سیل کی کمپارٹمنٹلائزیشن اور ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے کے لیے خفیہ راستے میں پروٹین کی چھانٹی ضروری ہے۔ شیل ثالثی چھانٹنے کے علاوہ، خفیہ نقل و حمل کے عمل میں کائنسین چھانٹنے میں لپڈس کا کردار ایک دیرینہ بنیادی سوال ہے جس کا ابھی تک جواب نہیں دیا گیا ہے۔ یہاں، ہم Vivo میں یہ ثابت کرنے کے لیے 3D بیک وقت ملٹی کلر ہائی ریزولوشن ریئل ٹائم امیجنگ کرتے ہیں کہ بہت لمبے سیرامائیڈ لپڈ موئیٹیز کے ساتھ نئے ترکیب شدہ glycosylphosphatidylinositol-immobilized پروٹین کلسٹرڈ ہیں اور خصوصی اینڈوپلازم نیٹ ایگزٹ سائٹ میں درجہ بندی کیے گئے ہیں، جو کہ ٹرانسمے کے ذریعے استعمال ہونے والے پروٹین سے مختلف ہے۔ اس کے علاوہ، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ اینڈوپلاسمک ریٹیکولم جھلی میں سیرامائڈ کی زنجیر کی لمبائی اس چھانٹنے کے انتخاب کے لیے اہم ہے۔ ہمارا مطالعہ لیپڈ چین کی لمبائی کی بنیاد پر پروٹین کارگوز کو سیکرٹری پاتھ وے میں سلیکٹیو ایکسپورٹ سائٹس میں درجہ بندی کرنے کے لیے پہلا ڈائریکٹ ان ویوو ثبوت فراہم کرتا ہے۔
یوکرائیوٹک خلیوں میں، اینڈوپلاسمک ریٹیکولم (ER) میں ترکیب شدہ پروٹین کو پھر ان کی مناسب سیلولر منزل (1) تک پہنچانے کے لیے خفیہ راستے کے ذریعے نقل و حمل کے دوران ترتیب دیا جاتا ہے۔ کوٹ ثالثی چھانٹنے کے علاوہ، یہ طویل عرصے سے قیاس کیا گیا تھا کہ بعض لپڈز مخصوص جھلیوں کے ڈومینز میں کلسٹر کر کے منتخب ایگزٹ پوائنٹس کے طور پر بھی کام کر سکتے ہیں جو مخصوص پروٹین (2-5)۔ تاہم، اس ممکنہ لپڈ پر مبنی میکانزم کو ثابت کرنے کے لیے vivo میں براہ راست ثبوت کی کمی ہے۔ اس بنیادی مسئلے کو حل کرنے کے لیے، ہم نے خمیر میں مطالعہ کیا کہ کس طرح glycosylphosphatidylinositol (GPI) اینکرڈ پروٹین (GPI-APs) کو ER سے مختلف طریقے سے برآمد کیا جاتا ہے۔ GPI-APs لپڈ سے منسلک سیل سطح کے پروٹین کی ایک قسم ہیں (6، 7)۔ GPI-AP ایک خفیہ پروٹین ہے جو پلازما جھلی کے بیرونی لیفلیٹس سے گلائکولپڈ موئیٹی (GPI اینکر) کے ذریعے منسلک ہوتا ہے۔ وہ ER lumen (8) میں GPI اینکرز کو قدامت پسند پوسٹ ٹرانسلیشنل ترمیم کے طور پر قبول کرتے ہیں۔ منسلک ہونے کے بعد، GPI-AP گولگی اپریٹس (5، 9) سے گزرتا ہے ER سے پلازما جھلی تک۔ GPI اینکرز کی موجودگی GPI-AP کو ٹرانس میبرن سیکریٹڈ پروٹین (بشمول دیگر پلازما میمبرین پروٹینز) سے سیکریٹری پاتھ وے (5, 9, 10) سے الگ منتقل کرنے کا سبب بنتی ہے۔ خمیر کے خلیوں میں، GPI-APs کو اینڈوپلاسمک ریٹیکولم میں دوسرے خفیہ پروٹینوں سے الگ کیا جاتا ہے، اور پھر کوٹ پروٹین کمپلیکس II (COPII) (6، 7) کے ذریعے لپیٹے ہوئے منفرد vesicles میں پیک کیا جاتا ہے۔ ER برآمدی عمل میں اس درجہ بندی کے عمل کے تعین کرنے والے واضح نہیں ہیں، لیکن یہ قیاس کیا جاتا ہے کہ اس طریقہ کار کے لیے لپڈز کی ضرورت ہو سکتی ہے، خاص طور پر GPI اینکر کے لپڈ حصے کی ساختی دوبارہ تشکیل (5, 8)۔ خمیر میں، GPI لپڈ کو دوبارہ بنانے کا عمل GPI کے منسلک ہونے کے فوراً بعد شروع ہوتا ہے، اور بہت سے معاملات میں، یہ سیرامائیڈ کو 26-کاربن لانگ چین سیچوریٹڈ فیٹی ایسڈ (C26:0) (11، 12) سے منسلک کرتا ہے۔ C26 سیرامائڈ اب تک خمیر کے خلیوں کے ذریعہ تیار کردہ اہم سیرامائڈ ہے۔ یہ ER میں ترکیب کیا جاتا ہے اور اس کا بیشتر حصہ COPII vesicles (13) کے ذریعے گولگی اپریٹس کو برآمد کیا جاتا ہے۔ GPI-AP کی ER برآمد کے لیے خاص طور پر جاری سیرامائیڈ کی ترکیب (14, 15) کی ضرورت ہوتی ہے، اور اس کے نتیجے میں، گولگی اپریٹس میں سیرامائیڈ کی inositol فاسفیٹ سیرامائیڈ (IPC) میں تبدیلی GPI اینکر ترکیب (16) پر منحصر ہوتی ہے۔ مصنوعی جھلیوں کے ساتھ بائیو فزیکل اسٹڈیز نے یہ ظاہر کیا ہے کہ بہت لمبی ایسیل چین سیرامائڈز مل کر ترتیب شدہ ڈومینز کو منفرد جسمانی خصوصیات کے ساتھ تشکیل دے سکتے ہیں (17, 18)۔ یہ اعداد و شمار اس مفروضے کی طرف لے جاتے ہیں کہ C26 سیرامائڈ کے ساتھ C26 سیرامائڈ اور GPI-AP نسبتاً گندے ER جھلی لپڈ ماحول میں منظم علاقوں یا خطوں میں یکجا ہونے کے لیے اپنی جسمانی خصوصیات کا استعمال کرتے ہیں۔ یہ بنیادی طور پر مختصر اور غیر سیر شدہ گلیسرولپڈس (C16:1 اور C18:1) (19، 20) پر مشتمل ہے۔ ان علاقوں کو منتخب طور پر مخصوص ER ایگزٹ سائٹس (ERES) پر فوکس کیا جائے گا، جہاں سیرامائیڈ اور سیرامائیڈ پر مبنی GPI-AP کو ایک ہی سرشار COPII vesicle (5) میں گولگی میں باہم منتقل کیا جا سکتا ہے۔
