Nature.com پر جانے کے لیے آپ کا شکریہ۔ آپ جو براؤزر ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے CSS کے لیے محدود سپورٹ حاصل ہے۔ بہترین تجربہ کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں کمپیٹیبلٹی موڈ آف کر دیں)۔ اس دوران، مسلسل سپورٹ کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائلز اور جاوا اسکرپٹ کے ڈسپلے کریں گے۔
کشیرکا جانوروں کے برعکس، کیڑوں میں بڑے پیمانے پر مردانہ متعصب جنسی سٹیرایڈ ہارمونز کی کمی کے بارے میں سوچا جاتا ہے۔ Anopheles gambiae میں، ecdysone steroid 20-hydroxyecdysone (20E) انڈے کی نشوونما کو کنٹرول کرنے کے لیے تیار ہوتا ہے جب مادہ 2 کے ذریعے ترکیب کیا جاتا ہے اور انڈوں کی نشوونما کے دوران جنسی طور پر جنسی نشوونما کے لیے پیدا ہوتا ہے۔ ملن ضروری تولیدی خصلتیں ہیں، یہ سمجھتے ہوئے کہ مادہ اینوفلیس مچھر کس طرح ان ہارمونل سگنلز کو یکجا کرتے ہیں ملیریا پر قابو پانے کے نئے پروگراموں کے ڈیزائن کو آسان بنا سکتے ہیں۔ یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ ان تولیدی افعال کو الگ جنسی سٹیرائڈز کے ذریعے منظم کیا جاتا ہے ایک پیچیدہ نیٹ ورک کے ذریعے ecdysteroid-activating/inactivated-wesplicated-inactivated. ecdysone, 3-dehydro-20E (3D20E)، جو جنسی منتقلی اور ڈیفاسفوریلیشن کے ذریعے ایکٹیویشن کے بعد خواتین کی جنسی قبولیت کو بند کر کے والدین کی حفاظت کرتا ہے۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ 3D20E کی منتقلی نے تولیدی جینز کے اظہار کو بھی متاثر کیا جو پلاسموڈیم انفیکشن کے دوران انڈے کی نشوونما کو برقرار رکھتے ہیں، اس بات کو یقینی بناتے ہیں کہ خواتین کی صحت کو متاثر نہ کریں۔ جنسی ردعمل ظاہر کرتا ہے، لیکن 20E-روکنے والے کنیزوں کو روکے جانے کے بعد ملاپ کرنے والے افراد کو انڈے دینے کی اجازت دیتا ہے۔ اس مردانہ مخصوص کیڑے کے سٹیرایڈ ہارمون کی شناخت اور خواتین کی جنسی قبولیت، زرخیزی اور پلازموڈیم کے ساتھ تعامل کو منظم کرنے میں اس کے کردار سے پتہ چلتا ہے کہ تولیدی عمل کی تولیدی کامیابی کو کم کرنے کی صلاحیت ہے۔
ملیریا کے کیسز اور اموات میں ایک بار پھر اضافہ ہو رہا ہے4 اینوفیلس مچھروں میں وسیع پیمانے پر کیڑے مار دوا کے خلاف مزاحمت کی وجہ سے، جو کہ انسانی ملیریا کے پرجیویوں کا واحد ویکٹر ہے۔ اس سنگل میٹنگ ایونٹ کو جراثیم سے پاک بنانے سے کھیت میں مچھروں کی آبادی کو کم کرنے کی بڑی صلاحیت ہوگی۔
مردوں کی جانب سے ہائی ٹائیٹر سٹیرائیڈ ہارمونز حاصل کرنے کے بعد خواتین جنسی طور پر معذور ہو جاتی ہیں۔ مطالعات سے معلوم ہوا ہے کہ مزید ملاپ میں دشواری کا محرک 20-ہائیڈروکسیڈیسون (20E) ہے، ایک سٹیرایڈ ہارمون جسے لاروا مرحلے میں پگھلنے والے سائیکل کے ریگولیٹر کے طور پر جانا جاتا ہے۔ انوفیلس کی انواع جو سبجینس سیلیا 7 کا حصہ ہیں، جو افریقہ میں تقسیم ہوتی ہے اور ملیریا کے سب سے خطرناک ویکٹر پر مشتمل ہوتی ہے، بشمول انوفیلس گامبیا۔ یہ خاص طور پر قابل ذکر ہے کیونکہ ان پرجاتیوں میں مادہ خون کے ہر کھانے کے بعد 20E بھی پیدا کرتی ہے، اور 20E oogenesis سائیکل چلاتی ہے، جس کے بارے میں بہت کم معلوم ہوتا ہے۔ ecdysone کے دو مختلف ذرائع (مردوں کی منتقلی اور خون کو کھانا کھلانے کی انڈکشن) سے ملنے والے سگنلز کو ضم کرنے کی اپنی صلاحیت پر سمجھوتہ کیے بغیر۔ درحقیقت، اگر خواتین کی طرف سے تیار کردہ 20E جنسی عدم برداشت کو متحرک کرتا ہے، تو یہ کنواری افراد میں بانجھ پن کا باعث بنے گا، جو ان مچھروں میں ایک بہت عام رویہ ہے۔
ایک ممکنہ وضاحت یہ ہے کہ A. gambiae نر ایک ترمیم شدہ مردانہ مخصوص ecdysone منتقل کرتے ہیں، جو خواتین کی تولیدی نالی میں سگنلنگ جھرن کو متحرک کرتا ہے، جس کے نتیجے میں ملن میں عدم استحکام پیدا ہوتا ہے۔ تاہم، اگرچہ کشیرکا جانوروں میں ایک سے زیادہ سٹیرایڈ ہارمونز ہوتے ہیں، جیسے کہ ایسٹروجن اور اینڈروجن (اندروجن)، ہمارے علم میں۔ کیڑوں میں اینڈروجینک متعصب سٹیرائڈز کی شناخت نہیں کی گئی ہے۔
ہم ممکنہ ترمیم کرنے والے سٹیرائڈز کی تلاش میں جنسی طور پر بالغ A. gambiae کے مردانہ مردانہ لوازماتی غدود (MAG) میں سٹیرائڈ ہارمونز کے ذخیرے کا تعین کرنے کے لیے نکلے ہیں۔ ٹینڈم ماس سپیکٹرو میٹری (HPLC-MS/MS) کے ساتھ مل کر اعلی کارکردگی والے مائع کرومیٹوگرافی کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے کم مخصوص طریقہ کار کا پتہ لگایا اور پہلے استعمال کیا گیا تھا۔ یہ ٹشو، پچھلے نتائج کی تصدیق کرتا ہے۔ تاہم، نمونے پر آکسیڈائزڈ فاسفوریلیٹڈ سٹیرائڈز کا غلبہ تھا، فارمولہ 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (شکل 1) کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔ دیگر شکلوں میں 3-dehydro-20E20E20E20-3-20-20-20 اور 3-ڈہائیڈرو (20E22P)۔ 3D20E22P کی HPLC-MS/MS سگنل کی شدت اس کی ڈیفاسفوریلیڈ شکل، 3D20E، اور E اور 20E سے زیادہ شدت کے دو آرڈرز زیادہ تھی (شکل 1)۔حالانکہ جسم کے دیگر حصوں میں ڈیفاسفوریلیٹیڈ (ڈیفاسفوریلیٹڈ فارم) اور ایف آر ٹی آئی جی کے نچلے حصے میں۔ 1a) ہم نے نئے بند (<1 دن پرانے) مردوں اور عورتوں میں ایکڈیسٹیرائڈز کا بھی تجزیہ کیا اور صرف MAG میں 3D20E اور 3D20E22P کا پتہ چلا۔ E, 20E اور 20E22P دونوں جنسوں میں موجود تھے (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 1b)۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ A. gambiae بالغ مرد اپنے MAGs میں ترمیم کرنے والے ہارمونز کے اعلی درجے پیدا کرتے ہیں جو خواتین کے ذریعہ ترکیب نہیں ہوتے ہیں۔
