پروپیونک ایسڈ (PPA)، ایک اینٹی فنگل ایجنٹ اور عام غذائی اضافی، کو چوہوں میں غیر معمولی نیورو ڈیولپمنٹ کا سبب دکھایا گیا ہے جس کے ساتھ معدے کی خرابی ہوتی ہے، جو گٹ ڈیسبیوسس کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ غذائی پی پی اے کی نمائش اور گٹ مائکرو بائیوٹا ڈیسبیوسس کے درمیان ایک لنک تجویز کیا گیا ہے، لیکن براہ راست تحقیقات نہیں کی گئی ہے. یہاں، ہم نے گٹ مائکرو بائیوٹا کمپوزیشن میں پی پی اے سے وابستہ تبدیلیوں کی تحقیقات کی جو ڈیسبیوسس کا باعث بن سکتی ہیں۔ چوہوں کے گٹ مائکرو بایوم کو غیر علاج شدہ غذا (n = 9) اور ایک PPA سے افزودہ غذا (n = 13) کو مائکروبیل مرکب اور بیکٹیریل میٹابولک راستوں میں فرق کا اندازہ کرنے کے لئے طویل فاصلے کی میٹجینومک ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا گیا تھا۔ غذائی پی پی اے اہم ٹیکس کی کثرت میں اضافے کے ساتھ منسلک تھا، بشمول متعدد بیکٹیرائڈز، پریوٹیلا، اور رومینوکوکس پرجاتیوں، جن کے ارکان پہلے پی پی اے کی پیداوار میں ملوث رہے ہیں۔ پی پی اے کے سامنے آنے والے چوہوں کے مائکرو بایوم میں لپڈ میٹابولزم اور سٹیرایڈ ہارمون بائیو سنتھیسس سے متعلق مزید راستے بھی تھے۔ ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ پی پی اے گٹ مائکروبیٹا اور اس سے وابستہ میٹابولک راستوں کو تبدیل کرسکتا ہے۔ یہ مشاہدہ شدہ تبدیلیاں اس بات پر روشنی ڈالتی ہیں کہ استعمال کے لیے محفوظ کے طور پر درجہ بندی کی گئی حفاظتی اشیاء گٹ مائیکرو بائیوٹا کی ساخت اور اس کے نتیجے میں انسانی صحت کو متاثر کر سکتی ہیں۔ ان میں سے، P، G یا S کا انتخاب درجہ بندی کی سطح کے تجزیہ کے لحاظ سے کیا جاتا ہے۔ غلط مثبت درجہ بندی کے اثرات کو کم کرنے کے لیے، 1e-4 (1/10,000 ریڈز) کی کم از کم رشتہ دار کثرت کی حد کو اپنایا گیا تھا۔ شماریاتی تجزیے سے پہلے، بریکن (فرکشن_ٹوٹل_ریڈز) کے ذریعہ رپورٹ کردہ نسبتا کثرت کو سینٹرڈ لاگ ریشو (سی ایل آر) ٹرانسفارمیشن (ایچیسن، 1982) کا استعمال کرتے ہوئے تبدیل کیا گیا تھا۔ ڈیٹا کی تبدیلی کے لیے CLR طریقہ کا انتخاب کیا گیا تھا کیونکہ یہ پیمانے پر متغیر ہے اور نان اسپارس ڈیٹاسیٹس کے لیے کافی ہے (Gloor et al., 2017)۔ CLR تبدیلی قدرتی لوگارتھم کا استعمال کرتی ہے۔ بریکن کے ذریعہ رپورٹ کردہ گنتی کے اعداد و شمار کو رشتہ دار لاگ اظہار (RLE) (Anders and Huber، 2010) کا استعمال کرتے ہوئے معمول بنایا گیا تھا۔ اعداد و شمار میٹپلوٹلیب v. 3.7.1، سیبورن v. 3.7.2 اور ترتیب وار لوگارتھمز (Gloor et al.، 2017) کے امتزاج کا استعمال کرتے ہوئے بنائے گئے تھے۔ 0.12.2 اور سٹینٹانوٹیشنز v. 0.5.0 (ہنٹر، 2007؛ واسکوم، 2021؛ چارلیر ایٹ ال۔، 2022)۔ عام بیکٹیریل شماروں کا استعمال کرتے ہوئے ہر نمونے کے لیے بیسیلس/بیکٹیرائڈائٹس کا تناسب شمار کیا گیا تھا۔ جدولوں میں رپورٹ کردہ اقدار کو 4 اعشاریہ جگہوں پر گول کیا گیا ہے۔ کریکن ٹولز v. 1.2 پیکیج (Lu et al., 2022) میں فراہم کردہ alpha_diversity.py اسکرپٹ کا استعمال کرتے ہوئے سمپسن ڈائیورسٹی انڈیکس کا حساب لگایا گیا۔ بریکن رپورٹ اسکرپٹ میں فراہم کی گئی ہے اور سمپسن انڈیکس "Si" -an پیرامیٹر کے لیے فراہم کی گئی ہے۔ کثرت میں نمایاں فرق کو مطلب CLR فرق ≥ 1 یا ≤ -1 کے طور پر بیان کیا گیا تھا۔ ±1 کا اوسط CLR فرق نمونے کی قسم کی کثرت میں 2.7 گنا اضافے کی نشاندہی کرتا ہے۔ نشان (+/-) اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ آیا بالترتیب PPA نمونے اور کنٹرول کے نمونے میں ٹیکسن زیادہ پایا جاتا ہے۔ اہمیت کا تعین Man-Whitney U ٹیسٹ (Virtanen et al.، 2020) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ Statsmodels v. 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010) استعمال کیا گیا تھا، اور Benjamini-Hochberg طریقہ کار کو متعدد جانچ کے لیے درست کرنے کے لیے لاگو کیا گیا تھا۔ ایک ایڈجسٹ شدہ p-value ≤ 0.05 کو شماریاتی اہمیت کا تعین کرنے کے لیے حد کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔
انسانی مائکرو بایوم کو اکثر "جسم کا آخری عضو" کہا جاتا ہے اور یہ انسانی صحت میں اہم کردار ادا کرتا ہے (Baquero and Nombela, 2012)۔ خاص طور پر، گٹ مائکروبیوم کو اس کے نظام کے وسیع اثر و رسوخ اور بہت سے ضروری افعال میں کردار کے لیے پہچانا جاتا ہے۔ کامنسل بیکٹیریا آنت میں وافر مقدار میں پائے جاتے ہیں، متعدد ماحولیاتی طاقوں پر قابض ہوتے ہیں، غذائی اجزاء کا استعمال کرتے ہیں، اور ممکنہ پیتھوجینز سے مقابلہ کرتے ہیں (جندھیالا ایٹ ال۔، 2015)۔ گٹ مائیکرو بائیوٹا کے متنوع بیکٹیریل اجزاء ضروری غذائی اجزاء جیسے وٹامنز پیدا کرنے اور عمل انہضام کو فروغ دینے کی صلاحیت رکھتے ہیں (Rowland et al.، 2018)۔ بیکٹیریل میٹابولائٹس کو ٹشو کی نشوونما پر اثر انداز ہونے اور میٹابولک اور مدافعتی راستوں کو بڑھانے کے لئے بھی دکھایا گیا ہے (ہیجٹز ایٹ ال۔، 2011؛ یو ایٹ ال۔، 2022)۔ انسانی آنتوں کے مائکرو بایوم کی ساخت انتہائی متنوع ہے اور اس کا انحصار جینیاتی اور ماحولیاتی عوامل پر ہوتا ہے جیسے خوراک، جنس، ادویات اور صحت کی حیثیت (Kumbhare et al.، 2019)۔
زچگی کی خوراک جنین اور نوزائیدہ کی نشوونما کا ایک اہم جز ہے اور مرکبات کا ایک اہم ذریعہ ہے جو ترقی کو متاثر کر سکتا ہے (بازر ایٹ ال۔، 2004؛ انیس، 2014)۔ دلچسپی کا ایسا ہی ایک مرکب پروپیونک ایسڈ (PPA) ہے، ایک مختصر سلسلہ فیٹی ایسڈ بائی پروڈکٹ جو بیکٹیریا کے ابال سے حاصل کیا جاتا ہے اور ایک فوڈ ایڈیٹیو (den Besten et al.، 2013)۔ پی پی اے میں اینٹی بیکٹیریل اور اینٹی فنگل خصوصیات ہیں اور اس وجہ سے اسے فوڈ پرزرویٹیو کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے اور صنعتی ایپلی کیشنز میں سڑنا اور بیکٹیریا کی افزائش کو روکنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے (ویمن ہوو ایٹ ال۔، 2016)۔ پی پی اے کے مختلف ٹشوز میں مختلف اثرات ہوتے ہیں۔ جگر میں، پی پی اے میکروفیجز میں سائٹوکائن اظہار کو متاثر کرکے سوزش کے اثرات رکھتا ہے (کاواسو ایٹ ال۔، 2022)۔ یہ ریگولیٹری اثر دوسرے مدافعتی خلیوں میں بھی دیکھا گیا ہے، جس کی وجہ سے سوزش کم ہوتی ہے (Haase et al.، 2021)۔ تاہم دماغ میں اس کے برعکس اثر دیکھا گیا ہے۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ پی پی اے کی نمائش چوہوں میں آٹزم جیسا رویہ پیدا کرتی ہے (El-Ansary et al.، 2012)۔ دیگر مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ پی پی اے گلیوسس کو آمادہ کرسکتا ہے اور دماغ میں سوزش کے حامی راستوں کو چالو کرسکتا ہے (عبدیلی ایٹ ال۔، 2019)۔ چونکہ PPA ایک کمزور تیزاب ہے، یہ آنتوں کے اپکلا کے ذریعے خون کے دھارے میں پھیل سکتا ہے اور اس طرح خون کے دماغ کی رکاوٹ کے ساتھ ساتھ نال (Stinson et al. اگرچہ آٹزم کے خطرے کے عنصر کے طور پر پی پی اے کا ممکنہ کردار فی الحال زیرِ تفتیش ہے، لیکن آٹزم کے شکار افراد پر اس کے اثرات اعصابی تفریق پیدا کرنے سے آگے بڑھ سکتے ہیں۔