اس مطالعے میں، ہم نے سپر ریزولوشن کنفوکل ریئل ٹائم امیجنگ مائیکروسکوپی (SCLIM) کا استعمال کرتے ہوئے اس لپڈ پر مبنی میکانزم کا براہ راست تجربہ کیا ہے، جو کہ ایک جدید ترین مائکروسکوپی تکنیک ہے جو بیک وقت فلوروسینٹ لیبل والے پروٹین کا مشاہدہ کر سکتی ہے، تین رنگ اور تین جہتی (3D) تصاویر، انتہائی 2 ریزولوشن سیلز (2 ریزولوشن) میں انتہائی تیز رفتاری کے ساتھ موجود ہیں۔
ہم نے پہلے SCLIM ٹکنالوجی کو مزید وضاحت کرنے کے لیے استعمال کیا کہ کس طرح C26 سیرامائیڈ گروپ کے ساتھ نارمل GPI-AP کو S. cerevisiae میں ER چھوڑنے کے بعد transmembrane secreted proteins سے اسکرین کیا گیا۔ ER کی درجہ بندی کو چیک کرنے کے لیے، ہم نے ایک جینیاتی نظام کا استعمال کیا جو Vivo (7, 23) میں ERES میں داخل ہونے والے نئے ترکیب شدہ کارگو کو براہ راست دیکھ سکتا ہے۔ کارگو کے طور پر، ہم نے C26 سیرامائیڈ پر مبنی GPI-AP Gas1 کا انتخاب کیا جس کا لیبل گرین فلوروسینٹ پروٹین (GFP) اور ٹرانس میبرن سیکریٹ پروٹین Mid2 کے ساتھ قریب اورکت فلوروسینٹ پروٹین (iRFP) کا لیبل لگا ہوا ہے، یہ دونوں ہی پلازما جھلی (24–26) کو نشانہ بناتے ہیں۔ Sec31-1 درجہ حرارت سے متعلق حساس اتپریورتی میں، ان دو کارگوز کا اظہار ایک galactose-inducible پروموٹر اور ایک ERES مارکر کے تحت کیا جاتا ہے۔ انتہائی درجہ حرارت (37°C) پر، کیونکہ sec31-1 اتپریورتن COPII کوٹ جزو Sec31 کے فنکشن کو متاثر کرتا ہے تاکہ COPII انکرن اور ER برآمد کو روکا جا سکے، ER (23) میں نیا ترکیب شدہ کارگو جمع ہوتا ہے۔ کم درجہ حرارت (24 ° C) پر ٹھنڈا ہونے کے بعد، sec31-1 اتپریورتی خلیات خفیہ علاقے سے برآمد ہوئے، اور جمع شدہ نیا مصنوعی کارگو ER سے برآمد ہونا شروع ہوا۔ CLIM تصور سے پتہ چلتا ہے کہ زیادہ تر نئے ترکیب شدہ Gas1-GFP اور Mid2-iRFP اب بھی 37 ° C پر انکیوبیشن کے بعد sec31-1 اتپریورتی خلیوں کے ER میں جمع ہوتے ہیں اور پھر 5 منٹ کے لئے 24 ° C پر جاری ہوتے ہیں (شکل 1)۔ چونکہ Mid2-iRFP پوری ER جھلی پر تقسیم کیا جاتا ہے، اور Gas1-GFP متمرکز ER جھلی کے علاقے میں اکٹھا ہوتا ہے، اس لیے ان کی تقسیم بالکل مختلف ہے (شکل 1، A سے C اور Movie S1)۔ اس کے علاوہ، جیسا کہ شکل 1D میں دکھایا گیا ہے، Gas1-GFP کلسٹر میں Mid2-iRFP نہیں ہے۔ ان نتائج سے ظاہر ہوتا ہے کہ GPI-AP اور transmembrane پروٹین کو مختلف ER جھلی والے خطوں میں ابتدائی طور پر الگ کر دیا گیا تھا۔ Gas1-GFP کلسٹر ایک مخصوص ERES سے ملحق ہے جس کا لیبل mCherry کے COPII کوٹ پروٹین Sec13 (شکل 1، E اور F، اور فلم S1) (23) کے ساتھ ہے۔
sec31-1 خلیات galactose-حوصلہ افزائی رطوبتوں کا اظہار کرتے ہیں، ایک لمبی acyl چین (C26) سیرامائڈ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP، سبز) اور ٹرانس میبرن پروٹین Mid2-iRFP (TMP، نیلا) اور یہ تعمیری ERES لیبلنگ Sec13-mincubented 7C پر تھا 30 منٹ، 24 ° C پر منتقل کیا گیا، اور 5 منٹ بعد SCLIM کی طرف سے تصویر بنائی گئی۔ (A سے C) ہوائی جہاز (A) کی نمائندہ ضم شدہ یا سنگل 2D تصویر، 10 z-سیکشنز (B) کی 2D پروجیکشن امیج یا کارگو اور ERES مارکر (C) کی 3D سیل نصف کرہ کی تصویر دکھاتا ہے۔ اسکیل بار 1μm (A اور B)۔ اسکیل یونٹ 0.551μm (C) ہے۔ Gas1-GFP کا پتہ مجرد ER علاقوں یا کلسٹرز میں ہوا، جبکہ Mid2-iRFP کا پتہ چلا اور پورے ER جھلی (C) میں تقسیم کیا گیا۔ (D) گراف سفید تیر کی لکیر (بائیں) کے ساتھ Gas1-GFP کلسٹر میں Gas1-GFP اور Mid2-iRFP کی نسبتہ فلوروسینس کی شدت کو ظاہر کرتا ہے۔ AU، صوابدیدی اکائی۔ (E اور F) 3D تصویر کی نمائندگی کرتے ہیں جو سامان اور ERES نشان کو یکجا کرتی ہے۔ مخصوص ERES کے قریب Gas1-GFP کلسٹرز کا پتہ چلا۔ اسکیل یونٹ 0.551μm ہے۔ (F) سفید ٹھوس تیر ERES سے وابستہ Gas1-GFP کلسٹر کو نشان زد کرتا ہے۔ درمیانی اور دائیں پینل ضم شدہ بڑھی ہوئی 3D تصویر اور منتخب کردہ Gas1-GFP کلسٹر کا گھمایا ہوا منظر دکھاتے ہیں۔
