S4A)۔ خاص طور پر، دوسرے مریضوں کے مقابلے میں، مریض 70 نے مختلف میٹابولک خصوصیات (فگر 2E اور Figure S4B) کو ظاہر کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ مریضوں کے درمیان کافی میٹابولک ہیٹروجنیٹی ہو سکتی ہے۔ یہ بات قابل غور ہے کہ دوسرے مریضوں (1.2 سے 2 لیٹر؛ ٹیبل ایس 1) کے مقابلے میں، مریض 70 (80 ملی لیٹر) میں جمع جلودر کی کل مقدار کم تھی۔ پرنسپل اجزاء کے تجزیے کے دوران بین مریضوں کی نسبت کا کنٹرول (مثال کے طور پر، جزوی فالتو تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے) سیل کی اقسام کے درمیان مستقل تبدیلیوں کو ظاہر کرتا ہے، اور خلیوں کی اقسام اور/یا مائیکرو ماحولیات واضح طور پر میٹابولائٹ پروفائل (شکل 2F) کے مطابق جمع ہوتے ہیں۔ واحد میٹابولائٹس کے تجزیے نے ان اثرات پر زور دیا اور سیل کی اقسام اور مائیکرو ماحولیات کے درمیان اہم فرق کو ظاہر کیا۔ یہ بات قابل توجہ ہے کہ سب سے زیادہ فرق MNA کا ہے، جو عام طور پر CD45-خلیات اور CD4+ اور CD8+ خلیوں میں افزودہ ہوتا ہے جو ٹیومر میں گھس جاتے ہیں (شکل 3A)۔ CD4 + خلیات کے لئے، یہ اثر سب سے زیادہ واضح ہے، اور CD8 + خلیات میں MNA بھی ماحول سے سخت متاثر ہوتا ہے۔ تاہم، یہ اہم نہیں ہے، کیونکہ چھ میں سے صرف تین مریضوں کو ٹیومر CD8+ اسکور کے لیے جانچا جا سکتا ہے۔ ایم این اے کے علاوہ، جلودر اور ٹیومر میں مختلف قسم کے خلیوں میں، دیگر میٹابولائٹس جن کی TIL میں خاصیت خراب نہیں ہے وہ بھی امتیازی طور پر امیر ہیں (اعداد و شمار S3 اور S4)۔ لہذا، یہ اعداد و شمار مزید تحقیق کے لیے امیونوموڈولیٹری میٹابولائٹس کا ایک امید افزا سیٹ ظاہر کرتے ہیں۔
(A) CD4+, CD8+ اور CD45- جلودر اور ٹیومر سے خلیوں میں MNA کا معمول کے مطابق مواد۔ باکس پلاٹ میڈین (لائن)، انٹرکوارٹائل رینج (فریم قبضہ) اور ڈیٹا رینج، انٹرکوارٹائل رینج (فریم وِسکر) سے 1.5 گنا تک دکھاتا ہے۔ جیسا کہ مریض کے مواد اور طریقوں میں بیان کیا گیا ہے، P قدر (*P <0.05 اور **P <0.01) کا تعین کرنے کے لیے مریض کی لِما قدر کا استعمال کریں۔ (بی) ایم این اے میٹابولزم کا اسکیمیٹک ڈایاگرام (60)۔ میٹابولائٹس: S-adenosyl-1-methionine؛ SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA، نیکوٹینامائڈ؛ ایم این اے، 1-میتھیلنیکوٹینامائڈ؛ 2-PY، 1-میتھائل- 2-پائریڈون-5-کاربوکسامائڈ؛ 4-PY، 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide؛ NR، نیکوٹینامائڈ رائبوز؛ NMN، نیکوٹینامائڈ مونونوکلیوٹائڈ۔ خامروں (سبز): NNMT، nicotinamide N-methyltransferase؛ SIRT، sirtuins؛ NAMPT، نیکوٹینامائڈ فاسفوریبوسل ٹرانسفراز؛ AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK، نیکوٹینامائڈ رائبوسائیڈ کناز؛ NMNAT، nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase؛ پی این پی 1، پیورین نیوکلیوسائیڈ فاسفوریلیس۔ (C) ascites کے scRNA-seq کا t-SNE (گرے) اور ٹیومر (سرخ؛ n = 3 مریض)۔ (D) مختلف سیل آبادیوں میں NNMT اظہار scRNA-seq کا استعمال کرتے ہوئے شناخت کیا گیا۔ (E) SK-OV-3 میں NNMT اور AOX1 کا اظہار، انسانی برانن گردے (HEK) 293T، T خلیات اور MNA سے علاج شدہ T خلیات۔ فولڈ ایکسپریشن کو SK-OV-3 کے نسبت دکھایا گیا ہے۔ SEM کے ساتھ اظہار کا نمونہ دکھایا گیا ہے (n = 6 صحت مند عطیہ دہندگان)۔ 35 سے زیادہ Ct قدروں کو ناقابل شناخت (UD) سمجھا جاتا ہے۔ (F) SK-OV-3، HEK293T، T خلیات اور T خلیات میں SLC22A1 اور SLC22A2 کا اظہار 8mM MNA کے ساتھ علاج کیا گیا۔ فولڈ ایکسپریشن کو SK-OV-3 کے نسبت دکھایا گیا ہے۔ SEM کے ساتھ اظہار کا نمونہ دکھایا گیا ہے (n = 6 صحت مند عطیہ دہندگان)۔ 35 سے زیادہ Ct قدروں کو ناقابل شناخت (UD) سمجھا جاتا ہے۔ (G) MNA کے ساتھ انکیوبیشن کے 72 گھنٹے کے بعد فعال صحت مند ڈونر ٹی سیلز میں سیل MNA کا مواد۔ SEM کے ساتھ اظہار کا نمونہ دکھایا گیا ہے (n = 4 صحت مند عطیہ دہندگان)۔
MNA میتھائل گروپ کو S-adenosyl-1-methionine (SAM) سے nicotinamide (NA) میں nicotinamide N-methyltransferase (NNMT؛ شکل 3B) کے ذریعے منتقل کرکے تیار کیا جاتا ہے۔ این این ایم ٹی انسانی کینسر کی ایک قسم میں بہت زیادہ متاثر ہوتا ہے اور اس کا تعلق پھیلاؤ، حملے اور میٹاسٹیسیس (25-27) سے ہوتا ہے۔ TME میں T خلیوں میں MNA کے ماخذ کو بہتر طور پر سمجھنے کے لیے، ہم نے تین HGSC مریضوں (ٹیبل S5) کے جلودر اور ٹیومر میں سیل کی اقسام میں NNMT کے اظہار کو نمایاں کرنے کے لیے scRNA-seq کا استعمال کیا۔ تقریباً 6,500 خلیوں کے تجزیے سے معلوم ہوا کہ جلودر اور ٹیومر کے ماحول میں، NNMT کا اظہار فرضی فبروبلاسٹ اور ٹیومر سیل کی آبادی (شکل 3، C اور D) تک محدود تھا۔ یہ بات قابل غور ہے کہ کسی بھی آبادی میں کوئی واضح NNMT اظہار نہیں ہے جو PTPRC (CD45 +) (Figure 3D اور Figure S5A) کو ظاہر کرتا ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ میٹابولائٹ سپیکٹرم میں پائے جانے والے MNA کو T خلیوں میں متعارف کرایا گیا ہے۔ الڈیہائڈ آکسیڈیز 1 (AOX1) کا اظہار MNA کو 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) یا 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR) میں تبدیل کرتا ہے۔ شکل 3B) COL1A1 (Figure S5A) کا اظہار کرنے والے فائبرو بلاسٹس کی آبادی تک بھی محدود ہے، جو مل کر اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ T خلیات میں روایتی MNA میٹابولزم کی صلاحیت کی کمی ہے۔ ان ایم این اے سے متعلق جینوں کے اظہار کے پیٹرن کی تصدیق HGSC مریضوں (شکل S5B؛ n = 6) (16) کے جلودر سے دوسرے آزاد سیل ڈیٹا سیٹ کے ذریعے کی گئی۔ اس کے علاوہ، MNA کے ساتھ علاج کیے جانے والے صحت مند عطیہ دہندہ T خلیات کے مقداری پولیمریز چین ری ایکشن (qPCR) کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ کنٹرول SK-OV-3 ڈمبگرنتی ٹیومر خلیوں کے مقابلے، NNMT یا AOX1 کا تقریباً اظہار نہیں کیا گیا تھا (شکل 3E)۔ یہ غیر متوقع نتائج بتاتے ہیں کہ MNA فائبرو بلاسٹس یا ٹیومر سے TME میں ملحقہ T خلیوں میں چھپ سکتا ہے۔