ایم اے جی اور مادہ ایل آر ٹی (بشمول ایٹریا، سیمینل ویسیکلز، اور پیرووریم) کو 4 دن کے (4 دن پرانے) کنواری مردوں اور کنواری اور ملن والی خواتین (0.5، 3، اور 12 ایچ پی ایم) سے الگ کیا گیا تھا۔ دو طرفہ، غلط دریافت کی شرح (ایف ڈی آر)، اہم نہیں *P <0.01: 3 گھنٹے بمقابلہ 0.035؛ P = 0.0015 گھنٹے؛ 3D20E22P: 3 گھنٹے بمقابلہ 0.5 گھنٹے، P = 0.25؛ 3 گھنٹے، P = 0.0032؛ 12 گھنٹے بمقابلہ 0.5 گھنٹے، P = 0.015)۔ ڈیٹا تین حیاتیاتی نقلوں سے ہے۔ مچھر۔ Ecdysone کو رنگ سے اس طرح دکھایا جاتا ہے: E، سبز؛ 20E، اورنج؛ 20E22P، جامنی؛ 3D20E، نیلا؛ 3D20E22P، گلابی۔ انسیٹ y-axis پر پیمانہ بڑھاتا ہے تاکہ ecdysone کی کم سطح کو ظاہر کیا جا سکے۔
یہ جانچنے کے لیے کہ آیا 3D20E22P اور 3D20E ملن کے دوران منتقل ہوتے ہیں، ہم نے ملن کے بعد مختلف اوقات میں خواتین کے LRTs کو الگ کر دیا۔ اگرچہ کنواریوں میں ecdysone نہیں پایا گیا، لیکن ہم نے LRT میں 3D20E22P کی کافی مقدار کو ملاوٹ کے فوراً بعد دیکھا۔ سطحوں میں نمایاں اضافہ ہوا (تصویر 1)۔کیمیائی طور پر ترکیب شدہ 3D20E کو معیار کے طور پر استعمال کرتے ہوئے، ہم نے طے کیا کہ LRTs کی ملاوٹ میں اس سٹیرایڈ ہارمون کی سطح 20E سے کم از کم 100 گنا زیادہ ہے (توسیع شدہ ڈیٹا ٹیبل 1)۔ اس طرح، 3D20E22P اہم ہے جو کہ LRT کے دوران خواتین میں منتقل ہوتا ہے اور یہ مردانہ طور پر مردانہ ہوتا ہے۔ ڈیفاسفوریلیٹیڈ شکل، 3D20E، ملن کے فوراً بعد بہت زیادہ ہو جاتی ہے۔ یہ مابعد ملاپ کی حیاتیات میں مؤخر الذکر ایکڈیسون کے لیے ایک اہم کردار کی تجویز کرتا ہے۔
ایک نیا RNA سیکوینسنگ (RNA-seq) ڈیٹاسیٹ (تصویر 2a) بنانے کے بعد، ایک حسب ضرورت ساختہ بائیو انفارمیٹکس پائپ لائن کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے ecdysone kinase (EcK)، ecdysone oxidase (EO)، اور ecdysone encoding 20E-modified phosphatase کی شناخت کی ہے۔ ایک امیدوار EPP جین اور دو ممکنہ EcK جین (EcK1 اور EcK2)، لیکن اچھے امیدوار EO جین کو تلاش کرنے سے قاصر تھے۔ خاص طور پر، انفرادی EPP جینز کا اظہار گیمبیئن MAGs میں اعلیٰ سطح (98.9 فیصد) پر کیا گیا تھا لیکن خواتین LRTs (تصویر 2b) میں نہیں، ہماری توقعات کے برعکس یہ PEP20 کی توقعات کے برعکس ہوتا ہے۔ زنانہ ٹشو۔ اس لیے، ہم سمجھتے ہیں کہ ملن کے دوران مردانہ EPP کو منتقل کیا جا سکتا ہے۔ درحقیقت، ہم نے ویوو سٹیبل آاسوٹوپ لیبلنگ میں ملاوٹ کے بعد مادہ پروٹین کو ماسک کرنے کے لیے استعمال کیا، ایک انزائم جس کی شناخت MS کے ذریعے زنانہ ایٹریم میں ہوتی ہے (تصویر 2c اور ضمنی جدول 1)۔ MAG میں EPP کی موجودگی کی تصدیق کی گئی تھی اور مخصوص Lbugins کا استعمال کرتے ہوئے مخصوص اینٹی بیوگین نہیں تھا۔ (تصویر 2 ڈی)۔
a، EcKs، EOs، اور EPPs کو انکوڈنگ کرنے والے جینز کے لیے ہر جنس کے تولیدی بافتوں کو تلاش کرنے کے لیے ایک حسب ضرورت بنائی گئی بایو انفارمیٹکس پائپ لائن۔ تیر کے ساتھ والے نمبر ہر قدم پر مرد اور خواتین امیدواروں کی تعداد کی نشاندہی کرتے ہیں۔ اس تجزیے نے ایک EPP جین (EPP) کی نشاندہی کی اور ایک EcK اور EcKs میں ظاہر کیا گیا ہے کہ ایک جین (EcKs) جین (EcK2) جس کا اظہار دونوں جنسوں میں ہوتا ہے لیکن امیدوار EO gene.b نہیں دیتا، ہیٹ میپ کنواری (V) اور میٹنگ (M) Anopheles gambiae اور Anopheles albicans tissues میں امیدوار کے جین کے اظہار کا موازنہ کرتا ہے۔Spca، فرٹلائجیشن؛ MAGs، مردوں میں آلات غدود؛ جسم کے دوسرے حصے، بشمول چھاتی، پنکھ، ٹانگیں، چربی والے جسم، اور دونوں جنسوں میں اندرونی اعضاء، اور خواتین میں بیضہ دانی۔ EcK2 گیمبیا کے MAG اور atria دونوں میں بہت زیادہ ظاہر ہوتا ہے، جب کہ EPP صرف MAG.c میں پایا جاتا ہے، مردانہ انزال گروپ کا پروٹومک تجزیہ، h2 پر خواتین کی نقل مکانی، h2 میں دکھایا گیا ہے۔ 67 سب سے زیادہ پرچر پروٹین۔ خواتین کو تمام پروٹینوں کو لیبل کرنے (اور ماسک) کے لیے 15N پر مشتمل خوراک پر اٹھایا گیا تھا۔ غیر ٹیگ شدہ مردوں کو ٹیگ شدہ خواتین کے ساتھ ملایا گیا تھا، اور خواتین LRTs کو پروٹومک تجزیہ کے لیے 3، 12 اور 24 hpm پر الگ کیا گیا تھا (دیکھیں EPP کی مکمل فہرست، EPP کی مکمل فہرست، EPP کی مکمل فہرست میں EPP کی فہرست)۔ اور EcK2 کا پتہ ان ٹشوز کے پروٹومک تجزیہ کے ذریعے کنواری مردوں کے MAG میں پایا گیا۔ ڈی، EPP کا پتہ MAG میں ویسٹرن بلاٹ اور ملاپ والی خواتین کے LRT سے ہوا، لیکن کنواری خواتین یا مردوں یا باقی خواتین کے جسم میں نہیں۔ virgins. جیل سورس ڈیٹا کے لیے ضمنی شکل 1 دیکھیں۔ اسی طرح کے نتائج کے ساتھ ویسٹرن بلاٹس دو بار کیے گئے۔
EPP کی ecdysteroid phosphophosphatase سرگرمی کی تصدیق HPLC-MS/MS کے ذریعے MAG سے الگ تھلگ 3D20E22P کے ساتھ کی گئی تھی۔ مزید برآں، جب ہم نے EPP کو RNA-ثالثی مداخلت (RNAi) کے ذریعے خاموش کیا، تو ہمیں ان reproducts کی ایک مضبوط reproduct سرگرمی کا پتہ چلا۔ مرد (تصویر 3a)، اور EPP-خاموش مردوں کے ساتھ ملاپ کرنے والی خواتین نے جزوی جین کی خاموشی کے باوجود dephosphorylated 3D20E (تصویر 3b) کا کم تناسب ظاہر کیا (توسیع شدہ ڈیٹا Fig. 2b,c)۔ اس کے برعکس، ہم نے 20E/20E 20E میں ایسی اہم تبدیلیوں کا پتہ نہیں لگایا جو 20E/20E2 میں تجویز کر سکتے ہیں۔ کہ انزائم 3D20E22P (تصویر 3b) کے لیے مخصوص ہے۔
a، MAG میں فاسفیٹیز کی سرگرمی میں کمی جس کی وجہ EPP کو ڈبل سٹرینڈڈ EPP RNA (dsEPP) یا ڈبل ​​سٹرینڈڈ GFP RNA (dsGFP) کنٹرولز کا استعمال کرتے ہوئے خاموش کر دیا گیا ہے۔ ہر ایک نقل میں بیس MAG پول استعمال کیے گئے تھے (P = 0.0046، پیئرڈ ٹی-ٹیسٹ)، دو طرفہ ڈوز کے ساتھ نمایندگی۔ EPP خاموش مردوں میں 3 hpm پر dephosphorylated 3D20E کا نمایاں طور پر کم تناسب تھا (P = 0.0043، غیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ، دو رخا)، جبکہ 20E کی سطح غیر متاثر ہوئی (P = 0.063، غیر جوڑا)۔ t-ٹیسٹ، دو طرفہ)۔ ڈیٹا کو 13، 16 اور 19 خواتین کے تین پولوں سے اوسط ± sem کے طور پر پیش کیا گیا ہے، ہر ایک میں EPP-خاموش مردوں کے ساتھ ملاپ کرنے والی خواتین میں دوبارہ ملاپ کی شرح نمایاں طور پر زیادہ تھی (P = 0.0002، فشر کا عین مطابق ٹیسٹ، دو طرفہ حالت کو یقینی بنانے کے لیے ان کی پہلی میٹنگ پر مجبور کیا گیا تھا)۔ 2 دن بعد، ان سے ٹرانسجینک سپرم لے جانے والے دوسرے مردوں سے رابطہ کیا گیا تاکہ ٹرانسجین ڈی کے مقداری پی سی آر کا پتہ لگانے کے ذریعے دوبارہ ملاپ کی شرح کا اندازہ لگایا جا سکے، EPP-خاموش مردوں کے ساتھ ملاوٹ والی خون سے پلائی جانے والی خواتین میں زرخیزی میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی (P <0.0001؛ Mann-Whitney) اور دو نمبری پی سی ٹیسٹ = دو نمبری کم 0.088، مان-وٹنی ٹیسٹ، دو طرفہ)، جبکہ اسپوننگ کی شرح متاثر نہیں ہوئی (P = 0.94، فشر کا عین مطابق ٹیسٹ، دو رخا)۔ تمام پینلز میں، n، حیاتیاتی طور پر آزاد مچھروں کے نمونوں کی تعداد کی نمائندگی کرتا ہے۔ NS، اہم نہیں ہے۔ 0.001۔