Gas1-GFP کلسٹر اور ایک مخصوص ERES کے درمیان قریبی مقامی رشتہ اشارہ کرتا ہے کہ Gas1-GFP سلیکٹیو ERES میں داخل ہو سکتا ہے، جو ER کو چھوڑنے کے لیے Mid2-iRFP کے استعمال کردہ سلیکٹیوٹی سے مختلف ہے۔ اس امکان کو حل کرنے کے لیے، ہم نے صرف ایک یا دو اشیا (شکل 2، A سے C) کے لیے ERES تناسب کی مقدار درست کی۔ ہم نے پایا کہ زیادہ تر ERES (70%) میں صرف ایک قسم کا کارگو ہوتا ہے۔ شکل 2C کی نچلی تصویر صرف Gas1-GFP (شکل 1) یا صرف Mid2-iRFP (شکل 2) کے ساتھ ERES کی دو عام مثالیں دکھاتی ہے۔ اس کے برعکس، تقریباً 20% ERES میں دو کارگو ہوتے ہیں جو ایک ہی علاقے میں اوورلیپ ہوتے ہیں۔ یہ پایا گیا کہ کچھ ERES (10%) میں دو قسم کے کارگو تھے، لیکن وہ واضح طور پر مختلف علاقوں میں الگ تھلگ تھے۔ لہذا، یہ شماریاتی تجزیہ ظاہر کرتا ہے کہ ER برآمد ہونے کے بعد، GPI-AP Gas1-GFP اور ٹرانس میبرن کارگو Mid2-iRFP کو مختلف ERES (شکل 2D) میں تقسیم کیا گیا ہے۔ چھانٹنے کی یہ کارکردگی پچھلے بائیو کیمیکل تجزیہ (6) اور مورفولوجیکل تعین (7) کے ساتھ بہت مطابقت رکھتی ہے۔ ہم ERES میں داخل ہونے والے قرنطینہ کارگو کے رویے کا بھی مشاہدہ کر سکتے ہیں (شکل 2E اور مووی S2)۔ شکل 2E ظاہر کرتا ہے کہ Gas1-GFP (پینل 3) یا Mid2-iRFP (پینل 4) کا صرف ایک چھوٹا سا حصہ ایک طرف سے ERES میں داخل ہوتا ہے اور ایک مجرد علاقے میں محدود ہے۔ شکل 2E کا پینل 5 ظاہر کرتا ہے کہ Gas1-GFP اور Mid2-iRFP بعض اوقات ایک ہی ERES میں پائے جاتے ہیں، لیکن وہ مختلف اطراف سے داخل ہوتے ہیں اور الگ الگ علاقوں میں مرتکز ہوتے ہیں جو مختلف COPII vesicles کی نمائندگی کر سکتے ہیں۔ ہم نے اس بات کی بھی تصدیق کی کہ C26 سیرامائیڈ پر مبنی GPI-AP Gas1 کی سلیکٹیو ERES کے طور پر مشاہدہ شدہ علیحدگی اور درجہ بندی مخصوص ہے کیونکہ ایک اور ٹرانس میبرن سیکریشن کارگو، GFP- ٹیگ شدہ پلازما میمبرین پروٹین Axl2 (27)، Mid2-iRFP سے ملتا جلتا رویہ دکھاتا ہے۔ (تصویر S1 اور فلم S3)۔ نئے ترکیب شدہ Axl2-GFP کو ER جھلی کے ذریعے تقسیم کیا جاتا ہے جیسے Mid2-iRFP (Figure S1, A اور B)، اور زیادہ تر ERES میں Mid2-iRFP کے ساتھ باہم مقامی ہے (شکل S1، B سے D)۔ شکل 1 کے پینلز 1 اور 2۔ S1C ERES کی دو عام مثالیں دکھاتا ہے جہاں دو ٹرانس میبرن کارگوز اوورلیپ ہوتے ہیں۔ ان صورتوں میں، دونوں سامان ایک ساتھ ERES میں داخل ہوتے ہیں (Figure S1E، Panel 3 اور Movie S3)۔
galactose inducible رطوبتوں کا اظہار کرنے والے sec31-1 خلیات، Gas1-GFP (GPI-AP، سبز) اور Mid2-iRFP (TMP، نیلے رنگ) اور تشکیلاتی ERES لیبلنگ Sec13-mCherry (ERES، magenta) کو 37 پر رکھا گیا تھا، 30 منٹ تک انکیوبٹنگ کے بعد، °C پر 30 منٹ تک انکیوبٹنگ کے بعد، تصویر کو 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر بلاک کر دیا گیا 20 منٹ کے بعد SCLIM کے ساتھ۔ (A سے C) نمائندہ 2D پروجیکشن امیجز (A؛ اسکیل بار، 1μm) یا 3D سیل ہیمسفیئر امیجز (B اور C؛ اسکیل یونٹ، 0.456μm) کارگو اور 10 z-سیکشنز جن پر ERES کا نشان لگایا گیا ہے۔ (B) میں نچلا پینل اور (C) میں پینل صرف ERES (میجنٹا) [Gas1-GFP (گرے) اور Mid2-iRFP (ہلکا نیلا)] میں موجود سامان کو دکھانے کے لیے پروسیس شدہ تصاویر دکھاتا ہے۔ (C) کھلا تیر: ERES صرف ایک کارگو (1 سے 4) لے جاتا ہے۔ گرے ایرو: ERES میں الگ الگ کارگو ہوتا ہے (5)۔ سفید ٹھوس تیر: ERES جس میں شریک کارگو ہوتا ہے۔ ذیل میں: منتخب کردہ واحد ERES میں صرف Gas1-GFP (1) یا Mid2-iRFP (2) شامل ہیں۔ اسکیل بار، 100 این ایم۔ (D) فوٹومیکروگراف کی مقدار (C) میں بیان کی گئی ہے۔ ERES کا اوسط فیصد جس میں صرف ایک کارگو (Gas1-GFP یا Mid2-iRFP)، الگ شدہ کارگو اور اوورلیپنگ کارگو ہوتا ہے۔ تین آزاد تجربوں میں، n = 432 54 خلیوں میں۔ ایرر بار = SD۔ دو دم والا غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ۔ *** P = 0.0002۔ (E) قرنطینہ کارگو کے منتخب کردہ ERES کی 3D تصویر (C) کے ساتھ نشان زد۔ Gas1-GFP (سبز) (3) یا Mid2-iRFP (نیلا) (4) ایک طرف سے ERES (magenta) میں داخل ہوتا ہے اور ERES کے اندر ایک چھوٹے سے علاقے تک محدود ہے۔ بعض اوقات، دونوں قسم کے کارگو ایک ہی طرف سے ایک ہی ERES (5) میں داخل ہوتے ہیں اور ERES کے اندر ایک الگ تھلگ جگہ تک محدود رہتے ہیں۔ اسکیل بار، 100 این ایم۔