اگرچہ امیدواروں میں گھلنشیل کیریئر 22 (SLC22) فیملی (SLC22A1، SLC22A2 اور SLC22A3) کے ذریعے انکوڈ شدہ نامیاتی کیٹیشن ٹرانسپورٹرز 1 سے 3 (OCT1، OCT2 اور OCT3) کا خاندان شامل ہے، لیکن MNA کے ممکنہ ٹرانسپورٹرز ابھی تک غیر متعینہ ہیں (28)۔ صحت مند عطیہ دہندہ T خلیوں سے mRNA کے QPCR نے SLC22A1 کی کم اظہار کی سطح ظاہر کی لیکن SLC22A2 کی ناقابل شناخت سطح، جس نے اس بات کی تصدیق کی کہ اس کی اطلاع پہلے ادب میں دی گئی تھی (شکل 3F) (29)۔ اس کے برعکس، SK-OV-3 ڈمبگرنتی ٹیومر سیل لائن نے دونوں ٹرانسپورٹرز (شکل 3F) کی اعلی سطح کا اظہار کیا۔
غیر ملکی ایم این اے کو جذب کرنے کی صلاحیت رکھنے والے ٹی سیلز کے امکان کو جانچنے کے لیے، صحت مند عطیہ دہندہ ٹی سیلز کو MNA کی مختلف تعداد کی موجودگی میں 72 گھنٹے تک کلچر کیا گیا۔ خارجی MNA کی غیر موجودگی میں، MNA کے سیلولر مواد کا پتہ نہیں لگایا جا سکتا (شکل 3G)۔ تاہم، خارجی MNA کے ساتھ علاج کیے جانے والے فعال T خلیات نے خلیوں میں MNA مواد میں خوراک پر منحصر اضافہ ظاہر کیا، 6 mM MNA (شکل 3G) تک۔ یہ نتیجہ بتاتا ہے کہ ٹرانسپورٹر اظہار کی کم سطح اور انٹرا سیلولر MNA میٹابولزم کے لیے ذمہ دار مرکزی انزائم کی کمی کے باوجود، TIL اب بھی MNA لے سکتا ہے۔
مریضوں کے T خلیوں میں میٹابولائٹس کے سپیکٹرم اور وٹرو MNA جذب کے تجربات اس امکان کو بڑھاتے ہیں کہ کینسر سے وابستہ فائبرو بلاسٹس (CAF) MNA کو خارج کرتے ہیں اور ٹیومر کے خلیات TIL کے فینوٹائپ اور کام کو منظم کر سکتے ہیں۔ ٹی سیلز پر ایم این اے کے اثر کا تعین کرنے کے لیے، ایم این اے کی موجودگی یا غیر موجودگی میں صحت مند ڈونر ٹی سیلز کو وٹرو میں چالو کیا گیا، اور ان کے پھیلاؤ اور سائٹوکائن کی پیداوار کا جائزہ لیا گیا۔ ایم این اے کو سب سے زیادہ خوراک میں شامل کرنے کے 7 دنوں کے بعد، آبادی کی دگنی تعداد میں اعتدال سے کمی واقع ہوئی، جبکہ تمام خوراکوں پر جوش برقرار رکھا گیا (شکل 4A)۔ اس کے علاوہ، exogenous MNA کے علاج کے نتیجے میں CD4 + اور CD8 + T خلیوں کے تناسب میں اضافہ ہوا جو ٹیومر نیکروسس فیکٹر-α (TNFα؛ شکل 4B) کا اظہار کرتے ہیں۔ اس کے برعکس، IFN-γ کی انٹرا سیلولر پیداوار CD4 + T خلیوں میں نمایاں طور پر کم ہوئی تھی، لیکن CD8 + T خلیوں میں نہیں، اور interleukin 2 (IL-2؛ شکل 4، C اور D) میں کوئی خاص تبدیلی نہیں آئی۔ لہذا، ان MNA سے علاج شدہ T سیل ثقافتوں کے سپرنٹنٹس کے انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) نے TNFα میں نمایاں اضافہ، IFN-γ میں کمی، اور IL-2 میں کوئی تبدیلی نہیں دکھائی (شکل 4، E سے G)۔ . IFN-γ کی کمی اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ MNA T خلیوں کی اینٹی ٹیومر سرگرمی کو روکنے میں کردار ادا کر سکتا ہے۔ T سیل میں ثالثی سائٹوٹوکسائٹی پر MNA کے اثر کی تقلید کرنے کے لیے، chimeric antigen ریسیپٹر T (FRα-CAR-T) خلیات جو فولیٹ ریسیپٹر α کو نشانہ بناتے ہیں اور CAR-T (GFP) کو گرین فلوروسینٹ پروٹین (GFP) -CAR-T) سیلز کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے، صحت مند خون کے عطیہ کرنے والے سیلز (moBnucle) کے ذریعے تیار کیے جاتے ہیں۔ CAR-T خلیات کو MNA کی موجودگی میں 24 گھنٹے تک کلچر کیا گیا، اور پھر انسانی SK-OV-3 ڈمبگرنتی ٹیومر سیلز کے ساتھ مل کر کلچر کیا گیا جو 10:1 کے ہدف کے تناسب کے لیے انفیکٹر پر فولیٹ ریسیپٹر α کا اظہار کرتا ہے۔ ایم این اے کے علاج کے نتیجے میں FRα-CAR-T خلیوں کی ہلاکت کی سرگرمی میں نمایاں کمی واقع ہوئی، جو کہ FRα-CAR-T خلیوں کی طرح تھی جو اڈینوسین (شکل 4H) کے ساتھ علاج کیے گئے تھے۔
(A) کل قابل عمل سیل کی گنتی اور آبادی دوگنا (PD) کلچر سے براہ راست 7 دن۔ بار گراف چھ صحت مند عطیہ دہندگان کے اوسط + SEM کی نمائندگی کرتا ہے۔ کم از کم n = 3 آزاد تجربوں سے ڈیٹا کی نمائندگی کرتا ہے۔ (B سے D) CD3/CD28 اور IL-2 کا استعمال T خلیوں کو ان کے متعلقہ MNA ارتکاز میں 7 دن تک چالو کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ تجزیہ سے پہلے، خلیات کو PMA/ionomycin کے ساتھ GolgiStop کے ساتھ 4 گھنٹے تک متحرک کیا گیا تھا۔ TNFα (B) T خلیوں میں اظہار۔ زندہ خلیوں میں TNFα اظہار کی مثال تصویر (بائیں) اور ٹیبلولر ڈیٹا (دائیں)۔ T خلیوں میں IFN-γ (C) اور IL-2 (D) اظہار۔ سائٹوکائنز کا اظہار بہاؤ سائٹوومیٹری کے ذریعہ ماپا گیا تھا۔ بار گراف اوسط (n = 6 صحت مند عطیہ دہندگان) + SEM کی نمائندگی کرتا ہے۔ P قدر کا تعین کرنے کے لیے تغیرات اور بار بار اقدامات (*P<0.05 اور **P<0.01) کا یک طرفہ تجزیہ استعمال کریں۔ کم از کم n = 3 آزاد تجربوں سے ڈیٹا کی نمائندگی کرتا ہے۔ (E to G) CD3/CD28 اور IL-2 کو 7 دن تک ان کے متعلقہ MNA ارتکاز میں T خلیوں کو چالو کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ میڈیم PMA/ionomycin محرک کے 4 گھنٹے پہلے اور بعد میں جمع کیا گیا تھا۔ TNFα (E)، IFN-γ (F) اور IL-2 (G) کے ارتکاز کو ELISA کے ذریعے ماپا گیا۔ بار گراف اوسط (n = 5 صحت مند عطیہ دہندگان) + SEM کی نمائندگی کرتا ہے۔ P قدر متغیر اور بار بار پیمائش (*P <0.05) کے یک طرفہ تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے طے کی جاتی ہے۔ نقطے والی لائن پتہ لگانے کی حد کی نشاندہی کرتی ہے۔ (H) سیل لیسس پرکھ۔ FRα-CAR-T یا GFP-CAR-T خلیوں کو 24 گھنٹے کے لیے اڈینوسین (250μM) یا MNA (10 mM) کے ساتھ ایڈجسٹ کیا گیا، یا علاج نہ کیا گیا (Ctrl)۔ SK-OV-3 خلیوں کی ہلاکت کی فیصد کی پیمائش کی گئی۔ ویلچ ٹی ٹیسٹ (*P <0.5 اور **P <0.01) کے ذریعے طے شدہ P قدر۔
MNA پر منحصر TNFα اظہار کے ضابطے کی میکانکی سمجھ حاصل کرنے کے لیے، MNA سے علاج شدہ T خلیات کے TNFα mRNA میں تبدیلیوں کا جائزہ لیا گیا (شکل 5A)۔ MNA کے ساتھ علاج کیے گئے صحت مند عطیہ دہندگان کے T خلیات نے TNFα ٹرانسکرپشن کی سطح میں دو گنا اضافہ دکھایا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ MNA TNFα ٹرانسکرپشن ریگولیشن پر منحصر ہے۔ اس ممکنہ ریگولیٹری میکانزم کی چھان بین کرنے کے لیے، دو معروف ٹرانسکرپشن عوامل جو TNFα کو منظم کرتے ہیں، یعنی ایکٹیویٹڈ T سیل نیوکلیئر فیکٹر (NFAT) اور مخصوص پروٹین 1 (Sp1)، کا جائزہ MNA کے قربت والے TNFα پروموٹر (30) کے جواب میں کیا گیا۔ TNFα پروموٹر 6 شناخت شدہ NFAT بائنڈنگ سائٹس اور 2 Sp1 بائنڈنگ سائٹس پر مشتمل ہے، جو ایک سائٹ پر اوورلیپ ہو رہی ہے [5'cap سے -55 بیس پیئرز (bp)] (30)۔ Chromatin immunoprecipitation (ChIP) نے دکھایا کہ جب MNA کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے تو TNFα پروموٹر کے ساتھ Sp1 کا پابند تین گنا بڑھ جاتا ہے۔ NFAT کی شمولیت بھی بڑھ گئی اور اہمیت تک پہنچ گئی (شکل 5B)۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ MNA TNFα کے اظہار کو Sp1 نقل کے ذریعے منظم کرتا ہے، اور کچھ حد تک NFAT کے اظہار کو بھی۔