اس کے بعد، ہم نے اندازہ کیا کہ آیا خواتین میں ملن کے خلاف مزاحمت پیدا کرنے کے لیے ایکڈیسون ڈیفاسفوریلیشن اہم ہے۔ خاص طور پر، EPP سے محروم مردوں کے ساتھ ملاپ والی خواتین کنٹرول خواتین (10.4%) کے مقابلے میں بہت زیادہ فریکوئنسی (44.9%) پر دوبارہ ملاپ کرتی ہیں جب اضافی (ٹرانسجینک) مردوں کے سامنے آتے ہیں (تصویر 3 میں بھی نمایاں کمی)۔ 3d، بائیں) اور ان خواتین کی طرف سے دیے جانے والے انڈوں کی تعداد میں معمولی کمی (تصویر 3d، درمیانی) جبکہ خواتین کی طرف سے دیے جانے والے انڈوں کی فیصد (دوسرا ردعمل جو کہ ملاوٹ کے ذریعے خواتین میں حاصل کیا گیا)) متاثر نہیں ہوا (تصویر 3d، دائیں)۔ 3D20E23P20 کے ذریعے EPP کی مشاہدہ کردہ مخصوصیت کو دیکھتے ہوئے یہ تجویز کیا گیا ہے کہ EPP کی منتقلی کے نتائج 3D20E23 کے فعال ہیں۔ ملن کے دوران خواتین کی قبولیت کو مزید ملاوٹ کے لیے بند کرنے میں ایک اہم کردار ہو سکتا ہے، یہ ایک ایسا رویہ ہے جو پہلے 20E کی جنسی منتقلی سے منسوب کیا گیا تھا۔ اس لیے یہ مردانہ مخصوص ہارمون خواتین کی زرخیزی پر بھی سخت اثر انداز ہوتا ہے۔
اس کے بعد، ہم نے جنسی طور پر بالغ کنواریوں میں انجکشن کے تجربات میں 20E اور 3D20E کی سرگرمیوں کا موازنہ کیا جو کیمیائی طور پر ترکیب شدہ 3D20E (تصویر 4a–c) اور تجارتی طور پر دستیاب 20E کا استعمال کرتے ہیں۔ 4d) خاص طور پر، LRT میں 3D20E کی نصف جسمانی سطح (1,066 pg پوسٹ انجیکشن بمقابلہ 2,022 pg پوسٹ میٹنگ) نے ریفریکٹری خواتین کے تناسب کی حوصلہ افزائی کی جو کہ 20E کی جسمانی سطح سے 20 گنا زیادہ تھی (361 پی جی کے بعد 361 گھنٹے بعد سب سے زیادہ) 18 ص بعد از ملاپ؛ توسیعی ڈیٹا ٹیبل 1)۔یہ نتیجہ اس تصور سے مطابقت رکھتا ہے کہ 20E کی جنسی منتقلی میٹنگ ریفریکٹری ادوار کا سبب نہیں بنتی ہے، اور والدین اور بچے کے تعلقات کو یقینی بنانے میں ایک اہم عنصر کے طور پر 3D20E کی طرف مزید اشارہ کرتا ہے۔ جزوی EPP خاموشی کے بعد مشاہدہ کیا گیا ہے جو کہ 3D20E کی بقایا سرگرمی کی موجودگی کی وجہ سے تھا جو اب بھی میٹنگ سے متاثرہ خواتین کے عوامل کے ذریعہ تیار کیا جاتا ہے۔
(a,b) 3D20E کیمیاوی طور پر 20E سے ترکیب کیا گیا (a) بہت زیادہ تبدیلی/افادیت کے ساتھ (تین آزاد ترکیب کے رد عمل سے اوسط ± sem کے طور پر پیش کردہ ڈیٹا) (b.c، ماس اسپیکٹرم (نیچے کا نصف) مکمل طور پر میٹیڈ خواتین LRT (اوپر نصف) میں پائے جانے والے ایکڈیسون سے میل کھاتا ہے۔ 0.02؛ 0.21 µg، P <0.0001؛ فشر کا عین مطابق ٹیسٹ، دو طرفہ) اور 10% ایتھنول (0.63 µg، P <0.0001؛ 0.21 µg، P <0.0001؛ فشر کے ٹیسٹ میں صرف 2-E سے زیادہ) خوراکیں (0.63 µg، P = 0.0002؛ 0.21 µg، P = 0.54؛ فشر کا عین مطابق ٹیسٹ، 2 رخا) یعنی، 3D20E انجیکشن نے کنواری خواتین میں 10% ایتھنول کنٹرولز (0.02µ1<0.001؛ 0.01؛ 0. 0.13 µg، P = 0.0003؛ فشر کا عین مطابق ٹیسٹ، دو طرفہ)، جبکہ 20E صرف زیادہ مقدار میں کنٹرولز کے مقابلے میں (0.21 µg، P = 0.022؛ 0.13 µg، P = 0.0823؛ Fisher's exact rate two-sided exactly high-ducd3d)۔ 20E سے زیادہ خوراک پر (0.21 µg، P = 0.0019؛ 0.13 µg، P = 0.075؛ فشر کا درست ٹیسٹ، دو طرفہ)۔ تمام پینلز میں، n، حیاتیاتی طور پر آزاد مچھروں کے نمونوں کی تعداد کی نمائندگی کرتا ہے۔ NS، اہم نہیں۔ <0P، <0P <0****** 0.001، ****P <0.001. ڈیٹا تین نقلوں سے ہیں۔
پچھلے مطالعات میں، ہم نے طے کیا تھا کہ سٹیرایڈ ہارمونز کی جنسی منتقلی MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) کے اظہار کی حوصلہ افزائی کرتی ہے، ایک مادہ تولیدی جین جو A. gambiae خواتین کو P. falciparum انفیکشن سے بچاتا ہے، 13 کی وجہ سے ہونے والے صحت کے اخراجات، سب سے مہلک انسانی ملیریا کے پیراسائٹ کے لیے انتہائی اہم ہے۔ ملیریا سے متاثرہ علاقوں میں اینوفیلس کے بارے میں، ہم نے اس بات کا تعین کرنے کا فیصلہ کیا کہ کون سا ہارمون 3D20E یا 20E اس جین کے اظہار کو متحرک کرتا ہے۔ Vg14, 15, 16, MISO زیادہ مضبوطی سے 3D20E (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 3) کی طرف سے حوصلہ افزائی کی گئی تھی. اس طرح، اس اینڈروجینک سٹیرائڈ ہارمون کی جنسی منتقلی میکانزم کی حوصلہ افزائی کرتی ہے جو خواتین کو پرجیوی انفیکشن سے پیدا ہونے والے اخراجات سے بچاتا ہے. EcR، EcR-A کو دلانا اور EcR-B کو دباتا ہے، اور HPX15 سمیت دیگر ملاپ پیدا کرنے والے جین کو زیادہ مضبوطی سے متحرک کرتا ہے، جو خواتین کی زرخیزی کو متاثر کرتا ہے۔ یہ EPP-خاموش مردوں کے ساتھ ملاپ والی خواتین میں نمایاں بانجھ پن کی وضاحت کر سکتا ہے (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 3)۔ ecdysone ہارمونز جو جنس کے لیے مخصوص فعل کو متاثر کر سکتے ہیں۔