معدے کی علامات جیسے اسہال اور قبض نیورو ڈیولپمنٹل عوارض کے مریضوں میں عام ہیں (Cao et al., 2021)۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ آٹزم اسپیکٹرم ڈس آرڈر (ASD) کے مریضوں کا مائکرو بایوم صحت مند افراد سے مختلف ہوتا ہے، جو گٹ مائیکرو بائیوٹا ڈیسبیوسس (Finegold et al.، 2010) کی موجودگی کی تجویز کرتا ہے۔ اسی طرح، آنتوں کی سوزش کی بیماریوں، موٹاپا، الزائمر کی بیماری، وغیرہ کے مریضوں کی مائکرو بایوم خصوصیات بھی صحت مند افراد سے مختلف ہوتی ہیں (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019)۔ تاہم، آج تک، گٹ مائکرو بایوم اور اعصابی امراض یا علامات (Yap et al., 2021) کے درمیان کوئی وجہ تعلق قائم نہیں کیا گیا ہے، حالانکہ یہ خیال کیا جاتا ہے کہ ان بیماریوں میں سے بعض میں بیکٹیریل کی کئی انواع کا کردار ہے۔ مثال کے طور پر، Akkermansia، Bacteroides، Clostridium، Lactobacillus، Desulfovibrio اور دیگر نسلیں آٹزم کے مریضوں کے مائیکرو بائیوٹا میں زیادہ پائی جاتی ہیں (Tomova et al. خاص طور پر، ان نسلوں میں سے کچھ کی رکن پرجاتیوں میں پی پی اے کی پیداوار سے وابستہ جینز کے لیے جانا جاتا ہے (ریچارڈٹ ایٹ ال۔، 2014؛ یون اور لی، 2016؛ ژانگ ایٹ ال۔، 2019؛ باؤر اور ڈور، 2023)۔ پی پی اے کی جراثیم کش خصوصیات کو دیکھتے ہوئے، اس کی کثرت کو بڑھانا پی پی اے پیدا کرنے والے بیکٹیریا کی نشوونما کے لیے فائدہ مند ثابت ہو سکتا ہے (جیکبسن ایٹ ال۔، 2018)۔ اس طرح، پی ایف اے سے بھرپور ماحول گٹ مائکرو بائیوٹا میں تبدیلیوں کا باعث بن سکتا ہے، بشمول معدے کے پیتھوجینز، جو کہ ممکنہ عوامل ہو سکتے ہیں جو معدے کی علامات کا باعث بنتے ہیں۔
مائکروبیوم ریسرچ میں ایک مرکزی سوال یہ ہے کہ کیا مائکروبیل ساخت میں فرق بنیادی بیماریوں کی وجہ یا علامت ہے۔ خوراک، گٹ مائکروبیوم، اور اعصابی بیماریوں کے درمیان پیچیدہ تعلق کو واضح کرنے کی طرف پہلا قدم مائکروبیل ساخت پر خوراک کے اثرات کا جائزہ لینا ہے۔ اس مقصد کے لیے، ہم نے پی پی اے سے بھرپور یا پی پی اے سے محروم خوراک کھلائے جانے والے چوہوں کی اولاد کے گٹ مائکرو بایوم کا موازنہ کرنے کے لیے طویل پڑھی جانے والی میٹجینومک ترتیب کا استعمال کیا۔ اولاد کو ان کی ماؤں جیسی خوراک دی جاتی تھی۔ ہم نے قیاس کیا کہ پی پی اے سے بھرپور غذا کے نتیجے میں گٹ مائکروبیل کمپوزیشن اور مائکروبیل فنکشنل پاتھ ویز میں تبدیلیاں آئیں گی، خاص طور پر وہ پی پی اے میٹابولزم اور/یا پی پی اے پروڈکشن سے متعلق ہیں۔
اس تحقیق میں FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J ٹرانسجینک چوہوں (جیکسن لیبارٹریز) کا استعمال کیا گیا جو کہ گلیا مخصوص GFAP پروموٹر کے کنٹرول میں گرین فلوروسینٹ پروٹین (GFP) کو اوور ایکسپریس کرتی ہے جو یونیورسٹی آف سینٹرل فلوریڈا انسٹیٹیوشنل اینیمل کیئر اینڈ یوز سی سی یو (Cumit-UseCumit) PROTO202000002)۔ دودھ چھڑانے کے بعد، چوہوں کو انفرادی طور پر پنجروں میں رکھا گیا تھا جس میں ہر پنجرے میں ہر جنس کے 1-5 چوہوں کے ساتھ رکھا گیا تھا۔ چوہوں کو پیوریفائیڈ کنٹرول ڈائیٹ (تبدیل شدہ اوپن لیبل معیاری خوراک، 16 کلو کیلوری فیٹ) یا سوڈیم پروپیونیٹ کی اضافی خوراک (ترمیم شدہ اوپن لیبل معیاری خوراک، 16 کلو کیلوری فیٹ، 5,000 پی پی ایم سوڈیم پروپیونیٹ) کے ساتھ کھلایا گیا۔ استعمال شدہ سوڈیم پروپیونیٹ کی مقدار 5,000 mg PFA/kg کھانے کے کل وزن کے برابر تھی۔ یہ پی پی اے کی سب سے زیادہ ارتکاز ہے جسے فوڈ پرزرویٹیو کے طور پر استعمال کے لیے منظور کیا گیا ہے۔ اس مطالعے کی تیاری کے لیے، والدین کے چوہوں کو ملن سے 4 ہفتے پہلے دونوں غذائیں کھلائی گئیں اور ڈیم کے حمل کے دوران جاری رہیں۔ اولاد والے چوہوں [22 چوہوں، 9 کنٹرولز (6 مرد، 3 خواتین) اور 13 پی پی اے (4 مرد، 9 خواتین)] کا دودھ چھڑایا گیا اور پھر 5 ماہ تک ڈیموں کی طرح اسی خوراک پر جاری رکھا گیا۔ اولاد والے چوہوں کو 5 ماہ کی عمر میں قربان کیا گیا تھا اور ان کے آنتوں کے فیکل مواد کو جمع کیا گیا تھا اور ابتدائی طور پر 1.5 ملی لیٹر مائکرو سینٹرفیوج ٹیوبوں میں -20 ° C پر محفوظ کیا گیا تھا اور پھر -80 ° C فریزر میں منتقل کیا گیا تھا جب تک کہ میزبان ڈی این اے ختم نہ ہو جائے اور مائکروبیل نیوکلک ایسڈز نکالے جائیں۔
میزبان ڈی این اے کو ایک ترمیم شدہ پروٹوکول (Charalampous et al.، 2019) کے مطابق ہٹا دیا گیا تھا۔ مختصراً، آنتوں کے مواد کو 500 μl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) میں منتقل کر کے منجمد کر دیا گیا۔ فی نکالنے کے لیے زیادہ سے زیادہ 1-2 فیکل گولیاں لگائیں۔ اس کے بعد ٹیوب کے اندر پلاسٹک کے موسل کا استعمال کرتے ہوئے حیض کے مواد کو میکانکی طور پر ہم آہنگ کیا گیا تاکہ ایک گارا بن سکے۔ نمونوں کو 10,000 RCF پر 5 منٹ کے لیے سینٹری فیوج کریں یا جب تک کہ نمونے چھرے نہ لگ جائیں، پھر سپرنٹنٹ کو اسپائریٹ کریں اور گولی کو 250 µl 1× PBS میں دوبارہ بند کریں۔ 250 μl 4.4% saponin محلول (TCI، پروڈکٹ نمبر S0019) کو بطور صابن یوکریوٹک سیل جھلیوں کو ڈھیلا کرنے کے لیے نمونے میں شامل کریں۔ نمونوں کو آہستہ سے ملایا گیا جب تک کہ ہموار نہ ہو اور کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ ہوجائے۔ اس کے بعد، یوکرائیوٹک خلیوں میں خلل ڈالنے کے لیے، نمونے میں 350 μl نیوکلیز سے پاک پانی شامل کیا گیا، 30 s تک انکیوبیٹ کیا گیا، اور پھر 12 μl 5 M NaCl شامل کیا گیا۔ اس کے بعد نمونوں کو 5 منٹ کے لیے 6000 RCF پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو اسپائریٹ کریں اور گولی کو 100 μl 1X PBS میں دوبارہ بند کریں۔ میزبان DNA کو ہٹانے کے لیے، 100 μl HL-SAN بفر (12.8568 g NaCl، 4 ml 1M MgCl2، 36 ملی لیٹر نیوکلیز فری پانی) اور 10 μl HL-SAN انزائم (ArticZymes P/N 70910-202) شامل کریں۔ نمونوں کو پائپنگ کے ذریعے اچھی طرح ملایا گیا اور Eppendorf™ ThermoMixer C پر 800 rpm پر 30 منٹ کے لیے 37 ° C پر انکیوبیشن کیا گیا۔ انکیوبیشن کے بعد، 3 منٹ کے لیے 6000 RCF پر سینٹری فیوج کیا گیا اور 800 µ1µ1µ1µ1µBS کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ آخر میں، گولی کو 100 µl 1X PBS میں دوبارہ معطل کریں۔