(A) MNA کے بغیر مہذب T خلیوں کے مقابلے میں، MNA کے ساتھ علاج کیے جانے والے T خلیوں میں TNFα اظہار کی گنا تبدیلی۔ SEM کے ساتھ اظہار کا نمونہ دکھایا گیا ہے (n = 5 صحت مند عطیہ دہندگان)۔ کم از کم n = 3 آزاد تجربوں سے ڈیٹا کی نمائندگی کرتا ہے۔ (B) NFAT اور Sp1 کے بعد 8 mM MNA کے ساتھ یا اس کے بغیر علاج کیے گئے T خلیوں کے TNFα پروموٹر کو (Ctrl) اور PMA/ionomycin محرک کے ساتھ 4 گھنٹے تک ملایا گیا۔ امیونوگلوبلین جی (آئی جی جی) اور ایچ 3 بالترتیب امیونوپریسیپیٹیشن کے لئے منفی اور مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال ہوتے تھے۔ ChIP کی مقدار سے پتہ چلتا ہے کہ MNA سے علاج شدہ خلیوں میں TNFα پروموٹر کے ساتھ Sp1 اور NFAT کا پابند کنٹرول کے مقابلے میں کئی گنا بڑھ گیا ہے۔ کم از کم n = 3 آزاد تجربوں سے ڈیٹا کی نمائندگی کرتا ہے۔ P قدر کا تعین متعدد t-ٹیسٹوں سے ہوتا ہے (*** P <0.01)۔ (C) HGSC کے جلودر کے مقابلے میں، T خلیات (نان سائٹوٹوکسک) نے ٹیومر میں TNF کے بڑھتے ہوئے اظہار کو دکھایا۔ رنگ مختلف مریضوں کی نمائندگی کرتے ہیں۔ دکھائے گئے سیلز کو تصادفی طور پر 300 تک نمونہ بنایا گیا ہے اور اوور ڈرائنگ کو محدود کرنے کے لیے ان کو جھنجھوڑ دیا گیا ہے (** Padj = 0.0076)۔ (D) رحم کے کینسر کے لیے MNA کا مجوزہ ماڈل۔ ایم این اے ٹی ایم ای میں ٹیومر خلیوں اور فائبرو بلوسٹس میں تیار کیا جاتا ہے اور اسے ٹی خلیوں کے ذریعہ لیا جاتا ہے۔ MNA TNFα پروموٹر کے ساتھ Sp1 کی پابندی کو بڑھاتا ہے، جس کے نتیجے میں TNFα ٹرانسکرپشن اور TNFα سائٹوکائن کی پیداوار میں اضافہ ہوتا ہے۔ MNA بھی IFN-γ میں کمی کا سبب بنتا ہے۔ ٹی سیل فنکشن کی روک تھام قتل کی صلاحیت کو کم کرنے اور ٹیومر کی تیز رفتار نشوونما کا باعث بنتی ہے۔
رپورٹس کے مطابق، TNFα کے سامنے اور پیچھے پر منحصر اینٹی ٹیومر اور اینٹی ٹیومر اثرات ہیں، لیکن یہ رحم کے کینسر (31-33) کی نشوونما اور میٹاسٹیسیس کو فروغ دینے میں ایک معروف کردار رکھتا ہے۔ رپورٹس کے مطابق، رحم کے کینسر کے مریضوں میں جلودر اور ٹیومر ٹشوز میں TNFα کا ارتکاز سومی ٹشوز (34-36) سے زیادہ ہے۔ میکانزم کے لحاظ سے، TNFα سفید خون کے خلیات کی ایکٹیویشن، فنکشن اور پھیلاؤ کو کنٹرول کر سکتا ہے، اور کینسر کے خلیات کی فینوٹائپ کو تبدیل کر سکتا ہے (37، 38). ان نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، امتیازی جین کے اظہار کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ ٹیومر ٹشوز میں ٹی سیلز میں ٹی این ایف کو نمایاں طور پر ریگولیٹ کیا گیا تھا جو کہ جلودر (شکل 5C) کے مقابلے میں تھا۔ TNF اظہار میں اضافہ صرف T سیل کی آبادی میں غیر سائٹوٹوکسک فینوٹائپ (فگر S5A) کے ساتھ واضح تھا۔ خلاصہ طور پر، یہ اعداد و شمار اس نظریے کی تائید کرتے ہیں کہ MNA HGSC میں دوہری مدافعتی اور ٹیومر کو فروغ دینے والے اثرات رکھتا ہے۔
فلو سائٹومیٹری پر مبنی فلوروسینٹ لیبلنگ TIL میٹابولزم کا مطالعہ کرنے کا بنیادی طریقہ بن گیا ہے۔ ان مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ ثانوی لیمفائیڈ اعضاء کے پیریفرل بلڈ لیمفوسائٹس یا ٹی سیلز کے مقابلے میں، مورین اور انسانی TIL میں گلوکوز (4, 39) اور مائٹوکونڈریل فنکشن (19, 40) کے بتدریج نقصان کا زیادہ رجحان ہوتا ہے۔ اگرچہ ہم نے اس مطالعہ میں اسی طرح کے نتائج کا مشاہدہ کیا ہے، کلیدی ترقی ٹیومر کے خلیات اور TIL کے میٹابولزم کا ایک ہی ریسیکٹ شدہ ٹیومر ٹشو سے موازنہ کرنا ہے۔ ان میں سے کچھ پچھلی رپورٹس سے مطابقت رکھتے ہوئے، ٹیومر (CD45-EpCAM +) کے خلیات جلودر اور ٹیومر کے خلیات میں CD8 + اور CD4 + T خلیات سے زیادہ گلوکوز کی مقدار ہوتی ہے، اس بات کی تائید کرتی ہے کہ ٹیومر کے خلیات کے زیادہ گلوکوز لینے کا موازنہ T خلیوں سے کیا جا سکتا ہے۔ ٹی سیل مقابلہ کا تصور۔ ٹی ایم ای تاہم، ٹیومر خلیوں کی مائٹوکونڈریل سرگرمی CD8 + T خلیوں سے زیادہ ہے، لیکن mitochondrial سرگرمی CD4 + T خلیوں کی طرح ہے۔ یہ نتائج ابھرتے ہوئے تھیم کو تقویت دیتے ہیں کہ ٹیومر کے خلیوں کے لئے آکسیڈیٹیو میٹابولزم اہم ہے (41، 42)۔ وہ یہ بھی تجویز کرتے ہیں کہ CD8 + T خلیات CD4 + T خلیات کے مقابلے میں آکسیڈیٹیو dysfunction کے لیے زیادہ حساس ہو سکتے ہیں، یا یہ کہ CD4 + T خلیے مائٹوکونڈریل سرگرمی کو برقرار رکھنے کے لیے گلوکوز کے علاوہ کاربن ذرائع کا استعمال کر سکتے ہیں (43، 44)۔ واضح رہے کہ ہم نے CD4 + T ایفیکٹرز، ٹی انفیکٹر میموری اور ٹی سنٹرل میموری سیلز کے درمیان گلوکوز اپٹیک یا مائٹوکونڈریل سرگرمی میں کوئی فرق نہیں دیکھا۔ اسی طرح، ٹیومر میں CD8 + T خلیات کی تفریق حالت کا گلوکوز کے اخراج میں تبدیلیوں سے کوئی تعلق نہیں ہے، جو وٹرو میں کلچرڈ T سیلز اور Vivo (22) میں انسانی TIL کے درمیان نمایاں فرق کو اجاگر کرتا ہے۔ ان مشاہدات کی تصدیق غیرجانبدارانہ خودکار سیل آبادی کے استعمال سے بھی ہوئی، جس سے مزید انکشاف ہوا کہ CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ خلیات جن میں گلوکوز کی مقدار زیادہ ہوتی ہے اور ٹیومر خلیوں کے مقابلے مائٹوکونڈریل سرگرمی ہوتی ہے لیکن ان میں میٹابولک ایکٹو سیل کی آبادی ہوتی ہے۔ یہ آبادی scRNA-seq تجزیہ میں شناخت شدہ myeloid suppressor خلیات یا plasmacytoid dendritic خلیات کی پوٹیٹو ذیلی آبادی کی نمائندگی کر سکتی ہے۔ اگرچہ یہ دونوں انسانی ڈمبگرنتی ٹیومر میں رپورٹ ہوئے ہیں [45]، پھر بھی انہیں ضرورت ہے مزید کام اس مائیلوڈ ذیلی آبادی کو بیان کرنا ہے۔