اس کے بعد، ہم نے اپنی بائیو انفارمیٹکس پائپ لائن میں شناخت کیے گئے دو EcK جینوں کے فنکشن کا تجربہ کیا۔ EcK1 یا EcK2 کو خاموش کرنے کے نتیجے میں مردوں میں نمایاں اموات ہوئیں (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 4a)، یہ تجویز کرتا ہے کہ ecdysone فاسفوریلیشن، اور اس طرح غیر فعال ہونا، EK12 کی بقا کے لیے اہم ہے۔ پروٹومکس (تصویر 2b،c اور ضمنی جدول 2) کے ذریعہ MAGs میں پتہ چلا، ہم نے اس کی ecdysteroid kinase سرگرمی کو 20E کے ساتھ انکیوبیٹ کرکے توثیق کی، جس کے نتیجے میں فاسفوریلیشن 20E22P (توسیع شدہ ڈیٹا فگر 2)4b) ہوا)۔ فاسفوریلیٹڈ پروڈکٹ 3D20E22P (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 4c)، تجویز کرتا ہے کہ 3D20E کے بجائے 20E EcK2 کا ترجیحی ہدف ہو سکتا ہے۔
ہمارے RNA-seq تجزیہ کے مطابق، EcK2 کا اظہار کنواری خواتین کی LRT میں بھی بہت زیادہ کیا گیا تھا، جہاں اسے ملاپ کے بعد بند کر دیا گیا تھا (تصویر 2b)۔ ہم نے ان اعداد و شمار کی تصدیق کی اور طے کیا کہ EcK2 اظہار خون کی خوراک سے متاثر نہیں ہوا (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 5a)۔ توسیع کرنا ہمارے ابتدائی MS2 کے تجربات کا تعین کرتا ہے، PE2 کے ساتھ ہم پی ای 2 کے ابتدائی تجربات سے متعلق تھے۔ 20E کی چوٹی (خون کے کھانے کے 22-26 گھنٹے بعد؛ توسیعی ڈیٹا تصویر 5b)۔ کنواری خواتین میں EcK2 کو خاموش کرنے کے نتیجے میں 20E سے 20E22P کے رشتہ دار تناسب میں 26 گھنٹے بعد خون کے کھانے پر 3 گنا اضافہ ہوا (توسیع شدہ ڈیٹا کے اعداد و شمار اور EcK2 کے اعداد و شمار بھی تصدیق کرتے ہیں) خواتین میں 20E۔ خاص طور پر، EcK2 ختم ہونے والی کنواریوں نے مکمل جنسی قبولیت کو برقرار رکھا (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 5d،e)، مزید یہ بتاتا ہے کہ 20E کی خواتین کی پیداوار میٹنگ ریفریکٹری پیریڈز کو آمادہ نہیں کرتی ہے۔ تاہم، ان خواتین نے انڈے دینے کی شرح میں نمایاں اضافہ کیا تھا، ان کے مقابلے میں انڈے دینے کی شرح میں 10 فیصد زیادہ اضافہ ہوا تھا۔ اعداد و شمار کے اعداد و شمار 5f)۔ اگر دوہری پھنسے ہوئے Eck2 RNA (dsEcK2) کے انجیکشن خون پلانے کے بعد لگائے گئے تھے تو اسپوننگ نہیں ہوئی تھی، جس وقت خون کے اخراج کی وجہ سے 20E کی چوٹی میں کمی واقع ہوئی تھی۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج ایک ایسے ماڈل کی حمایت کرتے ہیں جو خون چوسنے کے بعد پیدا ہونے والا 20E صرف اسپوننگ اور دیگر سپوننگ کو متاثر کر سکتا ہے، لیکن اسپوننگ کو روک سکتا ہے۔ فیکٹرز) کو ملاوٹ کے ذریعے بند کر دیا جاتا ہے۔ نہ ہی 20E اور نہ ہی 3D20E انجیکشن کنواریوں میں EcK2 کے اظہار کو روکتے ہیں (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 5g)، یہ بتاتے ہیں کہ دیگر عوامل اس کنیز کی روک تھام میں ثالثی کرتے ہیں۔ تاہم، خون پلانے کے بعد 20E کی سطحیں زیادہ مؤثر نہیں تھیں، لیکن ٹرگر کے لیے کافی نہیں تھے۔ جنسی طور پر منتقل شدہ 3D20E کا۔
ہمارے نتائج A. gambiae کی تولیدی کامیابی کو منظم کرنے کے طریقہ کار کے بارے میں اہم بصیرت فراہم کرتے ہیں۔ ایک ماڈل ابھر کر سامنے آیا ہے جہاں مردوں نے 3D20E کے اعلی ٹائٹرز کی ترکیب کے لیے تیار کیا ہے، ایک مرد کے لیے مخصوص ترمیم شدہ ایکڈیسون جو خواتین کو مزید ملاوٹ کے لیے غیر حساس بنا کر والدین کو یقینی بناتا ہے، یہ بھی ایک ہی وقت کے ساتھ مل کر کام کرتا ہے۔ مردوں کے لیے مخصوص EPP کی جنسی منتقلی کے جواب میں خواتین میں 3D20E کو فعال کرنے کے لیے موثر نظام۔ ہمارے علم کے مطابق، یہ کیڑوں میں منفرد اور اہم کام انجام دینے والے مرد اور خواتین کے زیر اثر سٹیرایڈ ہارمون سسٹم کی پہلی مثال ہے۔ 18 یہ ہے کہ یہ افعال 20E پیشگی E1 کے ذریعہ انجام دیئے جاسکتے ہیں۔ یہ بات مشہور ہے کہ ڈروسوفلا میں، مونینڈری چھوٹے جنسی پیپٹائڈس 19,20 کی جنسی منتقلی سے متحرک ہوتی ہے جو مخصوص جنسی پیپٹائڈ ریسیپٹرز کے ذریعے خواتین کی تولیدی نالی کو گھیرنے والے نیوران کے ساتھ تعامل کرتی ہے۔ A. gambiae خواتین میں 3D20E اور اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا ان جھرنوں کو مچھروں اور ڈروسوفلا کے درمیان محفوظ کیا جا سکتا ہے۔
ہمارے مطالعے میں خواتین کی زرخیزی اور رویے پر 3D20E کے اہم کردار کی نشاندہی کرتے ہوئے، 3D20E کی ترکیب اور ایکٹیویشن کی طرف جانے والے راستے مستقبل میں مچھروں پر قابو پانے کی حکمت عملیوں کے لیے نئے مواقع فراہم کرتے ہیں، جیسے جراثیم سے پاک کیڑوں کی ٹیکنالوجی کی حکمت عملیوں میں مسابقتی جراثیم سے پاک مردوں کی نسل کو جنگلی رہائی کے لیے استعمال کرنا یا mavir 203 کے افعال کی نقل کرنا۔ 3D20E کا ارتقا ہو سکتا ہے جب A. gambiae اور Cellia کی دیگر انواع نے اپنے منی کو میٹنگ پلگ میں جمع کرنے کی صلاحیت حاصل کی، کیونکہ یہ بڑی تعداد میں ہارمونز اور ہارمون کو متحرک کرنے والے انزائمز کی موثر منتقلی کی اجازت دیتا ہے۔ اس کے نتیجے میں، 3D20E ارتقاء پر عمل درآمد کرنے والی خواتین کے لیے monandry SO کی اعلی سطح فراہم کرتا ہے۔ ملیریا کے زیادہ پھیلاؤ والے علاقوں میں ان کی تولیدی تندرستی، جو بالواسطہ طور پر پلازموڈیم ٹرانسمیشن میں حصہ ڈالتی ہے۔ یہ دیکھتے ہوئے کہ مادہ 20E نے مادہ اینوفلیس مچھروں میں P. فالسیپیرم کی بقا اور نشوونما پر گہرے اثرات مرتب کیے ہیں، 24 اب نر اور مادہ دونوں سٹیرایڈ ہارمونز کے تعامل کے راستے ہیں۔
A. gambiae G3 تناؤ کو کیڑوں کے معیاری حالات (26-28 °C، 65-80% رشتہ دار نمی، 12:12 h روشنی/گہرا فوٹو پیریڈ) کے تحت پالا گیا تھا۔ لاروا کو مچھلی کی پاؤڈر والی خوراک (TetraMin Tropical Flakes، Koi Pellets اور Tetra Pond Sticks of A:2:7) میں پالا گیا تھا۔ ایڈ لیبٹم 10٪ ڈیکسٹروز محلول اور ہفتہ وار انسانی خون (خون کے اجزاء کا مطالعہ) کھلایا گیا۔ کنواری مچھروں کو مائیکروسکوپی کے ذریعے سروں کا معائنہ کرنے کے بعد پپل کے مرحلے پر جنسوں کو الگ کرکے حاصل کیا گیا۔
جبری ملاوٹ کے تجربات پہلے بیان کردہ پروٹوکول کے مطابق کیے گئے تھے۔ قدرتی ملاپ کے لیے، 4 دن کی کنواری خواتین کو جنسی طور پر بالغ کنواری مردوں کے ساتھ دو راتوں کے لیے 1:3 کے تناسب میں رکھا گیا تھا۔ ان تجربات کے لیے جن میں مردوں کو dsEPP کا انجیکشن لگایا گیا تھا، co-caging کے موافق دنوں میں 3-4 دن کی سرگرمی کے بعد زیادہ سے زیادہ 3-4 دن کی سرگرمی ہوتی تھی۔ (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 2b)۔