نیو انگلینڈ بائلابس مونارک جینومک ڈی این اے پیوریفیکیشن کٹ (نیو انگلینڈ بائلابس، ایپسوچ، ایم اے، کیٹ # T3010L) کا استعمال کرتے ہوئے کل بیکٹیریل ڈی این اے کو الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ کٹ کے ساتھ فراہم کردہ معیاری آپریٹنگ طریقہ کار میں قدرے ترمیم کی گئی ہے۔ حتمی اخراج کے لیے آپریشن سے پہلے 60°C پر نیوکلیز سے پاک پانی کو انکیوبیٹ کریں اور برقرار رکھیں۔ ہر نمونے میں 10 µl Proteinase K اور 3 µl RNase A شامل کریں۔ پھر 100 µl سیل لائسس بفر شامل کریں اور آہستہ سے مکس کریں۔ اس کے بعد نمونوں کو Eppendorf™ ThermoMixer C میں 56°C اور 1400 rpm پر کم از کم 1 گھنٹے اور 3 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ انکیوبیٹڈ نمونوں کو 12,000 RCF پر 3 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا تھا اور ہر نمونے سے سپرنٹنٹ کو ایک علیحدہ 1.5 ملی لیٹر مائکرو سینٹرفیوج ٹیوب میں منتقل کیا گیا تھا جس میں 400 μL بائنڈنگ حل موجود تھا۔ اس کے بعد ٹیوبوں کو 1 سیکنڈ کے وقفوں سے 5-10 سیکنڈ کے لیے پلس بنا دیا گیا۔ ہر نمونے کے پورے مائع مواد (تقریباً 600–700 µL) کو فلٹر کارٹریج میں فلو تھرو کلیکشن ٹیوب میں منتقل کریں۔ ابتدائی ڈی این اے بائنڈنگ کی اجازت دینے کے لیے ٹیوبوں کو 1,000 RCF پر 3 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا اور پھر بقایا مائع کو ہٹانے کے لیے 1 منٹ کے لیے 12,000 RCF پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ نمونے کے کالم کو ایک نئی کلیکشن ٹیوب میں منتقل کیا گیا اور پھر اسے دو بار دھویا گیا۔ پہلے دھونے کے لیے، ہر ٹیوب میں 500 µL واش بفر شامل کریں۔ ٹیوب کو 3-5 بار الٹائیں اور پھر 1 منٹ کے لیے 12,000 RCF پر سینٹری فیوج کریں۔ کلیکشن ٹیوب سے مائع نکال دیں اور فلٹر کارٹریج کو واپس اسی کلیکشن ٹیوب میں رکھیں۔ دوسری دھونے کے لیے، بغیر الٹے فلٹر میں 500 µL واش بفر شامل کریں۔ نمونے 1 منٹ کے لیے 12,000 RCF پر سینٹرفیوج کیے گئے۔ فلٹر کو 1.5 mL LoBind® ٹیوب میں منتقل کریں اور 100 µL پہلے سے گرم نیوکلیز سے پاک پانی شامل کریں۔ فلٹرز کو کمرے کے درجہ حرارت پر 1 منٹ کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا اور پھر 1 منٹ کے لیے 12,000 RCF پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ ایلوٹڈ ڈی این اے کو -80 ° C پر ذخیرہ کیا گیا تھا۔
Qubit™ 4.0 فلورومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے DNA کی حراستی کی مقدار درست کی گئی۔ ڈی این اے کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق Qubit™ 1X dsDNA ہائی حساسیت کٹ (Cat. No. Q33231) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ DNA ٹکڑے کی لمبائی کی تقسیم کو Aglient™ 4150 یا 4200 TapeStation کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ DNA Agilent™ جینومک DNA ریجنٹس (Cat. No. 5067-5366) اور جینومک DNA اسکرین ٹیپ (Cat. No. 5067-5365) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ لائبریری کی تیاری Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) کا استعمال کرتے ہوئے کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق کی گئی۔ DNA کو ONT GridION™ Mk1 سیکوینسر کا استعمال کرتے ہوئے Min106D فلو سیل (R 9.4.1) کے ساتھ ترتیب دیا گیا تھا۔ ترتیب کی ترتیبات یہ تھیں: ہائی ایکوریسی بیس کالنگ، کم از کم q ویلیو 9، بارکوڈ سیٹ اپ، اور بارکوڈ ٹرم۔ نمونے 72 گھنٹے کے لیے ترتیب دیے گئے، جس کے بعد مزید پروسیسنگ اور تجزیہ کے لیے بیس کال ڈیٹا جمع کرایا گیا۔
بائیو انفارمیٹکس پروسیسنگ پہلے بیان کردہ طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے انجام دی گئی تھی (گرین مین ایٹ ال۔، 2024)۔ ترتیب سے حاصل کردہ FASTQ فائلوں کو ہر نمونے کے لیے ڈائریکٹریز میں تقسیم کیا گیا تھا۔ بائیو انفارمیٹکس کے تجزیے سے پہلے، درج ذیل پائپ لائن کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا پر کارروائی کی گئی تھی: پہلے، نمونوں کی FASTQ فائلوں کو ایک واحد FASTQ فائل میں ضم کر دیا گیا تھا۔ اس کے بعد، 1000 bp سے کم ریڈز کو فلٹرانگ v. 0.2.1 کا استعمال کرتے ہوئے فلٹر کیا گیا، صرف پیرامیٹر کو تبدیل کیا گیا -min_length 1000 (Wick, 2024)۔ مزید فلٹرنگ سے پہلے، پڑھنے کے معیار کو نینو پلاٹ v. 1.41.3 کا استعمال کرتے ہوئے درج ذیل پیرامیٹرز کے ساتھ کنٹرول کیا گیا تھا: -fastq -plots dot -N50 -o
درجہ بندی کی درجہ بندی کے لیے، کریکن 2 بمقابلہ 2.1.2 ( Wood et al. پڑھنے اور اسمبلیوں کے لیے بالترتیب رپورٹیں اور آؤٹ پٹ فائلیں بنائیں۔ پڑھنے اور اسمبلیوں کا تجزیہ کرنے کے لیے -use-names کا اختیار استعمال کریں۔ -gzip-compressed اور -paired اختیارات پڑھنے والے حصوں کے لیے مخصوص کیے گئے ہیں۔ میٹاجینوم میں ٹیکسا کی نسبتا کثرت کا اندازہ بریکن v. 2.8 (Lu et al.، 2017) کا استعمال کرتے ہوئے لگایا گیا تھا۔ ہم نے پہلے درج ذیل پیرامیٹرز کے ساتھ بریکن بلڈ کا استعمال کرتے ہوئے 1000 بیسز پر مشتمل ایک کلومیٹر ڈیٹا بیس بنایا: -d
جین تشریح اور رشتہ دار کثرت کا تخمینہ مارنگا ایٹ ال کے ذریعہ بیان کردہ پروٹوکول کے ترمیم شدہ ورژن کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ (مارنگا وغیرہ، 2023)۔ سب سے پہلے، SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al.، 2016) کا استعمال کرتے ہوئے تمام اسمبلیوں سے 500 bp سے چھوٹے کانٹیگز کو ہٹا دیا گیا۔ اس کے بعد منتخب اسمبلیوں کو پین میٹاجینوم میں جوڑ دیا گیا۔ اوپن ریڈنگ فریمز (ORFs) کی شناخت پروڈیگل v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3 کا ایک متوازی ورژن) کا استعمال کرتے ہوئے درج ذیل پیرامیٹرز کے ساتھ کی گئی تھی: -d