اس کے بعد، ہم نے ایک مفروضے کا تجربہ کیا کہ ER جھلی میں موجود لمبی acyl چین سیرامائیڈ (C26) گیس1 کی مخصوص جھرمٹ اور چھانٹی کو منتخب ERES میں چلاتی ہے۔ اس مقصد کے لیے، ہم نے ایک ترمیم شدہ خمیری تناؤ GhLag1 کا استعمال کیا، جس میں دو endogenous ceramide synthases Lag1 اور Lac1 کو GhLag1 (روئی کا Lag1 homolog) سے تبدیل کیا گیا، جس کے نتیجے میں خمیر کا تناؤ سیل جھلی کے ساتھ سیرامائیڈ تناؤ کی صورت میں جنگلی F2 سے چھوٹا ہوتا ہے۔ ماس اسپیکٹومیٹری (ایم ایس) کے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ جنگلی قسم کے تناؤ میں، کل سیرامائیڈ کا 95% بہت لمبا ہوتا ہے (C26) چین سیرامائیڈ، جبکہ GhLag1 میں، 85% سیرامائیڈ بہت لمبا ہوتا ہے (C18 اور C16)۔ )، صرف 2% سیرامائیڈ بہت لمبی (C26) چین سیرامائیڈ ہے۔ اگرچہ C18 اور C16 سیرامائڈز GhLag1 جھلی میں اب تک پائے جانے والے اہم سیرامائڈز ہیں، لیکن MS تجزیہ نے بھی اس بات کی تصدیق کی ہے کہ GPI اینکر گیس1-GFP کے GPI اینکر میں جس کا اظہار GhLag1 سٹرین میں کیا گیا ہے C26 سیرامائیڈ پر مشتمل ہے، جو جنگلی قسم کے لپڈس سے موازنہ ہے۔ معیار ایک ہی ہے (تصویر 3A) (26)۔ لہذا، اس کا مطلب ہے کہ سیرامائیڈ کو دوبارہ بنانے والا انزائم Cwh43 C26 سیرامائیڈ کے لیے انتہائی منتخب ہے، جیسا کہ شکل 26 میں دکھایا گیا ہے، یہ ترجیحی طور پر GPI اینکر کو GhLag1 سٹرین میں C26 سیرامائیڈ کی تھوڑی مقدار سے شامل کرتا ہے۔ S2 (29)۔ اس کے باوجود، GhLag1 کی سیل جھلی میں بنیادی طور پر صرف C18-C16 سیرامائیڈ ہوتا ہے، جبکہ Gas1-GFP میں اب بھی C26 سیرامائیڈ ہوتا ہے۔ یہ حقیقت اس تناؤ کو خاص طور پر ER میں جھلی سیرامائیڈ کی acyl چین کی لمبائی کے مسئلے کو حل کرنے کے لیے ایک مثالی ذریعہ بناتی ہے۔ کلاس اور چھانٹی کا فرضی کردار۔ اس کے بعد، ہم نے پہلے C26 Gas1-GFP کی روایتی فلوروسینس مائیکروسکوپی کے ذریعے sec31-1 کے درجہ حرارت سے متعلق حساس اتپریورتی ایلیل کے ساتھ GhLag1 میں کلسٹرز میں جمع ہونے کی صلاحیت کا مطالعہ کیا، جہاں صرف طویل (C18-C16) سلسلہ ER جھلی سیرامائیڈ (3) میں موجود ہے۔ ہم نے مشاہدہ کیا کہ sec31-1 میں، Gas1-GFP کا زیادہ تر کلسٹرز میں مرتکز تھا، جبکہ Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 میں لمبی (C18-C16) لمبی سیرامائیڈ ER جھلی بنیادی طور پر کلسٹرڈ نہیں تھی اور پوری ER جھلی میں تقسیم نہیں کی گئی تھی۔ قطعی طور پر، کیونکہ C26 سیرامائڈ پر مبنی کلسٹرنگ کا مخصوص ERES (شکل 1) سے گہرا تعلق ہے، ہم نے اگلی تفتیش کی کہ آیا اس عمل میں ER ایکسپورٹ پروٹین میکانزم کا کام بھی شامل ہو سکتا ہے۔ GPI-AP ER ایکسپورٹ کے لیے ایک خصوصی COPII سسٹم استعمال کرتا ہے، جو GPI اینکر (30, 31) کے گلیکن حصے کی Ted1 کی ساختی دوبارہ تشکیل کے ذریعے فعال طور پر منظم ہوتا ہے۔ اس کے بعد دوبارہ پیدا ہونے والے GPI-glycan کو ٹرانس میبرن کارگو ریسیپٹر p24 کمپلیکس کے ذریعے پہچانا جاتا ہے، جس کے نتیجے میں منتخب طور پر Lst1 کو بھرتی کیا جاتا ہے، جو COPII کارگو بائنڈنگ سبونائٹ Sec24 کا ایک مخصوص آئسفارم ہے، جس سے GPI-AP سے بھرپور COPII Vesicles ضروری ہیں (31-33)۔ لہذا، ہم نے ایک ڈبل اتپریورتی بنایا جس نے ان واحد پروٹینز (p24 پیچیدہ جزو Emp24، GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 اور مخصوص COPII subunit Lst1) کو sec31-1 اتپریورتی تناؤ کے ساتھ ملایا، اور ان کا مطالعہ کیا کہ کیا یہ ممکن ہے کہ GsFP-cluster (GasF1-cluster) کی تشکیل ہو۔ ہم نے مشاہدہ کیا کہ sec31-1emp24Δ اور sec31-1ted1Δ میں، Gas1-GFP بنیادی طور پر غیر کلسٹرڈ ہے اور پورے ER جھلی میں تقسیم کیا جاتا ہے، جیسا کہ پہلے sec31-1 GhLag1 میں دیکھا گیا تھا، جبکہ sec31-1lst1Δ میں، Gas1-GFP کی طرح sec31-1۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ER جھلی میں C26 سیرامائیڈ کی موجودگی کے علاوہ، Gas1-GFP کے جھرمٹ کو بھی p24 کمپلیکس سے منسلک ہونے کی ضرورت ہے، اور اس کے لیے مخصوص Lst1 بھرتی کی ضرورت نہیں ہے۔ پھر، ہم نے اس امکان کی کھوج کی کہ ER جھلی میں سیرامائیڈ کی زنجیر کی لمبائی گیس1-GFP کے p24 کے پابند ہونے کو منظم کر سکتی ہے۔ تاہم، ہم نے پایا کہ جھلی میں C18-C16 سیرامائیڈ کی موجودگی p24 کمپلیکس (اعداد و شمار S3 اور S4، A اور B) کے ذریعے دوبارہ تشکیل پانے والے GPI-glycans یا GPI-AP سے منسلک ہونے اور GPI-AP کو برآمد کرنے پر اثر انداز نہیں ہوتی ہے۔ صلاحیت COPII ذیلی قسم Lst1 (فگر S4C) کو بھرتی کریں۔ لہذا، C26 سیرامائڈ پر منحصر کلسٹرنگ کو مختلف ER ایکسپورٹ پروٹین میکانزم کے ساتھ پروٹین کے تعامل کی ضرورت نہیں ہے، لیکن لپڈ کی لمبائی سے چلنے والے متبادل چھانٹنے کے طریقہ کار کی حمایت کرتا ہے۔ پھر، ہم نے تجزیہ کیا کہ آیا ER جھلی میں سیرامائڈ ایسیل چین کی لمبائی Gas1-GFP کی منتخب ERES کے طور پر موثر درجہ بندی کے لیے اہم ہے۔ چونکہ شارٹ چین سیرامائیڈ کے ساتھ GhLag1 سٹرین میں Gas1 ER کو چھوڑ کر پلازما میمبرین (Figure S5) میں داخل ہوتا ہے، ہمارا ماننا ہے کہ اگر چھانٹی سیرامائیڈ acyl چین کی لمبائی سے چلتی ہے تو GhLag1 سٹرین میں Gas1 کو ری ڈائریکٹ اور کراس کیا جا سکتا ہے۔ ایک ہی جھلی کے ساتھ ERES سامان۔
(A) GhLag1 کی سیل جھلی میں بنیادی طور پر چھوٹے C18-C16 ceramides ہوتے ہیں، جبکہ Gas1-GFP کے GPI اینکر میں اب بھی وہی C26 IPC ہوتا ہے جیسا کہ جنگلی قسم کے خلیات۔ اوپر: جنگلی قسم (Wt) کے سیل جھلی میں سیرامائڈ کا acyl چین کی لمبائی کا تجزیہ اور ماس اسپیکٹومیٹری (MS) کے ذریعہ GhLag1p تناؤ۔ ڈیٹا کل سیرامائڈ کی فیصد کی نمائندگی کرتا ہے۔ تین آزاد تجربوں کی اوسط۔ ایرر بار = SD۔ دو دم والا غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ۔ **** P ＜0.0001۔ نیچے کا پینل: Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI اینکر میں موجود IPC کی acyl چین کی لمبائی کا MS تجزیہ جنگلی قسم اور GhLag1p تناؤ میں ظاہر کیا گیا ہے۔ ڈیٹا کل IPC سگنل کے فیصد کی نمائندگی کرتا ہے۔ پانچ آزاد تجربوں کا اوسط۔ ایرر بار = SD۔ دو دم والا غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ۔ ns، اہم نہیں. پی = 0.9134۔ (B) sec31-1، sec31-1 GhLag1، sec31-1emp24Δ، sec31-1ted1Δ اور sec31-1lst1Δ خلیوں کے فلوروسینس مائیکروگرافس جو کہ گیلیکٹوز سے متاثرہ Gas1-GFP کا اظہار کرتے ہیں کو 37 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا اور 30 ​​منٹ تک مائیکرو کوورائنس کے بعد مائیکرو کیوریٹ پر منتقل کیا گیا تھا۔ 24°C سفید تیر: ER Gas1-GFP کلسٹر۔ کھلا تیر: غیر کلسٹرڈ Gas1-GFP پوری ER جھلی پر تقسیم کیا جاتا ہے، جو ER کی خصوصیت والے جوہری رنگ کے داغ کو دکھاتا ہے۔ اسکیل بار، 5μm۔ (C) فوٹومیکروگراف کی مقدار (B) میں بیان کی گئی ہے۔ punctate Gas1-GFP ڈھانچہ والے خلیوں کی اوسط فیصد۔ تین آزاد تجربوں میں، n≥300 خلیات۔ ایرر بار = SD۔ دو دم والا غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ۔ **** P ＜0.0001۔
اس مسئلے کو براہ راست حل کرنے کے لیے، ہم نے GhLag1 میں گیس 1-GFP اور Mid2-iRFP کا SCLIM ویژولائزیشن sec31-1 درجہ حرارت سے متعلق حساس اتپریورتی ایلیل (شکل 4 اور مووی S4) کے ساتھ کیا۔ ER کو 37 ° C پر برقرار رکھنے اور اس کے بعد 24 ° C پر جاری ہونے کے بعد، زیادہ تر نئے ترکیب شدہ Gas1-GFP کو پورے ER جھلی میں کلسٹر اور تقسیم نہیں کیا گیا تھا، جیسا کہ روایتی خوردبین (شکل 4، A اور B) کے ذریعے مشاہدہ کیا گیا ہے۔ اس کے علاوہ، ERES کی ایک بڑی فیصد (67%) میں دو قسم کے کارگو شامل ہیں جو اس میں شریک ہیں (شکل 4D)۔ شکل 4C کے پینل 1 اور 2 ERES کی دو عام مثالیں دکھاتے ہیں جس میں گیس1-GFP اور Mid2-GFP اوور لیپنگ ہوتی ہے۔ اس کے علاوہ، دونوں سامان کو ایک ہی ERES میں بھرتی کیا گیا تھا (شکل 4E، پینل 3 اور فلم S4)۔ لہذا، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ ER جھلی میں سیرامائڈ ایسیل چین کی لمبائی ER پروٹین کی جمع اور درجہ بندی کا ایک اہم عامل ہے۔