اگرچہ فلو سائٹومیٹری پر مبنی طریقے سیل کی اقسام کے درمیان گلوکوز اور آکسیڈیٹیو میٹابولزم میں عمومی فرق کو واضح کر سکتے ہیں، لیکن TME میں مائٹوکونڈریل میٹابولزم کے لیے گلوکوز یا دیگر کاربن ذرائع سے تیار کردہ عین میٹابولائٹس کا ابھی تک تعین نہیں کیا جا سکا ہے۔ دیئے گئے TIL سبسیٹ کو میٹابولائٹس کی موجودگی یا غیر موجودگی کو تفویض کرنے کے لئے خلیوں کی آبادی کو ایکسائزڈ ٹشو سے پاک کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔ لہذا، ماس اسپیکٹومیٹری کے ساتھ مل کر ہمارا سیل افزودگی کا طریقہ ان میٹابولائٹس کے بارے میں بصیرت فراہم کر سکتا ہے جو ٹی سیلز اور ٹیومر سیل کی آبادی میں مریض کے نمونوں سے مماثل ہوتے ہیں۔ اگرچہ اس طریقہ کار کے فلوروسینس ایکٹیویٹڈ سیل چھانٹنے کے مقابلے میں فوائد ہیں، بعض میٹابولائٹ لائبریریاں موروثی استحکام اور/یا تیزی سے کاروبار کی شرح (22) کی وجہ سے متاثر ہو سکتی ہیں۔ اس کے باوجود، ہمارا طریقہ دو تسلیم شدہ امیونوسوپریسی میٹابولائٹس، اڈینوسین اور کینورینائن کی شناخت کرنے میں کامیاب رہا، کیونکہ وہ نمونے کی اقسام کے درمیان بہت مختلف ہوتے ہیں۔
ٹیومر اور TIL ذیلی قسموں کا ہمارا میٹا بونومک تجزیہ ڈمبگرنتی TME میں میٹابولائٹس کے کردار کے بارے میں مزید بصیرت فراہم کرتا ہے۔ سب سے پہلے، فلو سائٹومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے طے کیا کہ ٹیومر اور CD4 + T خلیوں کے درمیان مائٹوکونڈریل سرگرمی میں کوئی فرق نہیں ہے۔ تاہم، LC-MS/MS تجزیہ نے ان آبادیوں میں میٹابولائٹس کی کثرت میں نمایاں تبدیلیوں کا انکشاف کیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ TIL میٹابولزم اور اس کی مجموعی میٹابولک سرگرمی کے بارے میں نتائج کو محتاط تشریح کی ضرورت ہے۔ دوم، MNA وہ میٹابولائٹ ہے جس میں CD45-خلیات اور ٹی سیلز کے درمیان سب سے بڑا فرق ہے، ٹیومر نہیں۔ لہذا، کمپارٹمنٹلائزیشن اور ٹیومر کی جگہ TIL میٹابولزم پر مختلف اثرات مرتب کر سکتے ہیں، جو کہ دیے گئے مائیکرو ماحولیات میں ممکنہ تفاوت کو نمایاں کرتا ہے۔ تیسرا، ایم این اے پیدا کرنے والے اینزائم این این ایم ٹی کا اظہار بنیادی طور پر سی اے ایف تک محدود ہے، جو کہ ٹیومر کے خلیات ہیں، لیکن ٹیومر سے ماخوذ ٹی سیلز میں قابل شناخت ایم این اے کی سطح دیکھی جاتی ہے۔ ڈمبگرنتی CAF میں NNMT کی حد سے زیادہ کارکردگی کا کینسر کو فروغ دینے والا ایک معروف اثر ہے، جزوی طور پر CAF میٹابولزم، ٹیومر کے حملے اور میٹاسٹیسیس (27) کو فروغ دینے کی وجہ سے۔ اگرچہ TIL کی مجموعی سطح اعتدال پسند ہے، لیکن CAF میں NNMT کا اظہار کینسر جینوم اٹلس (TCGA) mesenchymal ذیلی قسم سے قریبی تعلق رکھتا ہے، جو خراب تشخیص (27, 46, 47) سے وابستہ ہے۔ آخر میں، MNA انحطاط کے لیے ذمہ دار اینزائم AOX1 کا اظہار بھی CAF آبادی تک محدود ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ T خلیات میں MNA کو میٹابولائز کرنے کی صلاحیت نہیں ہے۔ یہ نتائج اس خیال کی تائید کرتے ہیں کہ اگرچہ اس تلاش کی تصدیق کے لیے مزید کام کی ضرورت ہے، لیکن T خلیات میں MNA کی اعلیٰ سطح مدافعتی CAF مائیکرو ماحولیات کی موجودگی کی نشاندہی کر سکتی ہے۔
ایم این اے ٹرانسپورٹرز کی کم اظہار کی سطح اور ایم این اے میٹابولزم میں شامل کلیدی پروٹینوں کی ناقابل شناخت سطح کو دیکھتے ہوئے، ٹی سیلز میں ایم این اے کی موجودگی غیر متوقع ہے۔ نہ تو NNMT اور نہ ہی AOX1 کا پتہ scRNA-seq تجزیہ اور دو آزاد گروہوں کے ٹارگٹڈ qPCR سے لگایا جا سکا۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ MNA T خلیوں کے ذریعہ ترکیب نہیں کیا جاتا ہے، بلکہ TME کے آس پاس سے جذب ہوتا ہے۔ وٹرو تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ T خلیات خارجی MNA کو جمع کرتے ہیں۔
ہمارے ان وٹرو مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ خارجی MNA T خلیوں میں TNFα کے اظہار کو اکساتا ہے اور TNFα پروموٹر کے ساتھ Sp1 کے پابند کو بڑھاتا ہے۔ اگرچہ TNFα میں اینٹی ٹیومر اور اینٹی ٹیومر دونوں افعال ہوتے ہیں، لیکن رحم کے کینسر میں، TNFα رحم کے کینسر (31-33) کی نشوونما کو فروغ دے سکتا ہے۔ ڈمبگرنتی ٹیومر سیل کلچر میں TNFα کا غیرجانبدار ہونا یا ماؤس ماڈلز میں TNFα سگنل کا خاتمہ TNFα ثالثی سوزش والی سائٹوکائن کی پیداوار کو بہتر بنا سکتا ہے اور ٹیومر کی نشوونما کو روک سکتا ہے (32, 35)۔ لہذا، اس صورت میں، TME سے ماخوذ MNA TNFα پر منحصر میکانزم کے ذریعے آٹوکرائن لوپ کے ذریعے سوزش کے حامی میٹابولائٹ کے طور پر کام کر سکتا ہے، اس طرح رحم کے کینسر کی موجودگی اور پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے (31)۔ اس امکان کی بنیاد پر، TNFα ناکہ بندی کا مطالعہ ڈمبگرنتی کینسر کے ممکنہ علاج کے ایجنٹ کے طور پر کیا جا رہا ہے (37, 48, 49)۔ اس کے علاوہ، MNA CAR-T خلیوں کی cytotoxicity کو ڈمبگرنتی ٹیومر کے خلیات تک پہنچاتا ہے، MNA کی ثالثی سے مدافعتی دباو کے لیے مزید ثبوت فراہم کرتا ہے۔ اجتماعی طور پر، یہ نتائج ایک ایسے ماڈل کی تجویز کرتے ہیں جس میں ٹیومر اور سی اے ایف خلیے ایم این اے کو ایکسٹرا سیلولر ٹی ایم ای میں چھپاتے ہیں۔ (i) TNF-حوصلہ افزائی ڈمبگرنتی کینسر کی نشوونما اور (ii) MNA-حوصلہ افزائی T سیل سائٹوٹوکسک سرگرمی کی روک تھام کے ذریعے، اس کا دوہری ٹیومر اثر ہو سکتا ہے (شکل 5D)۔
آخر میں، تیزی سے سیل افزودگی، سنگل سیل کی ترتیب اور میٹابولک پروفائلنگ کے امتزاج کا استعمال کرتے ہوئے، اس مطالعہ نے HGSC مریضوں میں ٹیومر اور جلودر خلیوں کے درمیان بڑے امیونو میٹابولومک فرق کو ظاہر کیا۔ اس جامع تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ ٹی خلیوں کے درمیان گلوکوز کی مقدار اور مائٹوکونڈریل سرگرمی میں فرق ہے، اور ایم این اے کو ایک غیر سیل خود مختار مدافعتی ریگولیٹری میٹابولائٹ کے طور پر شناخت کیا ہے۔ ان اعداد و شمار کا اس بات پر اثر پڑتا ہے کہ کس طرح TME انسانی کینسر میں T سیل میٹابولزم کو متاثر کرتا ہے۔ اگرچہ ٹی خلیات اور کینسر کے خلیات کے درمیان غذائی اجزاء کے لیے براہ راست مسابقت کی اطلاع دی گئی ہے، میٹابولائٹس ٹیومر کے بڑھنے کو فروغ دینے اور ممکنہ طور پر اینڈوجینس مدافعتی ردعمل کو دبانے کے لیے بالواسطہ ریگولیٹرز کے طور پر بھی کام کر سکتے ہیں۔ ان ریگولیٹری میٹابولائٹس کے فعال کردار کی مزید تفصیل ٹیومر مخالف مدافعتی ردعمل کو بڑھانے کے لیے متبادل حکمت عملیوں کو کھول سکتی ہے۔