جینز کو پہلے کیوٹو انسائیکلوپیڈیا آف جینز اینڈ جینومز (KEGG) آرتھولوج (KO) شناخت کنندگان کے مطابق گروپ کیا گیا تھا جو ایگ این او جی کے ذریعے جین کے راستے کی کثرت کا موازنہ کرنے کے لیے تفویض کیے گئے تھے۔ ناک آؤٹ کے بغیر جین یا ایک سے زیادہ ناک آؤٹ والے جین تجزیہ سے پہلے ہٹا دیے گئے۔ اس کے بعد فی نمونہ ہر KO کی اوسط کثرت کا حساب لگایا گیا اور شماریاتی تجزیہ کیا گیا۔ پی پی اے میٹابولزم جینز کو کسی بھی جین کے طور پر بیان کیا گیا تھا جسے KEGG_Pathway کالم میں ایک قطار ko00640 تفویض کیا گیا تھا، جو KEGG کے مطابق پروپیونیٹ میٹابولزم میں کردار کی نشاندہی کرتا ہے۔ پی پی اے کی پیداوار سے وابستہ جینز کو ضمنی جدول 1 میں درج کیا گیا ہے (ریچارڈٹ ایٹ ال۔، 2014؛ یانگ ایٹ ال۔، 2017)۔ پی پی اے میٹابولزم اور پروڈکشن جین کی شناخت کے لیے پرمیوٹیشن ٹیسٹ کیے گئے جو ہر نمونے کی قسم میں نمایاں طور پر زیادہ پائے جاتے تھے۔ تجزیہ کیے گئے ہر جین کے لیے ایک ہزار تبدیلیاں کی گئیں۔ شماریاتی اہمیت کا تعین کرنے کے لیے 0.05 کی پی ویلیو کو کٹ آف کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ فنکشنل تشریحات کلسٹر کے اندر نمائندہ جینوں کی تشریحات کی بنیاد پر کلسٹر کے اندر انفرادی جینوں کو تفویض کی گئی تھیں۔ پی پی اے میٹابولزم اور/یا پی پی اے پروڈکشن سے وابستہ ٹیکسا کی شناخت کریکن 2 آؤٹ پٹ فائلوں میں کنٹیگ آئی ڈیز کو مماثل کرکے انہی کنٹیگ آئی ڈیز کے ساتھ کی جاسکتی ہے جو ایگ این او جی کا استعمال کرتے ہوئے فنکشنل تشریح کے دوران برقرار رکھی گئی ہیں۔ اہمیت کی جانچ پہلے بیان کردہ Mann-Whitney U ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔ بینجمینی-ہچبرگ طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے متعدد ٹیسٹنگ کے لیے تصحیح کی گئی۔ شماریاتی اہمیت کا تعین کرنے کے لیے ≤ 0.05 کی ایک p-value کو کٹ آف کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔
چوہوں کے گٹ مائکروبیوم کے تنوع کا اندازہ سمپسن ڈائیورسٹی انڈیکس کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ جینس اور پرجاتیوں کے تنوع کے لحاظ سے کنٹرول اور PPA نمونوں کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں دیکھا گیا (جینس کے لیے p-value: 0.18، p-value for species: 0.16) (شکل 1)۔ مائکروبیل کمپوزیشن کا موازنہ پھر پرنسپل کمپوننٹ اینالیسس (PCA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ چترا 2 نمونوں کے جھرمٹ کو ان کے فائیلا کے ذریعہ دکھاتا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ پی پی اے اور کنٹرول کے نمونوں کے درمیان مائکرو بایوم کی پرجاتیوں کی ساخت میں فرق تھا۔ یہ جھرمٹ جینس کی سطح پر کم واضح تھی، جو تجویز کرتی ہے کہ PPA بعض بیکٹیریا کو متاثر کرتا ہے (ضمیمہ تصویر 1)۔
شکل 1. ماؤس گٹ مائکرو بایوم کی جینرا اور پرجاتیوں کی ساخت کا الفا تنوع۔ باکس پلاٹ PPA اور کنٹرول کے نمونوں میں جنیرا (A) اور پرجاتیوں (B) کے سمپسن تنوع کے اشاریے دکھا رہے ہیں۔ اہمیت کا تعین مان-وہٹنی یو ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، اور بینجمینی-ہچبرگ طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے متعدد اصلاح کی گئی تھی۔ ns، p-value اہم نہیں تھی (p>0.05)۔
شکل 2. پرجاتیوں کی سطح پر ماؤس گٹ مائکرو بایوم کمپوزیشن کے پرنسپل اجزاء کے تجزیہ کے نتائج۔ پرنسپل جزو تجزیہ پلاٹ نمونوں کی تقسیم کو ان کے پہلے دو پرنسپل اجزاء میں دکھاتا ہے۔ رنگ نمونے کی قسم کی نشاندہی کرتے ہیں: PPA سے ظاہر ہونے والے چوہے جامنی رنگ کے ہوتے ہیں اور کنٹرول چوہے پیلے ہوتے ہیں۔ پرنسپل اجزاء 1 اور 2 کو بالترتیب x-axis اور y-axis پر پلاٹ کیا گیا ہے، اور ان کا بیان کردہ تغیر تناسب کے طور پر اظہار کیا گیا ہے۔
RLE تبدیل شدہ شمار کے اعداد و شمار کا استعمال کرتے ہوئے، کنٹرول اور PPA چوہوں (کنٹرول: 9.66، PPA: 3.02؛ p-value = 0.0011) میں میڈین بیکٹیرائڈائٹس/بیسیلی تناسب میں نمایاں کمی دیکھی گئی۔ یہ فرق کنٹرول کے مقابلے پی پی اے چوہوں میں بیکٹیرائڈائٹس کی زیادہ کثرت کی وجہ سے تھا، حالانکہ فرق اہم نہیں تھا (کنٹرول کا مطلب CLR: 5.51، PPA کا مطلب CLR: 6.62؛ p-value = 0.054)، جبکہ Bacteroidetes کی کثرت اسی طرح کی تھی (کنٹرول کا مطلب CLR: P-7.6، p-70؛ 7.6 کا مطلب ہے۔ 0.18)۔
گٹ مائکرو بایوم کے ٹیکونومک ممبروں کی کثرت کے تجزیے سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ 1 فیلم اور 77 انواع پی پی اے اور کنٹرول کے نمونوں کے درمیان نمایاں طور پر مختلف ہیں (ضمنی جدول 2)۔ پی پی اے کے نمونوں میں 59 پرجاتیوں کی کثرت کنٹرول کے نمونوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھی، جبکہ کنٹرول کے نمونوں میں صرف 16 پرجاتیوں کی کثرت پی پی اے کے نمونوں سے زیادہ تھی (شکل 3)۔
شکل 3. پی پی اے اور کنٹرول چوہوں کے گٹ مائکرو بایوم میں ٹیکس کی کثرت۔ آتش فشاں پلاٹ پی پی اے اور کنٹرول کے نمونوں کے درمیان جنیرا (A) یا پرجاتیوں (B) کی کثرت میں فرق ظاہر کرتے ہیں۔ بھوری رنگ کے نقطے ٹیکس کی کثرت میں کوئی خاص فرق نہیں بتاتے ہیں۔ رنگین نقطے کثرت میں نمایاں فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (p-value ≤ 0.05)۔ نمونے کی اقسام کے درمیان کثرت میں سب سے بڑے فرق کے ساتھ ٹاپ 20 ٹیکسا بالترتیب سرخ اور ہلکے نیلے (کنٹرول اور پی پی اے نمونے) میں دکھائے گئے ہیں۔ پیلے اور جامنی رنگ کے نقطے کنٹرول کے مقابلے میں کنٹرول یا پی پی اے کے نمونوں میں کم از کم 2.7 گنا زیادہ تھے۔ سیاہ نقطے نمایاں طور پر مختلف کثرت کے ساتھ ٹیکسا کی نمائندگی کرتے ہیں، جس میں -1 اور 1 کے درمیان CLR فرق ہوتا ہے۔ P قدروں کا حساب Mann-Whitney U ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور بینجمینی-Hochberg طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے متعدد جانچ کے لیے درست کیا گیا تھا۔ بولڈ مطلب CLR فرق کثرت میں نمایاں فرق کی نشاندہی کرتا ہے۔
گٹ مائکروبیل کمپوزیشن کا تجزیہ کرنے کے بعد، ہم نے مائکروبیوم کی ایک فنکشنل تشریح کی۔ کم معیار کے جین کو فلٹر کرنے کے بعد، تمام نمونوں میں کل 378,355 منفرد جینوں کی شناخت کی گئی۔ ان جینوں کی تبدیل شدہ کثرت کو پرنسپل جزو تجزیہ (PCA) کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور نتائج نے ان کے فنکشنل پروفائلز (شکل 4) کی بنیاد پر نمونے کی اقسام کے جھرمٹ کی اعلیٰ ڈگری کو ظاہر کیا۔