Sec31-1 GhLag1 خلیات جو galactose سے متاثرہ رطوبتوں کا اظہار کرتے ہیں، Gas1-GFP (GPI-AP، سبز) اور Mid2-iRFP (TMP، نیلا) اور تشکیلاتی ERES کا لیبل لگا Sec13-mCherry (ERES، magenta) 37 ° C پر انکیوبیٹ کرتے ہیں۔ 30 منٹ تک جاری رکھیں، رطوبتوں کو جاری کرنے کے لیے 24°C پر گرا دیں، اور 20 منٹ کے بعد SCLIM کے ساتھ تصویر بنائیں۔ (A سے C) نمائندہ 2D پروجیکشن امیجز (A؛ اسکیل بار، 1μm) یا 3D سیل ہیمسفیئر امیجز (B اور C؛ اسکیل یونٹ، 0.45μm) کارگو اور ERES کے ذریعے نشان زد 10 z-سیکشنز۔ (B) میں نچلا پینل اور (C) میں پینل صرف ERES (میجنٹا) [Gas1-GFP (گرے) اور Mid2-iRFP (ہلکا نیلا)] میں موجود سامان کو دکھانے کے لیے پروسیس شدہ تصاویر دکھاتا ہے۔ (C) سفید بھرا تیر: ERES، سامان اوورلیپ۔ کھلا تیر: ERES میں صرف ایک آئٹم ہے۔ لوئر پینل: منتخب کردہ ERES میں اوور لیپنگ سامان (1 اور 2) (C) میں نشان زد ہیں۔ اسکیل بار، 100 این ایم۔ (D) فوٹومیکروگراف کی مقدار (C) میں بیان کی گئی ہے۔ sec31-1 اور sec31-1 GhLag1 یونٹس میں، صرف ایک کارگو (Gas1-GFP یا Mid2-iRFP) شامل ہے، اور الگ تھلگ کارگو اور اوور لیپنگ کارگو کے لیے ERES کا اوسط فیصد۔ تین آزاد تجربوں میں، 54 خلیات میں n = 432 (sec31-1) اور n = 430 47 خلیوں میں (sec31-1 GhLag1)۔ ایرر بار = SD۔ دو دم والا غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ۔ *** P = 0.0002 (sec31-1) اور ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)۔ (E) اوور لیپنگ کارگو کے ساتھ منتخب ERES کی 3D تصویر (3) نشان زد (C)۔ Gas1-GFP (سبز) اور Mid2-iRFP (نیلا) ایک ہی طرف سے ERES (magenta) تک پہنچتے ہیں اور اسی ERES محدود علاقے میں رہتے ہیں۔ اسکیل بار، 100 این ایم۔
یہ مطالعہ براہ راست vivo میں ثبوت فراہم کرتا ہے کہ لپڈ پر مبنی پروٹین کارگوز کو خفیہ راستے میں منتخب برآمدی مقامات میں درجہ بندی کیا جاتا ہے، اور درجہ بندی سلیکٹیوٹی کے لیے ایسیل چین کی لمبائی کی اہمیت کو ظاہر کرتا ہے۔ SCLIM نامی ایک طاقتور اور جدید مائیکروسکوپی تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے خمیر میں نئی ​​ترکیب شدہ Gas1-GFP (ایک بڑی پلازما جھلی GPI-AP جس میں ایک بہت لمبی ایسیل چین (C26) سیرامائیڈ لپڈ حصہ ہے) کا مظاہرہ کیا ہے جب کہ مجرد خطوں میں کلسٹرڈ پروٹین، مخصوص ERES سے منسلک ہوتے ہیں۔ پورے ER جھلی میں تقسیم (شکل 1)۔ اس کے علاوہ، یہ دو قسم کے سامان مختلف ERES میں منتخب طور پر داخل ہوتے ہیں (شکل 2)۔ جھلی میں سیلولر سیرامائڈ کی acyl چین کی لمبائی C26 سے C18-C16 تک کم ہو جاتی ہے، Gas1-GFP کلسٹر مجرد ER خطے میں منقطع ہو جاتا ہے، اور Gas1-GFP کو اسی ERES اور Figure3 (Figure3) کے ذریعے ٹرانس میبرن پروٹین کے ساتھ ER کو چھوڑنے کے لیے دوبارہ روٹ کیا جاتا ہے۔ 4)۔
اگرچہ GPI-AP ER سے باہر نکلنے کے لئے ایک خصوصی پروٹین میکانزم کا استعمال کرتا ہے، ہم نے پایا کہ C26 سیرامائڈ پر منحصر علیحدگی فرق پروٹین کے تعاملات پر انحصار نہیں کرتی ہے جو ERES تخصص (اعداد و شمار S4 اور S5) کا باعث بن سکتی ہے۔ اس کے بجائے، ہماری تلاشیں ایک متبادل درجہ بندی کے طریقہ کار کی حمایت کرتی ہیں جو لپڈ پر مبنی پروٹین کلسٹرنگ اور اس کے نتیجے میں دیگر کارگوز کے اخراج سے چلتی ہیں۔ ہمارے مشاہدات سے پتہ چلتا ہے کہ مخصوص ERES سے وابستہ Gas1-GFP خطہ یا کلسٹر میں transmembrane secreted پروٹین Mid2-iRFP کی کمی ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ C26 سیرامائیڈ پر منحصر GPI-AP کلسٹر متعلقہ ERES میں ان کے داخلے کو آسان بنائے گا، اور اسی وقت، اس مخصوص ERES کو خارج کر دے گا۔ 1 اور 2)۔ اس کے برعکس، ER جھلی میں C18-C16 سیرامائڈز کی موجودگی GPI-AP کو خطوں یا کلسٹرز کی تشکیل کا سبب نہیں بنتی، اس لیے وہ ٹرانس میمبرن سیکریٹڈ پروٹین کو ایک ہی ERES (اعداد و شمار 3 اور 4) میں خارج یا تبدیل نہیں کرتے ہیں۔ . لہذا، ہم تجویز کرتے ہیں کہ C26 سیرامائڈ مخصوص ERES سے منسلک پروٹینوں کے جھرمٹ کی سہولت فراہم کرکے علیحدگی اور درجہ بندی کو چلاتا ہے۔