مریضوں کے نمونے اور کلینیکل ڈیٹا BC کینسر ٹیومر ٹشو ریپوزٹری کے ذریعے حاصل کیا گیا جو کینیڈین ٹشو ریپوزٹری نیٹ ورک کے ذریعہ تصدیق شدہ ہے۔ BC کینسر ریسرچ ایتھکس کمیٹی اور یونیورسٹی آف برٹش کولمبیا (H07-00463) کے منظور کردہ پروٹوکول کے مطابق، تمام مریضوں کے نمونوں اور طبی ڈیٹا نے باخبر تحریری رضامندی حاصل کی یا باضابطہ طور پر ان کی رضامندی سے دستبردار ہو گئے۔ نمونے تصدیق شدہ BioBank (BRC-00290) میں محفوظ کیے جاتے ہیں۔ مریض کی تفصیلی خصوصیات میزیں S1 اور S5 میں دکھائی گئی ہیں۔ cryopreservation کے لیے، ایک سکیلپل کا استعمال مریض کے ٹیومر کے نمونے کو میکانکی طور پر گلنے کے لیے کیا جاتا ہے اور پھر اسے 100-مائیکرون فلٹر کے ذریعے ایک خلیے کی معطلی حاصل کرنے کے لیے دھکیل دیا جاتا ہے۔ مریض کے جلودر کو 1500 rpm پر 4°C پر 10 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا تاکہ خلیات کو گولی لگائی جا سکے اور سپرناٹینٹ کو ہٹایا جا سکے۔ ٹیومر اور جلودر سے حاصل کردہ خلیوں کو 50% حرارت سے غیر فعال انسانی AB سیرم (Sigma-Aldrich)، 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) اور 10% dimethyl سلفوکسائیڈ میں cryopreserved کیا گیا تھا۔ یہ محفوظ شدہ سنگل سیل معطلی پگھلائی گئی تھی اور ذیل میں بیان کردہ میٹابولومکس اور میٹابولائٹ کے تعین کے لیے استعمال کی گئی تھی۔
مکمل میڈیم 0.22 μm فلٹر شدہ 50:50 اضافی RPMI 1640: AimV پر مشتمل ہے۔ RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) 10% ہیٹ غیر فعال انسانی AB سیرم (Sigma-Aldrich)، 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific)، 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) کے ساتھ اضافی Penicillin Streptomycin (PenStrep) محلول (Thermo Fisher Scientific) اور 50 μMB-mercaptoethanol۔ AimV (Invitrogen) کو 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) اور 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) کے ساتھ اضافی کیا جاتا ہے۔ فلو سائٹو میٹر سٹیننگ بفر 0.22μm فلٹرڈ فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS؛ Invitrogen) پر مشتمل ہے جو 3% ہیٹ غیر فعال AB انسانی سیرم (سگما) کے ساتھ اضافی ہے۔ سیل کی افزودگی کا بفر 0.22μm فلٹرڈ PBS پر مشتمل ہے اور 0.5% ہیٹ غیر فعال انسانی AB سیرم (Sigma-Aldrich) کے ساتھ ضمیمہ ہے۔
37 ° C مکمل میڈیم میں، خلیات کو 30 منٹ کے لیے 10 nM MT DR اور 100 μM 2-NBDG کے ساتھ داغ دیا گیا تھا۔ اس کے بعد ، خلیوں کو 15 منٹ کے لئے 4 ° C پر قابل عمل ڈائی eF506 سے داغ دیا گیا تھا۔ ایف سی بلاک (ای بایوسائنس) اور بریلیئنٹ اسٹین بفر (بی ڈی بایوسینس) میں سیلز کو دوبارہ معطل کریں، فلو سائٹو میٹر سٹیننگ بفر (مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق) میں پتلا کریں، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔ خلیات کو اینٹی باڈیز کے سیٹ (ٹیبل S2) کے ساتھ فلو سائٹومیٹری سٹیننگ بفر میں 4°C پر 20 منٹ تک داغ دیں۔ تجزیہ سے پہلے فلو سائٹومیٹری سٹیننگ بفر (Cytek Aurora؛ 3L-16V-14B-8R کنفیگریشن) میں خلیوں کو دوبارہ معطل کریں۔ سیل کاؤنٹ ڈیٹا کا تجزیہ کرنے کے لیے SpectroFlo اور FlowJo V10 استعمال کریں، اور ڈیٹا بنانے کے لیے GraphPad Prism 8 کا استعمال کریں۔ 2-NBDG اور MT DR کی میڈین فلوروسینس انٹیسٹیٹی (MFI) کو لاگ نارملائز کیا گیا تھا، اور پھر مماثل مریضوں کے حساب سے شماریاتی تجزیہ کے لیے ایک جوڑا ٹی ٹیسٹ استعمال کیا گیا تھا۔ تجزیہ سے 40 سے کم واقعات والی تمام آبادیوں کو ہٹا دیں۔ شماریاتی تجزیہ اور ڈیٹا ویژولائزیشن کرنے سے پہلے کسی بھی منفی اقدار کے لیے 1 کی MFI قدر درج کریں۔
مندرجہ بالا پراسیس پینل کی مینوئل گیٹنگ کی حکمت عملی کو پورا کرنے کے لیے، ہم نے FlowJo میں مردہ خلیات کو ختم کرنے کے بعد سیلز کو آبادی کو خود بخود تفویض کرنے کے لیے شکل کی پابندی کے درخت (FAUST) (21) کے ذریعے مکمل تشریح کا استعمال کیا۔ ہم دستی طور پر ان آبادیوں کو ضم کرنے کے لیے آؤٹ پٹ کا نظم کرتے ہیں جو بظاہر غلط لگائی گئی ہیں (PD1+ کو PD1-ٹیومر سیلز کے ساتھ جوڑ کر) اور برقرار رکھی ہوئی آبادی۔ ہر نمونے میں کل 11 آبادیوں کے لیے اوسطاً 2% سے زیادہ خلیات ہوتے ہیں۔
فیکول گریڈینٹ ڈینسٹی سینٹرفیوگریشن کا استعمال پی بی ایم سی کو لیوکوائٹ علیحدگی کی مصنوعات (STEMCELL ٹیکنالوجیز) سے الگ کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ CD8 + T سیلز کو CD8 MicroBeads (Miltenyi) کا استعمال کرتے ہوئے PBMC سے الگ تھلگ کیا گیا اور مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق 2 ہفتوں کے لیے TransAct (Miltenyi) کا استعمال کرتے ہوئے مکمل میڈیم میں بڑھایا گیا۔ خلیوں کو IL-7 (10 ng/ml؛ PeproTech) پر مشتمل مکمل میڈیم میں 5 دن تک کھڑے رہنے کی اجازت دی گئی تھی، اور پھر TransAct کے ساتھ دوبارہ حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔ 7 ویں دن، مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق، انسانی CD45 MicroBeads (Miltenyi) کو لگاتار تین راؤنڈز میں خلیات کی افزودگی کے لیے استعمال کیا گیا۔ خلیوں کو بہاؤ سائٹومیٹری تجزیہ کے لئے الگ کیا گیا تھا (جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے) ، اور 10 لاکھ خلیوں کو LC-MS/MS تجزیہ کے لئے تین بار الگ کیا گیا تھا۔ نمونوں پر LC-MS/MS کے ذریعے کارروائی کی گئی جیسا کہ ذیل میں بیان کیا گیا ہے۔ ہم نے 1,000 کے آئن نمبر کے ساتھ غائب میٹابولائٹ ویلیو کا تخمینہ لگایا۔ ہر نمونے کو کل آئن نمبر (TIC) کے ذریعے معمول بنایا جاتا ہے، تجزیے سے پہلے MetaboAnalystR میں منطقی طور پر تبدیل اور خود بخود نارمل ہوجاتا ہے۔
ہر مریض کے سنگل سیل معطلی کو پگھلا کر 40 μm فلٹر کے ذریعے مکمل میڈیم میں فلٹر کیا گیا تھا (جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے)۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، MicroBeads (Miltenyi) کا استعمال کرتے ہوئے مقناطیسی مالا کی علیحدگی کے ذریعے مثبت انتخاب کے مسلسل تین راؤنڈز کا استعمال CD8+, CD4+ اور CD45- سیلز (برف پر) کے نمونوں کی افزودگی کے لیے کیا گیا۔ مختصر میں، خلیات کو سیل افزودگی بفر میں دوبارہ معطل کیا جاتا ہے (جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے) اور شمار کیا جاتا ہے۔ خلیوں کو انسانی CD8 موتیوں، انسانی CD4 موتیوں یا انسانی CD45 موتیوں (Miltenyi) کے ساتھ 4 ° C پر 15 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا، اور پھر سیل افزودگی بفر سے دھویا گیا۔ نمونہ LS کالم (Miltenyi) سے گزرتا ہے، اور مثبت اور منفی حصوں کو جمع کیا جاتا ہے۔ دورانیہ کو کم کرنے اور سیل کی بحالی کے مرحلے کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے، CD8-فرکشن کو پھر CD4+ افزودگی کے دوسرے دور کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، اور CD4-فرکشن کو بعد میں آنے والی CD45-افزودگی کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ علیحدگی کے پورے عمل میں محلول کو برف پر رکھیں۔