مچھر کے ٹشوز، باقی ماندہ کیڈور (باقی جسم)، یا پورے جسم کو 100% میتھانول میں الگ کیا گیا تھا اور بیڈر کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا تھا (2 ملی میٹر شیشے کے موتیوں، 2,400 rpm، 90 سیکنڈ)۔ ٹشو کی مقدار اور میتھانول کی مقدار حسب ذیل تھی: باقی جسم، 50µ1 انچ MAG، 50–100 80 µl; خاتون LRT، 25–50 80 µl۔ میتھانول کے ایک ہی حجم کے ساتھ ایک دوسرے میتھانول نکالنے کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ سیل کے ملبے کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے ہٹا دیا گیا تھا۔ دونوں نکالنے والے میتھانول کو ملا کر نائٹروجن کے بہاؤ کے نیچے خشک کیا گیا تھا، پھر اسے دوبارہ بحال کیا گیا تھا: جسم میں میتھانول کی 50 فیصد مقدار میں باقی پانی کی مقدار µl MAGs اور خواتین LRT، 30 μl۔
نمونوں کا تجزیہ ماس اسپیکٹومیٹر (ID-X، تھرمو فشر) پر کیا گیا جو کہ LC انسٹرومنٹ (Vanquish، Thermo Fisher) کے ساتھ مل کر کیا گیا۔ 5 µl نمونے کو 3 µm، 100 × 4.6 mm کالم میں انجکشن لگایا گیا تھا (Inspire C8، Dikma 5 °C پر موبائل فیز کو برقرار رکھا گیا تھا)۔ (پانی، 0.1% فارمک ایسڈ) اور B (acetonitrile، 0.1% formic acid)۔ LC گریڈینٹ اس طرح تھا: 1 منٹ کے لیے 5% B، پھر 11 منٹ میں 100% B تک بڑھ گیا۔ 8 منٹ کے بعد 100% پر، کالم کو دوبارہ متوازن کریں 5% B3 منٹ کے لیے بہاؤ کی شرح 4 ملی لیٹر تھی۔ min-1. MS ماخذ میں Ionization مثبت اور منفی طریقوں میں گرم الیکٹرو سپرے آئنائزیشن کے ذریعے مکمل کیا جاتا ہے۔
ماس سپیکٹرو میٹر m/z کی حد میں 350 سے 680 کے درمیان 60,000 ریزولوشن میں مکمل MS موڈ میں ڈیٹا کو ماپتا ہے۔ MS/MS ڈیٹا [M + H]+ (تمام اہداف)، [M - H2O + H]+ (تمام اہداف)، اور [M - H]- (فاسفوریلیٹڈ اہداف) پر حاصل کیا گیا تھا۔ دستیاب۔ غیر ٹارگٹڈ ایکڈیسٹیرائیڈز کی شناخت کے لیے، تمام HPLC چوٹیوں کے لیے MS/MS ڈیٹا کا 15% نسبتہ کثرت کے ساتھ تجزیہ کیا گیا۔ خالص معیارات (20E, 3D20E) سے بنائے گئے معیاری منحنی خطوط کا استعمال کرتے ہوئے ایک مخصوص نمونے کی مطلق مقدار یا کمزوری کا حساب لگانے کے لیے (دیگر تمام اہداف) کو ان کی مقدار کے برابر کرنے کے لیے مقدار درست کریں۔ 3D20E، مقدار کا تعین درج ذیل عادی افراد کے مجموعے کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا: [M + TFA]-، [M + COOH]-، [M + Na]+، [M + Cl]-، [M + NO3] - ڈیٹا کو ٹریس فائنڈر (ورژن 4.1) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا اور مقدار درست کی گئی۔ E, 20E اور 3D20E کا متعلقہ معیارات سے موازنہ کیا گیا۔ 3D20E22P کا تجزیہ Girard کے reagent کے ساتھ اخذ کیا گیا۔ 20E22P کا m/z تناسب سے تجزیہ کیا گیا۔
3D20E22P کو MAG سے پاک کیا گیا تھا۔ پیوریفیکیشن کو تجزیاتی پیمانے پر ایک الٹرا پرفارمنس مائع کرومیٹوگراف (ایکویٹی، واٹرس) کا استعمال کرتے ہوئے ایک کواڈروپول ماس بیسڈ ڈیٹیکٹر (QDa، ایکویٹی، واٹرس) کے ساتھ انہی LC حالات کے تحت انجام دیا گیا تھا جب HPLC-lyanasis/mFMS/Trigger کو جمع کیا گیا تھا۔ 3D20E22P کے مطابق اسی برقرار رکھنے کے وقت پر پتہ چلا جیسا کہ پہلے طے کیا گیا تھا۔ اس کے بعد نکالے گئے مرکبات کی پاکیزگی کو HPLC-MS/MS کے ذریعے چیک کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔
مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے TRI ریجنٹ (تھرمو فشر) کا استعمال کرتے ہوئے 10-12 تولیدی بافتوں یا جسم کے دیگر حصوں (سر کے بغیر) سے کل RNA نکالا گیا تھا۔ RNA کا علاج TURBO DNase (تھرمو فشر) سے کیا گیا تھا۔ cDNA کو Moloney murine leukemia وائرس کے بعد ترکیب کیا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کی ہدایات۔ ریورس ٹرانسکرپشن کوانٹیٹیو پی سی آر (RT-qPCR؛ توسیعی ڈیٹا ٹیبل 2) کے لیے پرائمر پہلے 24 شائع کیے گئے تھے یا پرائمر-BLAST26 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیے گئے تھے، جس میں 70-150 bp سائز کی مصنوعات کو ترجیح دی گئی تھی اور exon-exon جنکشنز یا پرائمر کے لیے الگ الگ exon-exon junctions یا Primerons تین سے الگ الگ exon-exon پرائمر کے لیے تھے۔ RT-qPCR کے لیے پانی میں چار گنا پتلا کیا گیا۔ 15 µl نقلی رد عمل میں کیا گیا جس میں 1× PowerUp SYBR گرین ماسٹر مکس (تھرمو فشر)، پرائمر، اور 5 µl گھٹا ہوا cDNA تھا۔ رد عمل کوانٹ اسٹوڈیو 6 پرو پر چلائے گئے تھے اور PCR ڈیٹا کو ریئل ٹائم اکٹھا کیا گیا تھا۔ ڈیزائن اور تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے (ورژن 2.4.3)۔ جیسا کہ اس مطالعہ میں دکھایا گیا ہے، نسبتہ مقدار کو رائبوسومل جین RpL19 (AGAP004422) کے لیے معمول بنایا گیا تھا، جس کا اظہار خون 27 یا میٹنگ 3 کے ساتھ نمایاں طور پر تبدیل نہیں ہوا۔
Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) کا استعمال کرتے ہوئے RNA کوالٹی کی جانچ کی گئی۔ ایلومینا پیئرڈ اینڈ لائبریریز کو براڈ انسٹی ٹیوٹ آف MIT اور ہارورڈ میں تیار کیا گیا اور چلایا گیا۔ ترتیب وار ریڈز کو A. gambiae genome (PEST strain، ورژن 4.12 کے ساتھ HISAT20) کے ساتھ منسلک کیا گیا۔ پیرامیٹرز۔ میپنگ کوالٹی (MAPQ) کے اسکورز کے ساتھ پڑھے <30 کو Samtools (ورژن 1.3.1) کا استعمال کرتے ہوئے ہٹا دیا گیا تھا۔ htseq-count (ورژن 0.9.1) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیفالٹ پیرامیٹرز کے ساتھ پڑھنے کی تعداد کو شمار کیا گیا۔ 1.28.1) R میں (ورژن 4.0.3)۔