کسی مخصوص ER علاقے میں اس C26 سیرامائڈ پر منحصر کلسٹرنگ کو کیسے حاصل کیا جائے؟ جھلی سیرامائڈ کے بعد میں الگ ہونے کا رجحان GPI-AP اور C26 سیرامائڈ کو ER جھلی کے زیادہ فاسد لپڈ ماحول میں چھوٹے اور فوری طور پر ترتیب شدہ لپڈس بنانے کا سبب بن سکتا ہے جس میں چھوٹے اور غیر سیر شدہ گلیسرولپڈز ہوتے ہیں۔ کوالٹی کلسٹرز (17، 18)۔ ان چھوٹے عارضی جھرمٹوں کو p24 کمپلیکس (34) سے منسلک ہونے کے بعد مزید بڑے، زیادہ مستحکم کلسٹرز میں ملایا جا سکتا ہے۔ اس کے ساتھ ہم آہنگ، ہم نے دکھایا کہ C26 Gas1-GFP کو p24 کمپلیکس کے ساتھ بات چیت کرنے کی ضرورت ہے تاکہ بڑے دکھائی دینے والے کلسٹرز (شکل 3) کی تشکیل کی جاسکے۔ پی 24 کمپلیکس ایک ہیٹروزائگس اولیگومر ہے جو خمیر (35) میں چار مختلف p24 ٹرانس میمبرن پروٹینوں پر مشتمل ہے، جو ملٹی ویلنٹ بائنڈنگ فراہم کرتا ہے، جو چھوٹے GPI-AP کلسٹرز کے کراس لنکنگ کا باعث بن سکتا ہے، اس طرح بڑا مستحکم کلسٹر (34) پیدا ہوتا ہے۔ GPI-APs کے پروٹین ایکٹوڈومینز کے درمیان تعامل ان کے جمع ہونے میں بھی حصہ ڈال سکتا ہے، جیسا کہ ممالیہ پولرائزڈ اپکلا خلیات (36) میں ان کی گولگی ٹرانسپورٹ کے دوران دکھایا گیا ہے۔ تاہم، جب C18-C16 سیرامائیڈ ER جھلی میں موجود ہے، جب p24 کمپلیکس Gas1-GFP سے منسلک ہوتا ہے، تو بڑے الگ کلسٹرز نہیں بنیں گے۔ بنیادی طریقہ کار طویل acyl چین سیرامائیڈ کی مخصوص جسمانی اور کیمیائی خصوصیات پر منحصر ہو سکتا ہے۔ مصنوعی جھلیوں کے بائیو فزیکل اسٹڈیز سے پتہ چلتا ہے کہ اگرچہ لمبی (C24) اور مختصر (C18-C16) دونوں ہی اکیل چین سیرامائڈز مرحلے کی علیحدگی کا سبب بن سکتے ہیں، صرف لمبی ایسیل چین سیرامائڈز (C24) فلم کو نئی شکل دینے کے لیے ہائی گھماؤ اور فلم موڑنے کو فروغ دے سکتی ہیں۔ باہمی حوالہ کے ذریعے (17، 37، 38)۔ یہ دکھایا گیا ہے کہ TMED2 کا ٹرانس میبرن ہیلکس، Emp24 کا انسانی ہومولوگ، منتخب طور پر سائٹوپلاسمک لوبلز (39) میں C18 سیرامائیڈ پر مبنی اسفنگومائیلین کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔ مالیکیولر ڈائنامکس (MD) سمیلیشنز کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ C18 اور C26 دونوں سیرامائڈز Emp24 ٹرانس میمبرن ہیلکس کے سائٹوپلاسمک لابیولز کے گرد جمع ہوتے ہیں، اور ان کی ترجیحات ایک جیسی ہیں (شکل S6)۔ یہ بات قابل غور ہے کہ یہ اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ Emp24 کا ٹرانس میمبرن ہیلکس جھلی میں لپڈس کی غیر متناسب تقسیم کا باعث بن سکتا ہے۔ یہ پستان دار خلیوں پر مبنی ایک حالیہ نتیجہ ہے۔ اسی طرح کے MD سمولیشن بھی ایتھر لپڈس کی موجودگی کو ظاہر کرتے ہیں (40)۔ لہذا، ہم قیاس کرتے ہیں کہ ER26 کے دو لابولس میں C26 سیرامائڈ مقامی طور پر افزودہ ہے۔ جب luminal lobules میں GPI-AP براہ راست ملٹی ویلنٹ p24 سے منسلک ہوتا ہے اور C26 ceramide کا p24 کے ارد گرد سائٹوپلاسمک lobules میں جمع ہوتا ہے، تو یہ انگلیوں (41) کے ذریعے ساتھ پروٹین کی جمع اور جھلی کے گھماؤ کو فروغ دے سکتا ہے، جس کی وجہ سے GPI-AP خطہ میں الگ ہو جاتا ہے۔ ER جھلی (42) کے انتہائی مڑے ہوئے علاقوں کی حمایت کرتا ہے۔ پچھلی رپورٹوں نے مجوزہ میکانزم کی حمایت کی (43، 44)۔ پلازما جھلی پر سیرامائڈ پر مبنی گلائکوسفنگولپڈس (GSL) کے ساتھ oligolectins، پیتھوجینز یا اینٹی باڈیز کا ملٹی ویلنٹ بائنڈنگ بڑے GSL جمع کو متحرک کرتا ہے، مرحلے کی علیحدگی کو بڑھاتا ہے اور جھلی کی خرابی اور اندرونی ہونے کا سبب بنتا ہے (44)۔ ایوابوچی وغیرہ۔ نیوٹروفیلز