میٹابولائٹ تجزیہ کے لیے نمونے تیار کرنے کے لیے، خلیوں کو ایک بار برف کے ٹھنڈے نمک کے محلول سے دھویا گیا، اور ہر نمونے میں 80% میتھانول کا 1 ملی لیٹر شامل کیا گیا، پھر مائع نائٹروجن میں گھمایا گیا اور جما دیا گیا۔ نمونوں کو تین منجمد پگھلنے کے چکروں کا نشانہ بنایا گیا اور 14,000 rpm پر 15 منٹ کے لئے 4 ° C پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ میٹابولائٹس پر مشتمل سپرنٹنٹ خشک ہونے تک بخارات بن جاتا ہے۔ میٹابولائٹس کو 0.03% فارمک ایسڈ کے 50 μl میں دوبارہ تحلیل کیا گیا، مکس کرنے کے لیے گھمایا گیا، اور پھر ملبے کو ہٹانے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔
جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے میٹابولائٹس نکالیں۔ میٹابولومکس ریسرچ کے لیے سپرناٹینٹ کو اعلی کارکردگی والے مائع کرومیٹوگرافی کی بوتل میں منتقل کریں۔ بیچ کے اثرات کو روکنے کے لیے سیلز کی ایک جیسی تعداد کے ساتھ ہر نمونے کا علاج کرنے کے لیے بے ترتیب علاج پروٹوکول کا استعمال کریں۔ ہم نے AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) پر پہلے شائع ہونے والے عالمی میٹابولائٹس کا ایک قابلیت کا جائزہ لیا۔ کرومیٹوگرافک تجزیہ اور چوٹی کے علاقے کا انضمام ملٹی کوانٹ ورژن 2.1 سافٹ ویئر (اپلائیڈ بایو سسٹم SCIEX) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔
میٹابولائٹ کی گمشدہ قیمت کا تخمینہ لگانے کے لیے 1000 کی آئن کی گنتی کا استعمال کیا گیا تھا، اور ہر نمونے کی TIC کا استعمال ہر دریافت شدہ میٹابولائٹ کے نارملائزڈ چوٹی ایریا کا حساب لگانے کے لیے کیا گیا تھا تاکہ نمونے کی پروسیسنگ سے آلہ کار تجزیہ کے ذریعے متعارف کرائی گئی تبدیلیوں کو درست کیا جا سکے۔ TIC کو معمول پر لانے کے بعد، MetaboAnalystR(51) (پہلے سے طے شدہ پیرامیٹر) کو لوگاریتھمک تبدیلی اور خودکار نارمل لائن اسکیلنگ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ ہم نے ویگن آر پیکج کے ساتھ پی سی اے کا استعمال نمونے کی اقسام کے درمیان میٹابولوم فرق کا تحقیقی تجزیہ کرنے کے لیے کیا، اور مریضوں کا تجزیہ کرنے کے لیے جزوی فالتو تجزیہ کا استعمال کیا۔ نمونوں کے درمیان یوکلیڈین فاصلے کو کلسٹر کرنے کے لیے ہیٹ میپ ڈینڈروگرام بنانے کے لیے وارڈ کا طریقہ استعمال کریں۔ ہم نے لیما (52) کو معیاری میٹابولائٹ کثرت پر استعمال کیا تاکہ سیل کی پوری قسم اور مائیکرو ماحولیات میں امتیازی طور پر پرچر میٹابولائٹس کی شناخت کی جاسکے۔ وضاحت کو آسان بنانے کے لیے، ہم ماڈل کی وضاحت کے لیے گروپ میین پیرامیٹر کا استعمال کرتے ہیں، اور مائیکرو ماحولیات میں سیل کی اقسام کو ہر گروپ (n = 6 گروپ) کے طور پر غور کرتے ہیں۔ اہمیت کے امتحان کے لیے، ہم نے ہر میٹابولائٹ کے لیے تین بار بار پیمائش کی، غلط نقل سے بچنے کے لیے، مریض کو لِما ڈیزائن میں رکاوٹ کے طور پر شامل کیا گیا۔ مختلف مریضوں کے درمیان میٹابولائٹس میں فرق کو جانچنے کے لیے، ہم نے مریضوں سمیت لیما ماڈل کو ایک مقررہ طریقے سے ایڈجسٹ کیا۔ ہم سیل کی قسم اور Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg تصحیح) کے مائیکرو ماحولیات کے درمیان پہلے سے مخصوص تضاد کی اہمیت کی اطلاع دیتے ہیں۔
ملٹینی ڈیڈ سیل ریموول کٹ (> ​​80٪ قابل عمل) کا استعمال کرتے ہوئے جوش افزودگی کے بعد، 10x 5′جین ایکسپریشن پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے کل لائیو منجمد جلودر اور ٹیومر کے نمونوں پر سنگل سیل ٹرانسکرپٹوم سیکوینسنگ کی گئی۔ مماثل ٹیومر اور جلودر والے پانچ معاملات کا تجزیہ کیا گیا، حالانکہ ایک ٹیومر کے نمونے کی کم عملداری نے اس کی شمولیت کو روکا۔ مریضوں کے متعدد انتخاب کو حاصل کرنے کے لیے، ہم نے 10x کرومیم کنٹرولر کی گلیوں میں ہر مریض کے نمونے اکٹھے کیے، اور جلودر اور ٹیومر کی جگہوں کا الگ الگ تجزیہ کیا۔ ترتیب کے بعد [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp پیئرڈ اینڈ (PE)، کیوبیک جینوم؛ ٹیومر اور جلودر کے لیے بالترتیب 73,488 اور 41,378 فی سیل ریڈز]]، ہم نے CellSNP اور Vireo (53) کا استعمال کیا (CellSNP کی بنیاد پر GRCh38 کی طرف سے فراہم کردہ کامن ہیومن SNP (VCF) کو عطیہ دہندہ کی شناخت تفویض کی گئی ہے۔ ہم مریض کی شناخت کے لیے SNPRIlate کے قریب استعمال کرتے ہیں) جین ٹائپ اسٹیٹس (IBS)، غیر تفویض شدہ خلیوں اور جلودر اور ٹیومر کے نمونوں کے درمیان مماثل عطیہ دہندگان کو چھوڑ کر (54) اس ٹاسک کی بنیاد پر، ہم نے ٹیومر اور جلودر میں سیل کی وافر نمائندگی کے ساتھ تین کیسز کو ڈاون اسٹریم کے تجزیہ کے بعد برقرار رکھا۔ تجزیہ کے لئے 6975 خلیات (بالترتیب 2792 اور 4183 خلیات) کا استعمال کیا گیا ہے جس میں مشترکہ قریبی پڑوسی نیٹ ورک (SNN) کے کلسٹروں کو اظہار کے ذریعہ کلسٹر سیلز کے ساتھ دستی طور پر ڈال دیا گیا تھا۔ t-SNE کی تعریف CD8A اور GZMA کے اظہار سے ہوتی ہے، ہم نے Izar et al (16) کے شائع شدہ ڈیٹا تک رسائی حاصل کی جس میں ان کے T-SNE ایمبیڈنگ، امیون سیل کے اظہار کو کنٹرول کر سکتے ہیں۔
پی بی ایم سی کو فیکول گریڈینٹ ڈینسٹی سنٹرفیوگریشن کے ذریعے لیوکوائٹ علیحدگی کی مصنوعات (STEMCELL ٹیکنالوجیز) سے الگ کیا گیا تھا۔ CD3 + خلیوں کو CD3 موتیوں (ملٹینی) کا استعمال کرتے ہوئے PBMC سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ MNA کی موجودگی یا غیر موجودگی میں، CD3+ خلیوں کو پلیٹ سے منسلک CD3 (5μg/ml)، حل پذیر CD28 (3μg/ml) اور IL-2 (300 U/ml؛ Proleukin) کے ساتھ چالو کیا گیا تھا۔ توسیع کے آخری دن، عملداری (فکس ایبل وائبلٹی ڈائی eFluor450، eBioscience) اور پھیلاؤ (123count eBeads، Thermo Fisher Scientific) کا فلو سائٹومیٹری کے ذریعے جائزہ لیا گیا۔ PMA (20 ng/ml) اور ionomycin (1μg/ml) کے ساتھ GolgiStop کے ساتھ 4 گھنٹے تک خلیات کو متحرک کر کے انفیکٹر فنکشن کا اندازہ کریں، اور CD8-PerCP (RPA-T8، BioLegend)، CD4-AF700 (RPA-T4)، BioLegend) اور TNFYNOFFIELO (TNFYC) کی نگرانی کریں۔ (MAb11، BD) QPCR اور ChIP خلیات کو PMA (20 ng/ml) اور ionomycin (1μg/ml) کے ساتھ 4 گھنٹے تک متحرک کریں۔ ELISA سپرنٹنٹ کو PMA (20 ng/ml) اور ionomycin (1 μg/ml) کے ساتھ محرک سے پہلے اور بعد میں 4 گھنٹے تک جمع کیا گیا تھا۔