پی سی اے کے نتائج ماؤس گٹ مائکرو بایوم کے فنکشنل پروفائل کا استعمال کرتے ہوئے۔ PCA پلاٹ نمونوں کی تقسیم کو ان کے پہلے دو بنیادی اجزاء میں دکھاتا ہے۔ رنگ نمونے کی قسم کی نشاندہی کرتے ہیں: PPA سے ظاہر ہونے والے چوہے جامنی رنگ کے ہوتے ہیں اور کنٹرول چوہے پیلے ہوتے ہیں۔ پرنسپل اجزاء 1 اور 2 کو بالترتیب x-axis اور y-axis پر پلاٹ کیا گیا ہے، اور ان کا بیان کردہ تغیر تناسب کے طور پر اظہار کیا گیا ہے۔
اس کے بعد ہم نے مختلف نمونوں کی اقسام میں KEGG ناک آؤٹ کی کثرت کا جائزہ لیا۔ مجموعی طور پر 3648 منفرد ناک آؤٹ کی نشاندہی کی گئی، جن میں سے 196 کنٹرول کے نمونوں میں نمایاں طور پر زیادہ پائے گئے اور 106 PPA نمونوں میں زیادہ پائے گئے (شکل 5)۔ کنٹرول کے نمونوں میں مجموعی طور پر 145 جینز اور PPA کے نمونوں میں 61 جینز کا پتہ چلا جن میں نمایاں طور پر مختلف کثرت ہے۔ پی پی اے کے نمونے (ضمنی جدول 3) میں لپڈ اور امینو شوگر میٹابولزم سے متعلق راستے نمایاں طور پر زیادہ افزودہ تھے۔ نائٹروجن میٹابولزم اور سلفر ریلے سسٹم سے متعلق راستے کنٹرول کے نمونوں میں نمایاں طور پر زیادہ افزودہ تھے (ضمنی جدول 3)۔ امینو شوگر/نیوکلیوٹائڈ میٹابولزم (ko:K21279) اور inositol فاسفیٹ میٹابولزم (ko:K07291) سے متعلق جینوں کی کثرت PPA نمونوں میں نمایاں طور پر زیادہ تھی (شکل 5)۔ کنٹرول کے نمونوں میں بینزویٹ میٹابولزم (ko:K22270)، نائٹروجن میٹابولزم (ko:K00368)، اور glycolysis/gluconeogenesis (ko:K00131) (شکل 5) سے متعلق نمایاں طور پر زیادہ جین تھے۔
تصویر 5. PPA اور کنٹرول چوہوں کے گٹ مائکرو بایوم میں KOs کی مختلف کثرت۔ آتش فشاں پلاٹ فنکشنل گروپس (KOs) کی کثرت میں فرق کو ظاہر کرتا ہے۔ سرمئی نقطے KOs کی نشاندہی کرتے ہیں جن کی کثرت نمونے کی اقسام (p-value> 0.05) کے درمیان نمایاں طور پر مختلف نہیں تھی۔ رنگین نقطے کثرت میں نمایاں فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (p-value ≤ 0.05)۔ نمونے کی اقسام کے درمیان کثرت میں سب سے بڑے فرق کے ساتھ 20 KOs کو بالترتیب کنٹرول اور PPA نمونوں کے مطابق سرخ اور ہلکے نیلے رنگ میں دکھایا گیا ہے۔ پیلے اور جامنی رنگ کے نقطے KOs کی نشاندہی کرتے ہیں جو بالترتیب کنٹرول اور PPA نمونوں میں کم از کم 2.7 گنا زیادہ پرچر تھے۔ سیاہ نقطے نمایاں طور پر مختلف کثرت کے ساتھ KOs کی نشاندہی کرتے ہیں، جس میں -1 اور 1 کے درمیان CLR فرق ہوتا ہے۔ P قدروں کا حساب Mann-Whitney U ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور بینجمینی-Hochberg طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے متعدد موازنہ کے لیے ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ NaN اشارہ کرتا ہے کہ KO کا تعلق KEGG میں راستے سے نہیں ہے۔ بولڈ مطلب CLR فرق کی قدریں کثرت میں نمایاں فرق کی نشاندہی کرتی ہیں۔ ان راستوں کے بارے میں تفصیلی معلومات کے لیے جن سے درج KO کا تعلق ہے، ضمنی جدول 3 دیکھیں۔
تشریح شدہ جینوں میں، 1601 جین نمونے کی اقسام (p ≤ 0.05) کے درمیان نمایاں طور پر مختلف کثرت رکھتے تھے، جس میں ہر ایک جین کم از کم 2.7 گنا زیادہ ہوتا ہے۔ ان جینوں میں سے 4 جینز کنٹرول کے نمونوں میں زیادہ پائے گئے اور 1597 جینز PPA کے نمونوں میں زیادہ پائے گئے۔ چونکہ پی پی اے میں اینٹی مائکروبیل خصوصیات ہیں، ہم نے نمونے کی اقسام کے درمیان پی پی اے میٹابولزم اور پروڈکشن جین کی کثرت کی جانچ کی۔ 1332 پی پی اے میٹابولزم سے متعلق جینوں میں سے، کنٹرول کے نمونوں میں 27 جین نمایاں طور پر زیادہ پائے گئے اور پی پی اے کے نمونوں میں 12 جین زیادہ پائے گئے۔ پی پی اے کی پیداوار سے متعلق 223 جینوں میں سے، 1 جین پی پی اے کے نمونوں میں نمایاں طور پر زیادہ پرچر تھا۔ شکل 6A مزید PPA میٹابولزم میں شامل جینوں کی زیادہ کثرت کو ظاہر کرتا ہے، جس میں کنٹرول کے نمونوں اور بڑے اثر کے سائز میں نمایاں طور پر زیادہ کثرت ہوتی ہے، جبکہ شکل 6B انفرادی جینوں کو نمایاں کرتا ہے جس میں PPA نمونوں میں نمایاں طور پر زیادہ کثرت کا مشاہدہ کیا جاتا ہے۔
تصویر 6. ماؤس گٹ مائکرو بایوم میں پی پی اے سے متعلق جینز کی فرق کی کثرت۔ آتش فشاں پلاٹ PPA میٹابولزم (A) اور PPA پیداوار (B) سے وابستہ جینوں کی کثرت میں فرق کو ظاہر کرتے ہیں۔ سرمئی نقطے ایسے جین کی نشاندہی کرتے ہیں جن کی کثرت نمونے کی اقسام (p-value> 0.05) کے درمیان نمایاں طور پر مختلف نہیں تھی۔ رنگین نقطے کثرت میں نمایاں فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (p-value ≤ 0.05)۔ کثرت میں سب سے بڑے فرق کے ساتھ 20 جین بالترتیب سرخ اور ہلکے نیلے (کنٹرول اور پی پی اے نمونے) میں دکھائے گئے ہیں۔ پیلے اور جامنی رنگ کے نقطوں کی کثرت کنٹرول کے نمونوں کے مقابلے میں کنٹرول اور پی پی اے کے نمونوں میں کم از کم 2.7 گنا زیادہ تھی۔ سیاہ نقطے نمایاں طور پر مختلف کثرت کے ساتھ جینز کی نمائندگی کرتے ہیں، جس میں -1 اور 1 کے درمیان CLR فرق ہوتا ہے۔ Man-Whitney U ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے P اقدار کا حساب لگایا گیا اور بینجمینی-ہچبرگ طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے متعدد موازنہ کے لیے درست کیا گیا۔ جین غیر فالتو جین کیٹلاگ میں نمائندہ جینوں سے مطابقت رکھتے ہیں۔ جین کے نام KEGG علامت پر مشتمل ہوتے ہیں جو KO جین کو ظاہر کرتا ہے۔ بولڈ مطلب CLR فرق نمایاں طور پر مختلف کثرت کی نشاندہی کرتا ہے۔ ایک ڈیش (-) اشارہ کرتا ہے کہ KEGG ڈیٹا بیس میں جین کے لیے کوئی علامت نہیں ہے۔
پی پی اے میٹابولزم اور/یا پروڈکشن سے متعلق جین کے ساتھ ٹیکسا کی شناخت کونٹیگس کی ٹیکنومک شناخت کو جین کی کونٹیگ ID کے ساتھ ملا کر کی گئی تھی۔ جینس کی سطح پر، 130 نسلوں میں پی پی اے میٹابولزم سے متعلق جینز پائے گئے اور 61 نسلوں میں پی پی اے کی پیداوار سے متعلق جین پائے گئے (ضمنی جدول 4)۔ تاہم، کسی بھی نسل نے کثرت میں نمایاں فرق نہیں دکھایا (p > 0.05)۔
پرجاتیوں کی سطح پر، 144 بیکٹیریل پرجاتیوں میں پی پی اے میٹابولزم سے وابستہ جین پائے گئے اور 68 بیکٹیریل پرجاتیوں میں پی پی اے کی پیداوار سے وابستہ جین پائے گئے (ضمنی جدول 5)۔ پی پی اے میٹابولائزرز میں، آٹھ بیکٹیریا نے نمونے کی اقسام کے درمیان کثرت میں نمایاں اضافہ دکھایا، اور سبھی نے اثر میں نمایاں تبدیلیاں ظاہر کیں (ضمنی جدول 6)۔ کثرت میں نمایاں فرق کے ساتھ تمام شناخت شدہ پی پی اے میٹابولائزر پی پی اے کے نمونوں میں زیادہ پرچر تھے۔ پرجاتیوں کی سطح کی درجہ بندی نے جنیرا کے نمائندوں کا انکشاف کیا جو نمونے کی اقسام کے درمیان نمایاں طور پر مختلف نہیں تھے، جن میں کئی بیکٹیرائڈز اور رومینوکوکس پرجاتیوں کے ساتھ ساتھ ڈنکانیا ڈوبوئس، مائکسوبیکٹیریم انٹریکا، مونوکوکس پیکٹینولوٹیکس، اور الکلیجینس پولیمورفا شامل ہیں۔ پی پی اے پیدا کرنے والے بیکٹیریا میں، چار بیکٹیریا نے نمونے کی اقسام کے درمیان کثرت میں نمایاں فرق ظاہر کیا۔ کثرت میں نمایاں فرق والی انواع میں بیکٹیرائڈز نووروسی، ڈنکانیا ڈوبوئس، مائکسوبیکٹیریم انٹریٹیڈس، اور رومینوکوکس بووس شامل ہیں۔