Ecdysone میں ترمیم کرنے والے جین کے امیدواروں کی شناخت پہلے PSI-BLAST الگورتھم (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) کا استعمال کرتے ہوئے A. gambiae جینوم کو تلاش کرکے، درج ذیل استفسار کے ساتھ پہلے سے طے شدہ اقدار کے پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔ NP_001038956.1)، Musca domestica (الحاق نمبر XP_005182020.1، XP_005175332.1 اور XP_011294434.1) اور Microplitis demolitor (الحاق نمبر XP_00651515204651520.1) B. موری سے EcK (الحاق نمبر NP_001036900)، ڈروسوفلا میلانوگاسٹر (الحاق نمبر NP_651202)، Apis mellifera (الحاق نمبر XP_394838) اور Acyrthosiphon pisum (الحاق نمبر 1_06104838)؛ اور B. موری سے EPP (الحاق نمبر XP_001947166) NP_001177919.1 اور NP_001243996.1) اور D. میلانوگاسٹر کا EO (الحاق نمبر NP_572986.1) (مرحلہ 1)۔ گیمبیا میں تولیدی ٹشو (فیمیل LRT یا MAG) میں فی ملین میپڈ ریڈز (FPKM) یا >85%) ٹکڑے/کلو بیس ایکسونز (مرحلہ 2)۔ مخصوصیت کو بہتر بنانے کے لیے، ہم نے امیدوار کے انزائمز کا انتخاب کیا جن کا اظہار A. albimanus کے تولیدی بافتوں میں بھی ہوتا ہے، ایک انوفیلس پرجاتی جو ملن کے دوران ایکڈیسون کی ترکیب یا منتقلی نہیں کرتی ہے۔ امیدوار جینز کو کم اظہار (<100 FPKM یا <85th پرسینٹائل) کی بنیاد پر فلٹر کیا گیا تھا۔ فلٹر (مرحلہ 4)، امیدواروں کے جینز کو درج ذیل میں سے کم از کم ایک کو پورا کرنے کی ضرورت ہے: (1) ملاوٹ کے بعد نمایاں طور پر اپ ریگولیٹڈ (P <0.05) مختلف جینز کے تجزیے کے مطابق اور (2) غیر تولیدی ٹشوز میں (<85% یا <100 FPKM)۔
ہم نے پہلے بیان کردہ طریقوں 28,29,30 میں ترمیم کی تاکہ پورے حیاتیات کی آاسوٹوپک لیبلنگ حاصل کی جاسکے۔ مختصراً، جنگلی قسم کی Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) کو خمیر نائٹروجن بیس (BD Difco, DF0335) میں جانچا گیا جس میں (wt2/50%) ووول (wt2) سگما)، 1.7% امینو ایسڈ فری اور امونیم سلفیٹ۔ کلچر میڈیم) اور 5% 15N امونیم سلفیٹ (NLM-713, >99%, کیمبرج آاسوٹوپ لیبارٹریز) نائٹروجن کے واحد ذریعہ کے طور پر۔ خمیر سینٹرفیوگریشن کے ذریعے بازیافت کیا گیا تھا اور مچھر کے لاروا کو pupation تک کھلایا گیا تھا۔ instar mortality. اس کے بعد صرف خواتین کو بغیر لیبل والے مردوں کے ساتھ ملاپ کے تجربات میں استعمال کیا جاتا تھا تاکہ ملاپ کے دوران منتقل ہونے والے مرد پروٹوم کا تجزیہ کیا جا سکے۔
4-6 دن پرانی 15N-ٹیگ والی کنواری خواتین کو عمر کے مماثل غیر ٹیگ شدہ کنواری مردوں کے ساتھ جبری ملاپ کیا گیا۔ ایپی فلوروسینس مائیکروسکوپی کے تحت میٹنگ پلگ کا پتہ لگا کر کامیاب ملاپ کی تصدیق کی گئی۔ 3، 12، اور 24 hpm پر، 45-55s کی ایٹریا µ50 s کی میٹڈ مادہ میں تقسیم ہو گئی۔ بائی کاربونیٹ بفر (pH 7.8) اور ایک موسل کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا۔ ہوموجینیٹ کو سینٹرفیوج کیا گیا اور سپرنیٹنٹ کو 50 μl 0.1% RapiGest (186001860، Waters) کے ساتھ 50 mM امونیم بائک کاربونیٹ میں ملایا گیا۔ یونیورسٹی آف واشنگٹن کی MacCoss لیبارٹری میں راتوں رات بھیج دیا گیا، جہاں LC-MS/MS کے نمونے کی تیاری مکمل ہو گئی تھی۔ گولی کو 50 μl میں 0.1% RapiGest میں 50 mM امونیم بائکاربونیٹ میں دوبارہ بند کریں اور پانی کے غسل میں سونیکیٹ کریں۔ گولی کے پروٹین کی حراستی کو بی سی اے کے ذریعے ماپا گیا تھا اور سپرنا کے نمونے سے ناپا گیا تھا۔ mM dithiothreitol (DTT؛ سگما)، 15 mM iodoacetamide (Sigma) کے ساتھ الکائیلیٹڈ اور ٹرپسنائزیشن کے ساتھ 1 گھنٹہ کے لیے 37 °C (1:0 50) پر انکیوبیٹ کیا گیا: ٹرپسن: سبسٹریٹ ریشو)۔ RapiGest کو 200 °C کے فالو کرنے کے لیے 37 ڈگری سینٹی گریڈ کے ساتھ 37 ڈگری سینٹی گریڈ تک بڑھایا گیا۔ ملبے کو ہٹانے کے لیے 45 منٹ اور 14,000 rpm پر 10 منٹ کے لیے سینٹرفیوگریشن۔ MAG پروٹوم کا اسی طرح کنواری مردوں سے تجزیہ کیا گیا۔ ہر ایک نمونے کے لیے دو تجزیاتی نقلوں کا تجزیہ کیا گیا۔ اس کے بعد، ہر ایک میں سے 1 µg کا تجزیہ 25-cm فیوزڈ سلیکا 75-μm کالم کے ساتھ 4-cm فیوزڈ سلیکا Kasil1 کے ساتھ کیا گیا۔ رال (Phenomenex) اور 180 منٹ کی مائع کرومیٹوگرافی۔ نمونہ ڈائجسٹ - MS/MS کو Q-Exactive HF ماس اسپیکٹومیٹر (تھرمو فشر) پر nanoACQUITY UPLC سسٹم (واٹرس) کے ساتھ چلایا گیا تھا۔ ہر رن کے لیے تیار کردہ ڈیٹا سے متعلقہ حصول کے ڈیٹا کو Proteowizard (ورژن 3.0.20287 کا استعمال کرتے ہوئے) mzML فارمیٹ میں تبدیل کیا گیا تھا۔ انوفیلس گیمبیا (ویکٹربیس ورژن 54) سے پروٹین کی ترتیب پر مشتمل ڈیٹا بیس، انوفیلس کالوزی A کی تلاش Mali-NIH (ویکٹربیس ورژن 54)، Saccharomyces cerevisiae (Uniprot، مارچ 2021) پر کی گئی، A. gambiae RNA-seqmint کے نام سے جانا جاتا ہیومن ٹرانسلیشنز، اور تھری پی پی کے نام سے جانا جاتا ہے۔ نقشہ سے مماثل FDRs کا تعین پرکولیٹر32 (ورژن 3.05) کا استعمال کرتے ہوئے 0.01 کی حد کے ساتھ کیا گیا تھا، اور لائم لائٹ 33 (ورژن 2.2.0) میں پروٹین پارسیمونی کا استعمال کرتے ہوئے پیپٹائڈس کو پروٹین کی شناخت میں جمع کیا گیا تھا۔ رشتہ دار پروٹین کی کثرت کا تخمینہ نارملائزڈ اسپیکٹرل این ایس اے ایف کے لیے ہر ایک پچھلی سپیکٹرل رن فیکٹ کے طور پر لگایا گیا تھا۔ بیان کیا گیا ہے۔ ہر پروٹین کے نسبت NSAF کا اوسط دو مختلف حیاتیاتی نقلوں سے نمونوں میں لگایا گیا تھا۔ 15N لیبلنگ نے خواتین پروٹوم کو کامیابی کے ساتھ نقاب پوش کیا، حالانکہ لیبل لگے ہوئے کنواریوں سے تھوڑی مقدار میں بغیر لیبل والے پروٹین کا پتہ لگایا جا سکتا ہے۔ HPLC کا نتیجہ "کیری اوور"۔ کبھی کبھار لیبل لگی کنواریوں سے 'آلودہ' کے طور پر پائے جانے والے پروٹین کو ضمنی جدول 1 میں درج کیا گیا ہے۔
Genscript میں دو antigenic peptides، QTTDRVAPAPDQQQ (آاسوٹائپ PA کے اندر) اور MESDGTTPSGDSEQ (آاسوٹائپ PA اور PB کے اندر)۔ دونوں پیپٹائڈس کو ملایا گیا، پھر کیریئر پروٹین KLH کے ساتھ جوڑ دیا گیا اور نیوزی لینڈ میں قربان ہونے کے بعد 4 پیپٹائڈز کو انجکشن لگایا گیا۔ کل آئی جی جی کو وابستگی صاف کرنے کے ذریعہ الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ انتہائی ای پی پی مخصوص خرگوش سے آئی جی جی کو مزید مغربی بلوٹنگ کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔