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) کا استعمال کرتے ہوئے RNA کو الگ کرنے کے لیے مینوفیکچرر کے پروٹوکول پر عمل کریں۔ نمونے کو ہم آہنگ کرنے کے لیے QIAshredder (QIAGEN) کا استعمال کریں۔ تکمیلی ڈی این اے (سی ڈی این اے) کی ترکیب کے لیے اعلیٰ صلاحیت والے آر این اے کو سی ڈی این اے کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کریں۔ TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) کو درج ذیل پروبس کے ساتھ جین ایکسپریشن (مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق) کی مقدار درست کرنے کے لیے استعمال کریں: Hs00196287_m1 (NNMT)، Hs00154079_m1 (AOX1)، Hs021_579_m1 (AOX1) Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] اور Hs01010726_m1 (SLC22A2)۔ نمونے StepOnePlus ریئل ٹائم پی سی آر سسٹم (اپلائیڈ بایو سسٹم) (اپلائیڈ بایو سسٹم) پر مائیکرو ایمپ آپٹیکل فلم کے ساتھ مائیکرو ایمپ فاسٹ آپٹیکل 96 ویل ری ایکشن پلیٹ (اپلائیڈ بایو سسٹم) پر چلائے گئے تھے۔ کوئی بھی Ct قدر جو 35 سے زیادہ ہے اسے پتہ لگانے کی حد سے اوپر سمجھا جاتا ہے اور اسے ناقابل شناخت کے طور پر نشان زد کیا جاتا ہے۔
ChIP انجام دیں جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (58)۔ مختصراً، خلیوں کا علاج formaldehyde (حتمی ارتکاز 1.42%) سے کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ اضافی سوجن بفر (25 mM Hepes، 1.5 mM MgCl2، 10 mM KCl اور 0.1% NP-40) برف پر 10 منٹ تک استعمال کریں، پھر امیونوپریسیپیٹیشن بفر میں دوبارہ بند کریں جیسا کہ بیان کیا گیا ہے (58)۔ نمونے کو پھر درج ذیل سائیکلوں کے ساتھ سونیکیٹ کیا گیا تھا: 10 سائیکل (20 1 سیکنڈ کی دالیں) اور 40 سیکنڈ کا جامد وقت۔ ChIP گریڈ امیونوگلوبلین G (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی؛ 1μl)، ہسٹون H3 (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی؛ 3μl)، NFAT (انویٹروجن؛ 3μl) اور SP1 (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی؛ 3μl) اینٹی باڈیز کو نمونے کے ساتھ 4°CC پر رات بھر ہلائیں۔ پروٹین A موتیوں (تھرمو فشر سائنٹیفک) کو نمونے کے ساتھ 4°C پر 1 گھنٹے تک ہلکی ہلکی ہلکی ہلکی ہلکی ہلکی کے ساتھ لگائیں، پھر DNA کو افزودہ کرنے کے لیے chelex beads (Bio-Rad) استعمال کریں، اور پروٹین ہضم کے لیے proteinase K (تھرمو فشر) کا استعمال کریں۔ TNFα پروموٹر کا PCR کے ذریعے پتہ چلا: آگے، GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT؛ اس کے برعکس، GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp پروڈکٹ)۔ تصاویر امیج لیب (بائیو ریڈ) کے ذریعہ تیار کی گئیں اور امیج جے سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئیں۔
سیل کلچر سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا تھا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ یہ تعین انسانی TNFα ELISA کٹ (انویٹروجن)، انسانی IL-2 ELISA کٹ (انویٹروجن) اور انسانی IFN-γ ELISA کٹ (Abcam) کے مینوفیکچرر کے طریقہ کار کے مطابق کیا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، سپرنٹنٹ کو TNFα اور IL-2 کا پتہ لگانے کے لیے 1:100 اور IFN-γ کا پتہ لگانے کے لیے 1:3 کو پتلا کیا گیا تھا۔ 450 nm پر جذب کی پیمائش کرنے کے لیے EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) استعمال کریں۔
پی بی ایم سی کو فیکول گریڈینٹ ڈینسٹی سنٹرفیوگریشن کے ذریعے لیوکوائٹ علیحدگی کی مصنوعات (STEMCELL ٹیکنالوجیز) سے الگ کیا گیا تھا۔ CD3 + خلیوں کو CD3 موتیوں (ملٹینی) کا استعمال کرتے ہوئے PBMC سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ MNA کی موجودگی یا غیر موجودگی میں، CD3+ سیلز کو پلیٹ سے منسلک CD3 (5μg/ml)، حل پذیر CD28 (3μg/ml) اور IL-2 (300 U/ml؛ Proleukin) کے ساتھ 3 دنوں کے لیے چالو کیا گیا۔ 3 دن کے بعد، خلیوں کو جمع کیا گیا اور 0.9٪ نمکین سے دھویا گیا، اور گولی کو منجمد کر دیا گیا۔ سیل کی گنتی 123count eBeads کا استعمال کرتے ہوئے بہاؤ cytometry (Cytek Aurora؛ 3L-16V-14B-8R کنفیگریشن) کے ذریعے کی گئی۔
جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے میٹابولائٹس نکالیں۔ خشک نچوڑ کو 4000 سیل مساوی / μl کے ارتکاز میں دوبارہ تشکیل دیا گیا تھا۔ الٹ فیز کرومیٹوگرافی (1290 انفینٹی II، Agilent Technologies، Santa Clara, CA) اور CORTECS T3 کالم (2.1×150 mm، پارٹیکل سائز 1.6-μm، pore size 120-Å; #186008500) کے ذریعے نمونے کا تجزیہ کریں۔ پولر ماس سپیکٹرومیٹر (6470، Agilent)، جس میں الیکٹرو سپرے آئنائزیشن مثبت موڈ میں کام کرتی ہے۔ موبائل فیز A 0.1% فارمک ایسڈ ہے (H2O میں)، موبائل فیز B 90% acetonitrile، 0.1% فارمک ایسڈ ہے۔ LC گریڈینٹ 100% A کے لیے 0 سے 2 منٹ، 99% B کے لیے 2 سے 7.1 منٹ، اور 99% B کے لیے 7.1 سے 8 منٹ۔ پھر کالم کو 3 منٹ کے لیے 0.6 ملی لیٹر/منٹ کی بہاؤ کی شرح سے موبائل فیز A کے ساتھ دوبارہ متوازن کریں۔ . بہاؤ کی شرح 0.4ml/min ہے، اور کالم چیمبر کو 50°C پر گرم کیا جاتا ہے۔ برقرار رکھنے کا وقت (RT) اور تبدیلی (RT = 0.882 منٹ، تبدیلی 1 = 137→94.1، تبدیلی 2 = 137→92، تبدیلی 3 = 7 → 37) قائم کرنے کے لیے MNA کا خالص کیمیائی معیار (M320995، ٹورنٹو ریسرچ کیمیکل کمپنی، نارتھ یارک، اونٹاریو، کینیڈا) استعمال کریں۔ جب تینوں ٹرانزیشن صحیح برقرار رکھنے کے وقت پر ہوتی ہیں، تو منتقلی 1 کو مقدار کے تعین کے لیے استعمال کیا جاتا ہے تاکہ مخصوصیت کو یقینی بنایا جا سکے۔ MNA (Toronto Research Chemical Company) کا معیاری وکر 0.1، 1.0، 10 اور 100 ng/ml اور 1.0 اور 10μg/ml کے معیارات حاصل کرنے کے لیے اسٹاک سلوشن (1 mg/ml) کے چھ سیریل ڈائیوشنز سے تیار کیا گیا تھا۔ پتہ لگانے کی حد 1 ng/ml ہے، اور لکیری ردعمل 10 ng/ml اور 10μg/ml کے درمیان ہے۔ نمونہ اور معیار کے دو مائیکرو لٹر کا ہر انجکشن LC/MS تجزیہ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، اور تجزیہ پلیٹ فارم کے استحکام کو یقینی بنانے کے لیے ہر آٹھ انجیکشن پر ایک مخلوط کوالٹی کنٹرول نمونہ چلایا جاتا ہے۔ تمام MNA سے علاج شدہ سیل نمونوں کے MNA کے جوابات پرکھ کی لکیری حد میں تھے۔ ڈیٹا کا تجزیہ ماس ہنٹر مقداری تجزیہ سافٹ ویئر (v9.0، Agilent) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔
دوسری نسل αFR-CAR کی تعمیر سونگ ایٹ ال سے لی گئی تھی۔ (59)۔ مختصراً، کنسٹرکٹ میں درج ذیل مواد شامل ہیں: CD8a لیڈر سیکوئنس، انسانی αFR-مخصوص سنگل چین متغیر فریگمنٹ، CD8a قبضہ اور ٹرانس میمبرین ریجن، CD27 انٹرا سیلولر ڈومین اور CD3z انٹرا سیلولر ڈومین۔ مکمل CAR ترتیب کو GenScript کے ذریعہ ترکیب کیا گیا تھا، اور پھر GFP ایکسپریشن کیسٹ کے دوسری نسل کے lentiviral expression vector میں کلون کیا گیا تھا جو نقل و حمل کی کارکردگی کو جانچنے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔
Lentivirus HEK293T خلیات کی منتقلی سے پیدا ہوتا ہے [امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (ATCC)؛ Dulbecco کے ترمیم شدہ Eagle میڈیم میں اگایا گیا جس میں 10% fetal bovine serum (FBS) اور 1% PenStrep، اور استعمال شدہ CAR-GFP ویکٹر اور پیکیجنگ پلاسمڈ (psPAX2 اور pMD2.G، Addgene) lipofection amine (Sigma-Aldrich) استعمال کرتے ہیں۔ وائرس پر مشتمل سپرنٹنٹ کو منتقلی کے 48 اور 72 گھنٹے بعد جمع کیا گیا، فلٹر کیا گیا اور الٹرا سینٹرفیوگریشن کے ذریعے مرتکز کیا گیا۔ منتقلی تک مرتکز وائرل سپرنٹنٹ کو -80°C پر ذخیرہ کریں۔
PBMC کو صحت مند ڈونر لیوکوائٹ سیپریشن پروڈکٹس (STEMCELL Technologies) سے Ficoll gradient density centrifugation کے ذریعے الگ کیا گیا ہے۔ CD8+ سیلز کو PBMC سے الگ کرنے کے لیے مثبت سلیکشن CD8 microbeads (Miltenyi) کا استعمال کریں۔ TransAct (Miltenyi) کے ساتھ اور TexMACS میڈیم [Miltenyi; 3% ہیٹ غیر فعال انسانی سیرم، 1% PenStrep اور IL-2 (300 U/ml)] کے ساتھ ضمیمہ۔ محرک کے چوبیس گھنٹے بعد، ٹی سیلز کو لینٹیو وائرس (10 μl مرتکز وائرس سپرنٹنٹ فی 106 خلیات) کے ساتھ منتقل کیا گیا۔ Cytek Aurora پر منتقلی کے 1 سے 3 دن بعد (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter) پر، Sinlet, GFP+)، کم از کم 30% کی نقل و حمل کی کارکردگی کو ظاہر کرنے کے لیے خلیوں کے GFP اظہار کا جائزہ لیں۔
CAR-T خلیوں کو 24 گھنٹوں کے لیے Immunocult (STEMCELL Technologies؛ 1% PenStrep کے ساتھ ضمیمہ) میں درج ذیل شرائط کے تحت کلچر کیا گیا: علاج نہ کیا گیا، 250 μM اڈینوسین یا 10 mM MNA سے علاج کیا گیا۔ قبل از علاج کے بعد، CAR-T خلیوں کو PBS سے دھویا گیا اور 20,000 SK-OV-3 خلیات [ATCC; McCoy 5A میڈیم (Sigma-Aldrich) میں 10% FBS اور 1% PenStrep کے ساتھ ضمیمہ: 1 کے ٹارگٹ تناسب کو ضمنی امیونوکلٹ میڈیم میں ٹرپلیکیٹ میں بڑھا دیا گیا۔ SK-OV-3 خلیات اور SK-OV-3 خلیات ڈیجیٹلس سیپونن (0.5mg/ml؛ سگما-Aldrich) کے ساتھ بالترتیب منفی اور مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیے گئے تھے۔ 24 گھنٹے کی مشترکہ کاشت کے بعد، سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا اور لییکٹیٹ ڈیہائیڈروجنیز (LDH) کو مینوفیکچرر کی ہدایات (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) کے مطابق ماپا گیا۔ LDH سپرناٹینٹ کو LDH بفر میں 1:50 پتلا کیا گیا تھا۔ قتل کا فیصد درج ذیل فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا: قتل کا فیصد = درستگی کا فیصد / زیادہ سے زیادہ قتل کی شرح x 100٪، جہاں اصلاح کا فیصد = کو-کلچر-ٹی سیلز، اور زیادہ سے زیادہ قتل کی شرح = مثبت کنٹرول-منفی کنٹرول۔
جیسا کہ متن یا مواد اور طریقوں میں بیان کیا گیا ہے، شماریاتی تجزیہ کے لیے GraphPad Prism 8، Microsoft Excel یا R v3.6.0 استعمال کریں۔ اگر ایک ہی مریض سے ایک سے زیادہ نمونے اکٹھے کیے جاتے ہیں (جیسے جلودر اور ٹیومر)، ہم ایک جوڑا ٹی ٹیسٹ استعمال کرتے ہیں یا مریض کو ایک لکیری یا عمومی ماڈل میں بے ترتیب اثر کے طور پر شامل کرتے ہیں۔ میٹابولومکس تجزیہ کے لیے، اہمیت کا امتحان سہ رخی میں کیا جاتا ہے۔
اس مضمون کے ضمنی مواد کے لیے، براہ کرم دیکھیں http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
یہ تخلیقی العام انتساب-غیر تجارتی لائسنس کی شرائط کے تحت تقسیم کیا گیا ایک کھلا رسائی مضمون ہے، جو کسی بھی میڈیم میں استعمال، تقسیم اور تولید کی اجازت دیتا ہے، جب تک کہ حتمی استعمال تجارتی فائدے کے لیے نہ ہو اور بنیاد یہ ہے کہ اصل کام درست ہے۔ حوالہ۔
نوٹ: ہم آپ سے صرف اپنا ای میل ایڈریس فراہم کرنے کو کہتے ہیں تاکہ آپ جس شخص کو صفحہ پر تجویز کرتے ہیں اسے معلوم ہو کہ آپ چاہتے ہیں کہ وہ ای میل دیکھیں اور یہ سپیم نہیں ہے۔ ہم کسی بھی ای میل ایڈریس پر قبضہ نہیں کریں گے۔
یہ سوال یہ جانچنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے کہ آیا آپ وزیٹر ہیں اور خودکار سپیم جمع کرانے سے روکتے ہیں۔
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour)، Sarah MacPherson (Sarah MacPherson)، Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias)، Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson)، John Stagg (John Stagg)، Brad H. Nelson (Brad H. Nelson)، بریڈ H. Nelson (Brad H. N. JR) DeBerardinis)، Russell G. Jones (Russel G. Jones)، Phineas T. Hamilton (Phineas T.
ایم این اے ٹی خلیوں کے مدافعتی دبانے میں حصہ ڈالتا ہے اور انسانی کینسر کے علاج کے لیے ایک ممکنہ امیونو تھراپی ہدف کی نمائندگی کرتا ہے۔
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour)، Sarah MacPherson (Sarah MacPherson)، Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias)، Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson)، John Stagg (John Stagg)، Brad H. Nelson (Brad H. Nelson)، بریڈ H. Nelson (Brad H. N. JR) DeBerardinis)، Russell G. Jones (Russel G. Jones)، Phineas T. Hamilton (Phineas T.
ایم این اے ٹی خلیوں کے مدافعتی دبانے میں حصہ ڈالتا ہے اور انسانی کینسر کے علاج کے لیے ایک ممکنہ امیونو تھراپی ہدف کی نمائندگی کرتا ہے۔
©2021 امریکن ایسوسی ایشن فار دی ایڈوانسمنٹ آف سائنس۔ تمام حقوق محفوظ ہیں۔ AAAS HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef اور COUNTER کا پارٹنر ہے۔ سائنس ایڈوانسز ISSN 2375-2548۔