اس مطالعے میں، ہم نے چوہوں کے گٹ مائکرو بائیوٹا پر پی پی اے کی نمائش کے اثرات کا جائزہ لیا۔ پی پی اے بیکٹیریا میں مختلف ردعمل کو ظاہر کر سکتا ہے کیونکہ یہ بعض پرجاتیوں کے ذریعہ تیار کیا جاتا ہے، دوسری پرجاتیوں کے ذریعہ کھانے کے ذریعہ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، یا اینٹی مائکروبیل اثرات ہوتے ہیں۔ لہٰذا، غذائی ضمیمہ کے ذریعے گٹ کے ماحول میں اس کا اضافہ برداشت، حساسیت، اور اسے غذائیت کے ذریعہ استعمال کرنے کی صلاحیت کے لحاظ سے مختلف اثرات مرتب کرسکتا ہے۔ حساس بیکٹیریل انواع کو ختم کیا جا سکتا ہے اور ان کی جگہ ان لوگوں کو لے جایا جا سکتا ہے جو PPA کے خلاف زیادہ مزاحم ہیں یا اسے کھانے کے ذریعہ کے طور پر استعمال کرنے کے قابل ہیں، جس کے نتیجے میں گٹ مائکرو بائیوٹا کی ساخت میں تبدیلی آتی ہے۔ ہمارے نتائج نے مائکروبیل کمپوزیشن میں نمایاں فرق ظاہر کیا لیکن مجموعی طور پر مائکروبیل تنوع پر کوئی اثر نہیں ہوا۔ سب سے زیادہ اثرات انواع کی سطح پر دیکھے گئے، جس میں PPA اور کنٹرول کے نمونوں کے درمیان 70 سے زیادہ ٹیکس نمایاں طور پر مختلف ہیں (ضمنی جدول 2)۔ پی پی اے کے بے نقاب نمونوں کی تشکیل کے مزید جائزہ سے غیر ظاہر شدہ نمونوں کے مقابلے میں مائکروبیل پرجاتیوں کی زیادہ متفاوتیت کا پتہ چلتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ پی پی اے بیکٹیریا کی نشوونما کی خصوصیات کو بڑھا سکتا ہے اور بیکٹیریا کی آبادی کو محدود کر سکتا ہے جو پی پی اے سے بھرپور ماحول میں زندہ رہ سکتے ہیں۔ اس طرح، پی پی اے گٹ مائکرو بائیوٹا کے تنوع میں بڑے پیمانے پر رکاوٹ پیدا کرنے کے بجائے انتخابی طور پر تبدیلیاں لا سکتا ہے۔
فوڈ پریزرویٹوز جیسے کہ پی پی اے پہلے بھی مجموعی تنوع کو متاثر کیے بغیر گٹ مائکرو بایوم اجزاء کی کثرت کو تبدیل کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے (ناگپال ایٹ ال۔، 2021)۔ یہاں، ہم نے Bacteroidetes پرجاتیوں کے درمیان phylum Bacteroidetes (پہلے Bacteroidetes کے نام سے جانا جاتا تھا) کے درمیان سب سے نمایاں فرق دیکھا، جو PPA سے بے نقاب چوہوں میں نمایاں طور پر افزودہ تھے۔ بیکٹیرائڈز کی پرجاتیوں کی کثرت بلغم کے بڑھتے ہوئے انحطاط سے منسلک ہے، جو انفیکشن کے خطرے کو بڑھا سکتی ہے اور سوزش کو بڑھا سکتی ہے (کارنک ایٹ ال۔، 2015؛ ڈیسائی ایٹ ال۔، 2016؛ پینزول ایٹ ال۔ ایک تحقیق سے پتا چلا ہے کہ Bacteroides fragilis کے ساتھ علاج کیے جانے والے نوزائیدہ نر چوہوں نے آٹزم اسپیکٹرم ڈس آرڈر (ASD) (Carmel et al.، 2023) کی یاد دلانے والے سماجی رویوں کی نمائش کی، اور دیگر مطالعات سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ بیکٹیرائڈز کی نسلیں مدافعتی سرگرمی کو تبدیل کر سکتی ہیں اور آٹو امیون انفلامیٹری کارڈیو 2023 کی طرف لے جاتی ہیں۔ جنرا رومینوکوکس، پریوٹیلا، اور پیرا بیکٹیرائڈز سے تعلق رکھنے والی انواع بھی پی پی اے (کورٹی ایٹ ال۔، 2018) کے سامنے آنے والے چوہوں میں نمایاں طور پر بڑھی تھیں۔ بعض رومینوکوکس پرجاتیوں کا تعلق پروانفلامیٹری سائٹوکائنز (Henke et al., 2019) کی پیداوار کے ذریعے Crohn's disease جیسی بیماریوں سے ہوتا ہے، جبکہ Prevotella ہیومنی جیسی Prevotella کی نسلیں میٹابولک امراض جیسے ہائی بلڈ پریشر اور انسولین کی حساسیت سے وابستہ ہیں آخر میں، ہم نے پایا کہ بیکٹیرائڈائٹس (پہلے فرمکیوٹ کے نام سے جانا جاتا تھا) کا بیکٹیرائڈائٹس کا تناسب پی پی اے سے بے نقاب چوہوں میں کنٹرول چوہوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم تھا کیونکہ بیکٹیرائڈائٹس پرجاتیوں کی کثرت کی وجہ سے۔ اس تناسب کو پہلے آنتوں کے ہومیوسٹاسس کا ایک اہم اشارے کے طور پر دکھایا گیا ہے، اور اس تناسب میں خلل مختلف بیماریوں کی حالتوں سے وابستہ رہا ہے (ٹرپین ایٹ ال۔ اجتماعی طور پر، فیلم بیکٹیرائڈائٹس کی انواع بلند غذائی پی پی اے سے سب سے زیادہ متاثر ہوتی ہیں۔ اس کی وجہ پی پی اے کے لیے زیادہ رواداری یا پی پی اے کو توانائی کے منبع کے طور پر استعمال کرنے کی صلاحیت کی وجہ سے ہو سکتا ہے، جو کم از کم ایک پرجاتی، ہولیسیلا اینوسیا (ہچ ایٹ ال۔، 2022) کے لیے درست ثابت ہوا ہے۔ متبادل طور پر، زچگی کے پی پی اے کی نمائش سے جنین کی نشوونما میں اضافہ ہو سکتا ہے ماؤس کی اولاد کے آنتوں کو بیکٹیرائڈائٹس کالونائزیشن کے لیے زیادہ حساس بنا کر۔ تاہم، ہمارے مطالعہ کے ڈیزائن نے ایسی تشخیص کی اجازت نہیں دی۔
میٹاجینومک مواد کی تشخیص نے پی پی اے میٹابولزم اور پیداوار سے وابستہ جینوں کی کثرت میں نمایاں فرق کا انکشاف کیا، پی پی اے سے بے نقاب چوہوں نے پی پی اے کی پیداوار کے لیے ذمہ دار جینوں کی زیادہ کثرت کی نمائش کی، جب کہ غیر پی پی اے سے بے نقاب چوہوں نے پی اے اے میٹابولزم (Figure6) کے لیے ذمہ دار جینوں کی کثرت کی نمائش کی۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ مائکروبیل کمپوزیشن پر پی پی اے کا اثر صرف اس کے استعمال کی وجہ سے نہیں ہوسکتا ہے، بصورت دیگر پی پی اے میٹابولزم سے وابستہ جینوں کی کثرت کو پی پی اے سے بے نقاب چوہوں کے گٹ مائکروبیوم میں زیادہ کثرت دکھانی چاہئے تھی۔ ایک وضاحت یہ ہے کہ PPA بیکٹیریا کی کثرت میں ثالثی کرتا ہے بنیادی طور پر اس کے antimicrobial اثرات کے ذریعے بیکٹریا کے ذریعہ بطور غذائیت کے استعمال کے ذریعے۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ پی پی اے خوراک پر منحصر انداز میں سالمونیلا ٹائفیموریم کی نشوونما کو روکتا ہے (جیکبسن ایٹ ال۔، 2018)۔ پی پی اے کے زیادہ ارتکاز کی نمائش سے ایسے بیکٹیریا کا انتخاب کیا جا سکتا ہے جو اس کی جراثیم کش خصوصیات کے خلاف مزاحم ہیں اور ضروری طور پر اسے میٹابولائز یا پیدا کرنے کے قابل نہیں ہوسکتے ہیں۔ مثال کے طور پر، پی پی اے کے نمونوں میں متعدد پیرا بیکٹیرائڈز کی پرجاتیوں نے نمایاں طور پر زیادہ کثرت ظاہر کی، لیکن پی پی اے میٹابولزم یا پیداوار سے متعلق کسی جین کا پتہ نہیں چل سکا (ضمنی میزیں 2، 4، اور 5)۔ مزید برآں، پی پی اے کی پیداوار ایک ابال کے ضمنی پروڈکٹ کے طور پر مختلف بیکٹیریا کے درمیان وسیع پیمانے پر تقسیم کی جاتی ہے (Gonzalez-Garcia et al.، 2017)۔ زیادہ بیکٹیریل تنوع کنٹرول کے نمونوں میں پی پی اے میٹابولزم سے متعلق جینوں کی زیادہ کثرت کی وجہ ہو سکتا ہے (ایورینا ایٹ ال۔، 2020)۔ مزید برآں، 1332 جینوں میں سے صرف 27 (2.14%) کی پیش گوئی کی گئی تھی کہ وہ خصوصی طور پر پی پی اے میٹابولزم سے وابستہ ہیں۔ پی پی اے میٹابولزم سے وابستہ بہت سے جین دوسرے میٹابولک راستوں میں بھی شامل ہیں۔ یہ مزید ظاہر کرتا ہے کہ پی پی اے میٹابولزم میں شامل جینز کی کثرت کنٹرول کے نمونوں میں زیادہ تھی۔ یہ جین ان راستوں میں کام کر سکتے ہیں جن کے نتیجے میں PPA کے استعمال یا ایک ضمنی پروڈکٹ کی تشکیل نہیں ہوتی ہے۔ اس معاملے میں، پی پی اے نسل سے وابستہ صرف ایک جین نے نمونے کی اقسام کے درمیان کثرت میں نمایاں فرق ظاہر کیا۔ پی پی اے میٹابولزم سے وابستہ جینوں کے برعکس، پی پی اے کی پیداوار کے لیے مارکر جین منتخب کیے گئے تھے کیونکہ وہ پی پی اے کی پیداوار کے لیے بیکٹیریل راستے میں براہ راست شامل ہیں۔ پی پی اے سے بے نقاب چوہوں میں، تمام پرجاتیوں میں پی پی اے پیدا کرنے کی کثرت اور صلاحیت میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ یہ اس پیشین گوئی کی تائید کرتا ہے کہ پی پی اے پی پی اے پروڈیوسروں کا انتخاب کریں گے اور اس وجہ سے پی پی اے کی پیداواری صلاحیت میں اضافہ ہوگا۔ تاہم، ضروری نہیں کہ جین کی کثرت جین کے اظہار کے ساتھ تعلق رکھتی ہو۔ اس طرح، اگرچہ PPA میٹابولزم سے وابستہ جینوں کی کثرت کنٹرول کے نمونوں میں زیادہ ہے، لیکن اظہار کی شرح مختلف ہو سکتی ہے (Shi et al.، 2014)۔ پی پی اے پیدا کرنے والے جین اور پی پی اے کی پیداوار کے پھیلاؤ کے درمیان تعلق کی تصدیق کرنے کے لیے، پی پی اے کی پیداوار میں شامل جینوں کے اظہار کے مطالعے کی ضرورت ہے۔
پی پی اے اور کنٹرول میٹجینوم کی فنکشنل تشریح سے کچھ اختلافات سامنے آئے۔ جین کے مواد کے PCA تجزیہ سے PPA اور کنٹرول کے نمونوں کے درمیان مجرد کلسٹرز کا انکشاف ہوا (شکل 5)۔ نمونے کے اندر اندر کلسٹرنگ نے انکشاف کیا کہ کنٹرول جین کا مواد زیادہ متنوع تھا، جبکہ پی پی اے کے نمونے ایک ساتھ کلسٹر ہوتے ہیں۔ جین کے مواد کے ذریعہ کلسٹرنگ کا موازنہ پرجاتیوں کی ساخت کے ذریعہ کلسٹرنگ سے کیا جاسکتا ہے۔ اس طرح، راستے کی کثرت میں فرق ان کے اندر مخصوص پرجاتیوں اور تناؤ کی کثرت میں تبدیلیوں کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔ پی پی اے کے نمونوں میں، نمایاں طور پر زیادہ کثرت کے ساتھ دو راستے امینو شوگر/نیوکلیوٹائڈ شوگر میٹابولزم (ko: K21279) اور ایک سے زیادہ لپڈ میٹابولزم کے راستے (ko: K00647، ko: K03801؛ ضمنی جدول 3) سے متعلق تھے۔ ko:K21279 کے ساتھ منسلک جینس بیکٹیرائڈز کے ساتھ منسلک ہونے کے لئے جانا جاتا ہے، پی پی اے کے نمونوں میں پرجاتیوں کی نمایاں طور پر زیادہ تعداد کے ساتھ نسل میں سے ایک۔ یہ انزائم کیپسولر پولی سیکرائڈز (وانگ ایٹ ال۔، 2008) کا اظہار کرکے مدافعتی ردعمل سے بچ سکتا ہے۔ یہ پی پی اے کے بے نقاب چوہوں میں مشاہدہ کردہ بیکٹیرائڈائٹس میں اضافے کا سبب بن سکتا ہے۔ یہ پی پی اے مائکرو بایوم میں مشاہدہ شدہ فیٹی ایسڈ کی بڑھتی ہوئی ترکیب کو پورا کرتا ہے۔ بیکٹیریا فیٹی ایسڈ تیار کرنے کے لیے FASIIko:K00647 (fabB) راستے کا استعمال کرتے ہیں، جو میزبان میٹابولک راستوں کو متاثر کر سکتا ہے (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020)، اور لپڈ میٹابولزم میں تبدیلیاں نیورو ڈیولپمنٹ میں کردار ادا کر سکتی ہیں۔ پی پی اے کے نمونوں میں کثرت کو ظاہر کرنے والا ایک اور راستہ سٹیرایڈ ہارمون بائیو سنتھیسس (ko: K12343) تھا۔ اس بات کے بڑھتے ہوئے ثبوت ہیں کہ گٹ مائیکرو بائیوٹا کی ہارمون کی سطح پر اثر انداز ہونے اور ہارمونز سے متاثر ہونے کی صلاحیت کے درمیان الٹا تعلق ہے، اس طرح کہ سٹیرایڈ کی سطح بلند ہونے سے صحت پر منفی اثرات مرتب ہو سکتے ہیں (Tetel et al., 2018)۔
یہ مطالعہ حدود اور تحفظات کے بغیر نہیں ہے۔ ایک اہم امتیاز یہ ہے کہ ہم نے جانوروں کی جسمانی تشخیص نہیں کی۔ لہذا، یہ براہ راست نتیجہ اخذ کرنا ممکن نہیں ہے کہ آیا مائکرو بایوم میں تبدیلیاں کسی بیماری سے وابستہ ہیں۔ ایک اور غور یہ ہے کہ اس تحقیق میں چوہوں کو ان کی ماؤں جیسی خوراک دی گئی تھی۔ مستقبل کے مطالعے اس بات کا تعین کر سکتے ہیں کہ آیا پی پی اے سے بھرپور غذا سے پی پی اے سے پاک غذا میں تبدیل ہونا مائکرو بایوم پر اس کے اثرات کو بہتر بناتا ہے۔ ہمارے مطالعے کی ایک حد، بہت سے دوسرے لوگوں کی طرح، نمونے کا محدود سائز ہے۔ اگرچہ درست نتائج اخذ کیے جا سکتے ہیں، لیکن نتائج کا تجزیہ کرتے وقت نمونے کا بڑا سائز زیادہ شماریاتی طاقت فراہم کرے گا۔ ہم گٹ مائکرو بایوم میں تبدیلیوں اور کسی بھی بیماری کے درمیان ایسوسی ایشن کے بارے میں نتیجہ اخذ کرنے کے بارے میں بھی محتاط ہیں (Yap et al., 2021)۔ الجھنے والے عوامل بشمول عمر، جنس اور خوراک مائکروجنزموں کی ساخت کو نمایاں طور پر متاثر کر سکتے ہیں۔ یہ عوامل پیچیدہ بیماریوں کے ساتھ گٹ مائکرو بایوم کی وابستگی کے بارے میں ادب میں مشاہدہ کی جانے والی تضادات کی وضاحت کر سکتے ہیں (جانسن ایٹ ال۔ مثال کے طور پر، ASD والے جانوروں اور انسانوں میں Bacteroidetes جینس کے ارکان کو یا تو بڑھا یا گھٹا ہوا دکھایا گیا ہے (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017)۔ اسی طرح، آنتوں کی سوزش کی بیماریوں والے مریضوں میں گٹ کی ساخت کے مطالعے سے ایک ہی ٹیکس میں اضافہ اور کمی دونوں پائے گئے ہیں (والٹرز ایٹ ال۔، 2014؛ فوربس ایٹ ال۔، 2018؛ اپادھیائے ایٹ ال۔، 2023)۔ صنفی تعصب کے اثرات کو محدود کرنے کے لیے، ہم نے جنسوں کی مساوی نمائندگی کو یقینی بنانے کی کوشش کی تاکہ اختلافات زیادہ تر ممکنہ طور پر خوراک کے ذریعے پیدا ہوں۔ فنکشنل تشریح کا ایک چیلنج فالتو جین کی ترتیب کو ہٹانا ہے۔ ہمارے جین کلسٹرنگ کے طریقہ کار میں 95% تسلسل کی شناخت اور 85% لمبائی کی مماثلت کے ساتھ ساتھ جھوٹے جھرمٹ کو ختم کرنے کے لیے 90% سیدھ کی کوریج کی ضرورت ہوتی ہے۔ تاہم، بعض صورتوں میں، ہم نے ایک ہی تشریحات کے ساتھ COGs کا مشاہدہ کیا (مثال کے طور پر، MUT) (تصویر 6)۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے کہ آیا یہ آرتھولوگ الگ ہیں، مخصوص نسل سے وابستہ ہیں، یا یہ جین کلسٹرنگ اپروچ کی ایک حد ہے۔ فنکشنل تشریح کی ایک اور حد ممکنہ غلط درجہ بندی ہے۔ بیکٹیریل جین ایم ایم ڈی اے ایک معروف انزائم ہے جو پروپیونیٹ ترکیب میں شامل ہے، لیکن کے ای جی جی اسے پروپیونیٹ میٹابولک پاتھ وے سے منسلک نہیں کرتا ہے۔ اس کے برعکس، scpB اور mmcD آرتھولوگس کا تعلق ہے۔ نامزد ناک آؤٹ کے بغیر جینوں کی بڑی تعداد جین کی کثرت کا اندازہ کرتے وقت پی پی اے سے متعلقہ جینوں کی شناخت کرنے میں ناکامی کا باعث بن سکتی ہے۔ مستقبل کے مطالعے کو میٹا ٹرانسکرپٹوم تجزیہ سے فائدہ ہوگا، جو گٹ مائکرو بائیوٹا کی فعال خصوصیات کی گہری تفہیم فراہم کرسکتا ہے اور جین کے اظہار کو ممکنہ بہاو اثرات سے جوڑ سکتا ہے۔ مخصوص نیورو ڈیولپمنٹل عوارض یا آنتوں کی سوزش کی بیماریوں میں شامل مطالعات کے لیے، مائیکرو بایوم کی ساخت میں ہونے والی تبدیلیوں کو ان عوارض سے جوڑنے کے لیے جانوروں کے جسمانی اور طرز عمل کے جائزوں کی ضرورت ہوتی ہے۔ گٹ مائکرو بایوم کو جراثیم سے پاک چوہوں میں ٹرانسپلانٹ کرنے کے اضافی مطالعات بھی اس بات کا تعین کرنے کے لئے مفید ہوں گے کہ آیا مائکرو بایوم ایک ڈرائیور ہے یا بیماری کی خصوصیت۔
خلاصہ طور پر، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ غذائی پی پی اے گٹ مائکرو بائیوٹا کی ساخت کو تبدیل کرنے میں ایک عنصر کے طور پر کام کرتا ہے۔ پی پی اے ایک ایف ڈی اے سے منظور شدہ پرزرویٹیو ہے جو وسیع پیمانے پر مختلف کھانوں میں پایا جاتا ہے جو طویل مدتی نمائش پر، عام آنتوں کے پودوں میں خلل کا باعث بن سکتا ہے۔ ہمیں کئی بیکٹیریا کی کثرت میں تبدیلیاں ملی ہیں، جو تجویز کرتے ہیں کہ پی پی اے گٹ مائکرو بائیوٹا کی ساخت کو متاثر کر سکتا ہے۔ مائیکرو بائیوٹا میں تبدیلیاں بعض میٹابولک راستوں کی سطح میں تبدیلیوں کا باعث بن سکتی ہیں، جس سے جسمانی تبدیلیاں ہو سکتی ہیں جو میزبان صحت سے متعلق ہیں۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے کہ آیا مائکروبیل کمپوزیشن پر غذائی پی پی اے کے اثرات dysbiosis یا دیگر بیماریوں کا باعث بن سکتے ہیں۔ یہ مطالعہ مستقبل کے مطالعے کی بنیاد رکھتا ہے کہ کس طرح آنتوں کی ساخت پر پی پی اے کے اثرات انسانی صحت کو متاثر کر سکتے ہیں۔
اس مطالعہ میں پیش کردہ ڈیٹاسیٹس آن لائن ذخیروں میں دستیاب ہیں۔ مخزن کا نام اور الحاق نمبر یہ ہیں: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431۔
جانوروں کے اس مطالعے کی منظوری یونیورسٹی آف سینٹرل فلوریڈا انسٹیٹیوشنل اینیمل کیئر اینڈ یوز کمیٹی (UCF-IACUC) (جانوروں کے استعمال کی اجازت نمبر: PROTO202000002) نے دی تھی۔ یہ مطالعہ مقامی قوانین، ضوابط اور ادارہ جاتی تقاضوں کی تعمیل کرتا ہے۔
NG: تصوراتی، ڈیٹا کیوریشن، رسمی تجزیہ، تفتیش، طریقہ کار، سافٹ ویئر، تصور، تحریر (اصل مسودہ)، تحریر (جائزہ اور ترمیم)۔ LA: تصور، ڈیٹا کیوریشن، طریقہ کار، وسائل، تحریر (جائزہ اور ترمیم)۔ SH: رسمی تجزیہ، سافٹ ویئر، تحریر (جائزہ اور ترمیم)۔ SA: تحقیقات، تحریر (جائزہ اور ترمیم)۔ چیف جج: تحقیقات، تحریر (جائزہ اور ترمیم)۔ SN: تصور، پروجیکٹ انتظامیہ، وسائل، نگرانی، تحریر (جائزہ اور ترمیم)۔ TA: تصور سازی، پروجیکٹ انتظامیہ، نگرانی، تحریر (جائزہ اور ترمیم)۔
مصنفین نے اعلان کیا کہ انہیں اس مضمون کی تحقیق، تصنیف، اور/یا اشاعت کے لیے کوئی مالی امداد نہیں ملی۔
مصنفین کا اعلان ہے کہ یہ تحقیق کسی تجارتی یا مالی تعلقات کی عدم موجودگی میں کی گئی تھی جسے مفادات کے ممکنہ تصادم کے طور پر سمجھا جا سکتا ہے۔ قابل اطلاق نہیں
اس مضمون میں بیان کردہ تمام آراء صرف مصنفین کی ہیں اور ضروری نہیں کہ ان کے اداروں، پبلشرز، ایڈیٹرز یا جائزہ لینے والوں کے خیالات کی عکاسی کریں۔ اس مضمون میں جانچے گئے کسی بھی پروڈکٹس، یا ان کے مینوفیکچررز کی طرف سے کیے گئے دعوے، ناشر کی طرف سے ضمانت یا توثیق نہیں کی جاتی ہے۔
اس مضمون کے لیے اضافی مواد آن لائن پایا جا سکتا ہے: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
عبدلی ایل ایس، صمصام اے، ناصر ایس اے (2019)۔ پروپیونک ایسڈ آٹزم اسپیکٹرم عوارض میں PTEN/AKT پاتھ وے کو ریگولیٹ کرکے گلیوسس اور نیوروئنفلامیشن کو اکساتا ہے۔ سائنسی رپورٹس 9، 8824–8824۔ doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
ایچی سن، جے (1982)۔ ساختی ڈیٹا کا شماریاتی تجزیہ۔ JR Stat Soc Ser B طریقہ کار۔ 44، 139-160۔ doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023)۔ Firmicutes/Bacteroidetes کا تناسب چھاتی کے کینسر کے خطرے کے عنصر کے طور پر۔ جرنل آف کلینیکل میڈیسن، 12، 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010)۔ ترتیب شمار کے اعداد و شمار کے مختلف اظہار کا تجزیہ۔ نیٹ پچھلا 1–1، 1–10۔ doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013)۔ فیکل مائکروبیوٹا اور آٹزم والے بچوں میں میٹابولوم اور وسیع ترقیاتی خرابی کی دوسری صورت میں وضاحت نہیں کی گئی ہے۔ PloS One 8, e76993۔ doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020)۔ آٹزم اسپیکٹرم عوارض والے چھوٹے بچوں میں آنتوں کے مائکرو بائیوٹا کی بیکٹیریل نیورومیٹابولک خصوصیات۔ جرنل آف میڈیکل مائکروبیولوجی 69، 558–571۔ doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012)۔ مائکرو بایوم بطور انسانی عضو۔ کلینیکل مائکروبیولوجی اور انفیکشن 18، 2–4۔ doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T.، Dürre P. (2023)۔ پروپیونک ایسڈ پیدا کرنے والے بیکٹیریا کی فزیالوجی کے بارے میں نئی بصیرتیں: اینیروٹیگنم پروپیونیکم اور انیروٹگنم نیوپروپینکم (پہلے کلسٹریڈیم پروپیونیکم اور کلوسٹریڈیم نیوپروپینیکم)۔ مائکروجنزم 11، 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW، Spencer TE، Wu G، Cudd TA، Meininger SJ (2004)۔ زچگی کی غذائیت اور جنین کی نشوونما۔ جے نٹر۔ 134، 2169–2172۔ doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., and Hochberg, J. (1995)۔ غلط مثبت شرح کو کنٹرول کرنا: ایک سے زیادہ ٹیسٹنگ کے لیے ایک عملی اور موثر طریقہ۔ JR Stat Soc Ser B طریقہ کار۔ 57، 289–300۔ doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
پوسٹ ٹائم: اپریل 18-2025