مغربی دھبوں کے لیے، MAG (n = 10، جہاں n حیاتیاتی طور پر آزاد مچھروں کے نمونوں کی تعداد کی نمائندگی کرتا ہے) اور مادہ LRT (n = 30) 4 دن کے کنواری مردوں اور کنواری یا زبردستی ملن والی خواتین (<10 بعد از ملاپ)، پروٹین نکالنے والا بفر (50 mH؛ %10؛ N40؛ 4 دن کے کنوارے)۔ 0.25% سوڈیم ڈی آکسیکولیٹ؛ 1 ایم ایم ای ڈی ٹی اے؛ 1× پروٹیز انحیبیٹر کاک ٹیل (روچ) کو الگ سے شامل کیا گیا تھا۔ 4 °C پر 20,000 g پروٹینز کی مقدار بریڈ فورڈ پرکھ (Bio-Rad) کے ذریعے طے کی گئی تھی۔ پھر، 20 µg MAG پروٹین، 40 µg LRT پروٹین، اور 20 µg بقایا بلک پروٹین کو منقطع کیا گیا تھا اور 10% bristeuffer کے ذریعے NuPristeff-Protine ٹرانسفر کیا گیا تھا۔ iBlot2 ٹرانسفر سسٹم (تھرمو فشر) کا استعمال کرتے ہوئے پولی وینیلائیڈین فلورائیڈ جھلیوں کو 1× PBS-T (PBS میں 0.1% Tween-20) میں دو بار دھویا گیا اور پھر Odyssey Blocking buffer (Li-Cor) میں 1 گھنٹے کے لیے 22°C پر حسب ضرورت شیکنیم کے ساتھ رات کو 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر بلاک کر دیا گیا۔ اینٹی ای پی پی پولی کلونل پرائمری اینٹی باڈی (1:700 بلاکنگ بفر میں) اور چوہا اینٹی ایکٹین مونوکلونل پرائمری اینٹی باڈی MAC237 (Abeam؛ 1:4,000)۔ جھلیوں کو PBS-T سے دھویا گیا اور پھر ثانوی اینٹی باڈیز (گدھا اینٹی خرگوش 800CW)، اور اینٹی ایکٹین 800CW، LT-6000 اور دونوں کو پی بی ایس ٹی سے دھویا گیا۔ 1:20,000) بلاکنگ بفر میں 0.01% SDS اور 0.2% Tween -20 پر مشتمل 1 گھنٹے کے لیے 22 °C پر۔ جھلیوں کو PBS-T سے دھویا گیا اور Odyssey CLx سکینر کے ساتھ امیج بنایا گیا۔ امیج اسٹوڈیو میں تصاویر اکٹھی کی گئیں اور اس پر کارروائی کی گئی۔ (82 kDa) کا پتہ نہیں چلا۔
EPP کے کوڈنگ والے علاقوں (آئسوفارم AGAP002463-RB جس میں histidine phosphatase ڈومین ہے، NCBI نے ڈومین سرچ 34 محفوظ کیا ہے) اور EcK2 (AGAP002181) کو pET-21a(+) پلازمیڈ (Novagen Millipur Sigma) میں کلون کیا گیا تھا۔ پرائمر توسیعی ڈیٹا ٹیبل 2 میں درج ہیں۔ PET-21a(+)-EcK2 کی تعمیر کے C-ٹرمینل 6xHis ٹیگ سے پہلے آٹھ GS4 لنکرز (ٹینڈم میں) داخل کیے گئے تھے۔ NEBExpress سیل فری E. کولی پروٹین سنتھیسس ری ایکشن (Biocombinant) کا استعمال کرتے ہوئے Recombinant پروٹین تیار کیے گئے تھے۔ NEBExpress Ni spin columns (New England BioLabs)۔Dihydrofolate reductase (DHFR) کنٹرول پروٹین NEBExpress Cell-free E. coli Protein Synthesis Kit سے DNA ٹیمپلیٹ کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ پروٹینز کو PBS میں 50% گلیسرول میں -20 °C تک -20 °C پر ذخیرہ کیا گیا تھا۔
EPP اور بافتوں کے نچوڑوں کی فاسفیٹیز سرگرمی 4-nitrophenyl فاسفیٹ (pNPP؛ Sigma-Aldrich) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا تھا۔ رد عمل کے بفر میں 25 mM Tris، 50 mM acetic ایسڈ، 25 mM Bis-Tris، 150 mM NaCl، 0.1 mTmo 0.1 mTmoised اور 150 ایم ایم ٹی ایم ای ڈی ٹی ایم ای ڈی ٹی ایم ای ڈی کی مقدار تھی۔ ری ایکشن بفر اور سیل کے ملبے کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے ہٹا دیا گیا۔ 2.5 ملی گرام ملی لیٹر-1 پی این پی پی پر مشتمل ری ایکشن بفر میں انزائم یا ٹشو ایکسٹریکٹ شامل کر کے رد عمل کا آغاز کریں۔ رد عمل کا مرکب کمرے کے درجہ حرارت پر اندھیرے میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور pNPP سے تبدیل ہونے والی pNP کی مقدار کو مختلف اوقات میں 4m کے حساب سے مقرر کیا گیا تھا۔
وٹرو EcK سرگرمی کے لیے، پروٹین کو 200 µl بفر (pH 7.5) میں 0.2 mg 20E یا 3D20E کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا جس میں 10 mM HEPES–NaOH، 0.1% BSA، 2 mM ATP اور 10 mM MgCl2 پر h2 °C کے رد عمل کو روک دیا گیا تھا۔ 800 µl میتھانول، پھر 1 گھنٹہ کے لیے -20 ° C پر ٹھنڈا کیا گیا، پھر 4 ° C پر 10 منٹ کے لیے 20,000 g پر سینٹرفیوگ کیا گیا۔ اس کے بعد HPLC-MS/MS کے ذریعے سپرنیٹنٹ کا تجزیہ کیا گیا۔ کنٹرول گروپ میں استعمال ہونے والے پروٹینوں کو گرمی سے غیر فعال کرنے کے لیے، پروٹین کو P2000 گرام میں 5 فیصد کے حساب سے پی سی بی ایس میں 5 منٹ کے اندر اندر کیا گیا تھا۔ 95°C
ان وٹرو ای پی پی سرگرمی کے لیے، پروٹین کو 3D20E22P (ایم اے جی کے 18 جوڑوں میں پائی جانے والی مقدار کے برابر، HPLC-MS/MS کے ذریعے صاف کیا گیا) 100 µl بفر (pH 7.5) میں 25 mM Tris، 50 mM ایسٹک ایسڈ، 25mM، 25mM، 250-mc، بفر میں شامل کیا گیا تھا۔ 0.1 mM EDTA، اور 1 mM DTT 3 گھنٹے کے لیے 27 °C پر۔ رد عمل کو 400 µl میتھانول ڈال کر روک دیا گیا اور 1 گھنٹے کے لیے -20 °C پر ٹھنڈا کیا گیا، پھر 4 °C پر 10 منٹ کے لیے 20,000 جی پر سینٹری فیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو HPLMS/C سے تجزیہ کیا گیا۔
EPP (362 bp)، EcK1 (AGAP004574, 365 bp) اور EcK2 (556 bp) کے لیے PCR کے ٹکڑے مخلوط جنس کے بغیر ہیڈ لیس مچھروں کے کیڈورس سے تیار کردہ cDNA سے بڑھا دیے گئے تھے۔ eGFP کنٹرول کے PCR ٹکڑے (495 bp سے) کو amplify کیا گیا تھا۔ پی سی آر پرائمر توسیعی ڈیٹا ٹیبل 2 میں درج ہیں۔ پی سی آر کا ٹکڑا pL4440 پلاسمیڈ پر الٹا T7 پروموٹرز کے درمیان داخل کیا گیا تھا۔ پلاسمڈ کنسٹرکٹس NEB 5-α قابل E. کولی (نیو انگلینڈ بائلابس) سے برآمد کیے گئے تھے اور استعمال سے پہلے ڈی این اے کی ترتیب کے ذریعے تصدیق کی گئی تھی (ڈیسرٹ پی ایس 1 میں استعمال کرنے سے پہلے)۔ T7 پروموٹر سے مماثل (توسیع شدہ ڈیٹا ٹیبل 2) کا استعمال pL4440 پر مبنی پلازمیڈ سے داخل کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ پی سی آر پروڈکٹ کے سائز کی تصدیق ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے کی گئی تھی۔ بیان کیا
dsRNA انجیکشن کے لیے، 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) کو 10 ng nl-1 کے ارتکاز میں بالغ مردوں یا عورتوں (نانوجیکٹ III، ڈرمنڈ) کے چھاتی میں انجکشن لگایا گیا تھا (نانوجیکٹ III، ڈرمنڈ) کم از کم 1 دن کے اندر اندر kdnog کی سطح پر کم از کم تین درجے کے درجے کا تعین کیا گیا تھا۔ آر این اے نکالنے، سی ڈی این اے کی ترکیب، اور RT-qPCR کے ذریعے حیاتیاتی نقلیں۔ ایکڈیسون انجیکشن کے لیے، 4 دن کی کنواری یا 6 دن کی کنواری خون پلائی جانے والی خواتین کو 0.13، 0.21، یا 0.63 µg کے 20Dumond 20E، IIIE پر انجکشن لگایا گیا تھا۔ بالترتیب 1.3، 2.1 کا ارتکاز، تجرباتی ڈیزائن یا 6.3 ng nl-1 پر منحصر ہے۔ پانی میں 10% (vol/vol) ایتھنول کا 100 nl انجیکٹ کریں۔ 10% ایتھنول میں 3D20E22P کا 100 nl (ایم اے جی کے جوڑے میں پائی جانے والی رقم کے 75% کے برابر)۔ مچھروں کو انجیکشن گروپ کو تصادفی طور پر تفویض کیا گیا تھا۔
سپوننگ اسیس کے لیے، 3 دن کی خواتین کو انسانی خون پر اشتہاری خوراک دی گئی تھی۔ جزوی طور پر کھلائے گئے یا کھلائے گئے مچھروں کو ہٹا دیں۔ علاج پر منحصر ہے، خواتین کو خون کے کھانے کے کم از کم 48 گھنٹے بعد چار راتوں تک الگ الگ سپوننگ کپ میں رکھا گیا تھا۔ انڈوں کو سٹیریوسکوپ کے تحت شمار کیا گیا تھا ملاپ شدہ خواتین کے لیے، انڈوں کو جو لاروا میں نکلتے ہیں، زرخیز تصور کیے جاتے تھے۔
میٹنگ ٹرائلز کے لیے، خواتین کو ملاوٹ کے خلاف مزاحمت پیدا کرنے کے علاج کے لحاظ سے کم از کم 2 دن کی اجازت دی گئی تھی، اور جنگلی قسم کے عمر سے مماثل مردوں کو بعد میں اسی پنجرے میں داخل کیا گیا تھا۔ دو راتوں کے بعد، مادہ فرٹیلائزڈ ویسیکلز کو الگ کر دیا گیا اور جینومک ڈی این اے کو فریز تھرو اور سونک کے ذریعے جاری کیا گیا۔ 1 mM EDTA، اور 25 mM NaCl (pH 8.2)۔ نمونے پروٹیناز K (0.86 µg µl-1) کے ساتھ 55 °C پر 15 منٹ کے لیے لگائے گئے، اس کے بعد 95 °C پر 10 منٹ۔ کروموسوم کی ترتیب؛ پرائمر کو توسیعی ڈیٹا ٹیبل 2 میں درج کیا گیا ہے۔ Y کروموسوم کی ترتیب کی عدم موجودگی کسی ملاوٹ کی نشاندہی کرتی ہے۔
دوبارہ ملاپ کے اسسز کے لیے، جبری میٹنگ کی گئی خواتین کی میٹنگ پلگ کی موجودگی کے لیے جانچ کی گئی تاکہ ملن کی حیثیت کی تصدیق کی جا سکے اور مردوں کی غیر موجودگی میں ملن کے لیے اضطراب پیدا کرنے کے لیے 2 دن کا وقت دیا گیا، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے 36 . DsRed ٹرانسجینک سپرم لے جانے والے مردوں کو پھر خواتین کے پنجروں میں متعارف کرایا گیا تھا۔ دو راتوں کے بعد، خواتین کو زنجیروں سے الگ کیا گیا، جینومک ڈی این اے تیار کیا گیا تھا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے اور اسے DsRed ٹرانسجن کی qPCR کا پتہ لگانے کا نشانہ بنایا گیا ہے۔ پرائمر توسیعی ڈیٹا ٹیبل 2 میں درج ہیں۔ DsRed ٹرانسجن کی عدم موجودگی نے اشارہ کیا کہ دوبارہ ملاپ نہیں ہوا۔
3D20E کی ترکیب کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا 37 .مختصر طور پر، 10 ملی گرام 20E (سگما-الڈرچ) کو 10 ملی لیٹر پانی میں تحلیل کیا گیا تھا، اس کے بعد 30 ملی گرام پلاٹینم بلیک (پاؤڈر کی شکل میں، سگما-الڈرچ) کا اضافہ کیا گیا تھا۔ درجہ حرارت۔ 6 گھنٹے کے بعد، رد عمل کو روکنے کے لیے 30 ملی لیٹر میتھانول شامل کیا گیا۔ اتپریرک ذرات کو ہٹانے کے لیے مرکب کو سینٹری فیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو کمرے کے درجہ حرارت پر ویکیو میں خشک ہونے کے لیے بخارات بنا دیا گیا۔ خشک رد عمل کی مصنوعات کو 10٪ ایتھانول اور میتھانول میں تحلیل کر دیا گیا تاکہ HPLC-2010 کے لیے انجیکشن کی شرح میں اضافہ ہو سکے۔ 3D20E) تقریباً 97% تھا (تصویر 4b)، اور ترکیب شدہ 3D20E کا MS اسپیکٹرم مماثل تھا جو ملن والی خواتین میں پایا جاتا ہے (تصویر 4c)۔
لیجنڈ میں کئے گئے شماریاتی ٹیسٹوں کی مخصوص تفصیلات شامل ہیں۔ گراف پیڈ (ورژن 9.0) کا استعمال فشر کے عین مطابق ٹیسٹ، مینٹل-کاکس ٹیسٹ، اور طالب علم کے ٹی-ٹیسٹ کو انجام دینے کے لیے کیا گیا تھا۔ کوکران-مینٹل-ہانسزل ٹیسٹ حسب ضرورت R اسکرپٹ (https://github/distributed.com پر دستیاب ہے) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تھے۔ 0.05 کی اہمیت کی حد کے ساتھ Shapiro-Wilk ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے نارملٹی کے لیے۔ جب ڈیٹا نارملٹی ٹیسٹ میں ناکام ہوا، تو Mann-Whitney ٹیسٹ کیا گیا۔ Mantel-Cox ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے بقا کے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔ DESeq2 پیکیج (ورژن 1.28.1) کو RNA-seq2 پیکیج (ورژن 1.28.1) کا استعمال کیا گیا۔ گراف پر بار میڈین کی نمائندگی کرتا ہے۔ P = 0.05 کی ایک اہمیت کی قیمت تمام ٹیسٹوں کے لیے حد کے طور پر استعمال کی گئی تھی۔
مطالعہ کے ڈیزائن کے بارے میں مزید معلومات کے لیے، اس مضمون سے منسلک نیچر ریسرچ رپورٹ کا خلاصہ دیکھیں۔
MS پروٹومک ڈیٹا کو ڈیٹاسیٹ شناخت کنندہ PXD032157 کے ساتھ PRIDE پارٹنر ریپوزٹری (https://www.ebi.ac.uk/pride/) کے ذریعے ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) میں جمع کیا گیا تھا۔
RNA-seq ڈیٹاسیٹ کو GSE198665 کے سیریل ریکارڈ کے تحت جین ایکسپریشن کمپری ہینسو لائبریری (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) میں جمع کیا جاتا ہے۔
موجودہ مطالعے کے دوران تیار کردہ اور/یا تجزیہ کیے گئے اضافی ڈیٹاسیٹس متعلقہ مصنفین سے معقول درخواست پر حاصل کیے جا سکتے ہیں۔ یہ مضمون ماخذ ڈیٹا فراہم کرتا ہے۔
De Loof, A. Ecdysteroids: neglected insect sex steroids? Male: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
ریڈفرن، CPF 20-hydroxyecdysone اور انوفلیس سٹیفنز میں رحم کی نشوونما۔ کیڑے کی فزیالوجی.28، 97–109 (1982)۔