ممالیہ پولرائزڈ اپیٹیلیل خلیوں میں، اینٹی گولگی نیٹ ورک (TGN) کی apical پلازما جھلی کی سطح تک ارتکاز GPI-AP (10، 45) کی علیحدگی اور چھانٹی کو کنٹرول کرتا ہے۔ یہ جمع GPI-AP oligomerization (36) کے ذریعہ کارفرما ہے ، لیکن یہ سیرامائڈ چین کی لمبائی پر بھی منحصر ہوسکتا ہے جو ہمیں خمیر میں ملتا ہے۔ اگرچہ ممالیہ GPI-AP میں ایتھر لپڈ پر مبنی اینکر ہوتا ہے، اور اس کی کیمیائی ساخت بہت لمبی ایسیل چین سیرامائیڈ سے بہت مختلف ہے، ایک حالیہ تحقیق سے پتا چلا ہے کہ دونوں لپڈز ارتقائی طور پر ایک جیسی جسمانی اور کیمیائی خصوصیات اور افعال رکھتے ہیں (40)۔ لہذا، ممالیہ کے خلیوں میں ایتھر لپڈ حصہ خمیر میں C26 سیرامائڈ کی طرح ہوسکتا ہے، اور اس کا کردار GPI-AP جمع اور چھانٹی کو فروغ دینے کے لئے جھلی میں لمبی زنجیر سیرامائڈ کے ساتھ منسلک کرنا ہے۔ اگرچہ اس امکان کو ابھی بھی براہ راست جانچنے کی ضرورت ہے، لیکن پچھلے نتائج اس بات کی تائید کرتے ہیں کہ گولگی کے جسم میں لمبی ایکیل چین سیرامائیڈ کی نقل و حمل سائٹوپلاسمک ٹرانسفر پروٹین کے ذریعے نہیں کی جاتی ہے، بلکہ یہ خمیر جیسے GPI اینکرز کی ترکیب پر منحصر ہے۔ اس لیے ایسا لگتا ہے کہ ارتقائی قدامت پسند طریقہ کار ایک ہی ٹرانسپورٹ ویسیکل میں بہت لمبی ایسیل چین سیرامائیڈ اور GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) کو منتخب طور پر مشترکہ نقل و حمل کرنے کے قابل ہوتا ہے۔
خمیر اور ممالیہ کے پولرائزڈ اپیتھیلیل سیل سسٹمز میں، GPI-AP جمع اور دوسرے پلازما میمبرین پروٹین سے علیحدگی سب سیل کی سطح تک پہنچنے سے پہلے ہوتی ہے۔ Paladino et al. (48) نے پایا کہ ممالیہ پولرائزڈ اپکلا خلیوں کے TGN پر، GPI-AP کلسٹرنگ نہ صرف GPI-APs کی apical پلازما جھلی کی منتخب درجہ بندی کے لیے ضروری ہے، بلکہ GPI-APs کی کلسٹرنگ تنظیم اور اس کی حیاتیاتی سرگرمی کو بھی منظم کرتی ہے۔ سیل کی سطح۔ خمیر میں، اس مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ ER پر C26 سیرامائڈ پر منحصر GPI-AP کلسٹر پلازما جھلی (24، 49) پر کلسٹر تنظیم اور GPI-AP کی فعال سرگرمی کو منظم کرسکتا ہے. اس ماڈل سے مطابقت رکھتے ہوئے، GhLag1 خلیات کو GPI روکنے والوں یا منشیات سے الرجی ہوتی ہے جو سیل کی دیوار کی سالمیت کو متاثر کرتی ہیں (28)، اور خمیری خلیوں کی ملاپ میں پیش کردہ ٹپ سیرامائیڈ کے فنکشنل Gas1-GFP کلسٹرز (49) کی ضرورت G​​​​​​ ظاہر کرتی ہے کہ G​​​​​​​​​​​​​​ GPI-AP خرابی۔ تاہم، مزید جانچ کرنا کہ آیا سیل کی سطح کی فنکشنل آرگنائزیشن کو ER سے لپڈ کی لمبائی کی بنیاد پر چھانٹنے کے طریقہ کار سے پروگرام کیا گیا ہے، یہ ہماری مستقبل کی تحقیق کا موضوع ہوگا۔
اس کام میں استعمال ہونے والے Saccharomyces cerevisiae strains ٹیبل S1 میں درج ہیں۔ لائیو سیل امیجنگ کے لیے SCLIM کے MMY1583 اور MMY1635 strains W303 کے پس منظر میں بنائے گئے تھے۔ فلوروسینٹ پروٹین ٹیگ کے ساتھ Sec13-mCherry کا اظہار کرنے والے یہ تناؤ پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) پر مبنی طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے pFA6a پلازمیڈ کے ساتھ بطور ٹیمپلیٹ (23) بنائے گئے تھے۔ GAL1 پروموٹر کے کنٹرول میں فلوروسینٹ پروٹین کے ساتھ لیبل لگا ہوا Mid2-iRFP کا اظہار کرنے والا تناؤ اس طرح بنایا گیا تھا۔ pKTiRFP-KAN ویکٹر سے iRFP-KanMx ترتیب کا پی سی آر ایمپلیفیکیشن (E. O'Shea کا تحفہ، Addgene plasmid number 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ریسرچ ریسورس آئیڈینٹیفائر (RRID): Endgene_6468 کے endgene_6468 کے اندر داخل کیا گیا۔ وسط 2۔ Mid2-iRFP جینوم کی ترتیب کو بڑھا کر GAL1 پروموٹر میں کلون کرنے کے بعد، اسے انٹیگریشن پلاسمڈ pRS306 کی Not I-Sac I سائٹ میں ضم کر دیا گیا تھا۔ نتیجے میں پلاسمڈ pRGS7 کو URA3 لوکس میں ضم کرنے کے لئے Pst I کے ساتھ لکیری کیا گیا تھا۔
Gas1-GFP فیوژن جین کا اظہار سینٹرومیر (CEN) پلاسمڈ میں GAL1 پروموٹر کے کنٹرول میں ہوتا ہے، جو اس طرح بنایا گیا ہے۔ Gas1-GFP ترتیب کو PCR کے ذریعے pRS416-GAS1-GFP پلاسمڈ (24) (L. Popolo کا تحفہ) سے بڑھایا گیا اور CEN پلازمڈ pBEVY-GL LEU2 (تحفہ C کا تحفہ) کی Xma I–Xho I سائٹ میں کلون کیا گیا۔ ملر ایڈجین پلاسمڈ نمبر 51225؛ http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225)۔ نتیجے میں پلاسمڈ کا نام pRGS6 رکھا گیا۔ Axl2-GFP فیوژن جین کا اظہار بھی pBEVY-GL LEU2 ویکٹر کے GAL1 پروموٹر کے کنٹرول میں ہوتا ہے، اور اس کی تعمیر کچھ یوں ہے۔ Axl2-GFP ترتیب کو PCR کے ذریعہ pRS304-p2HSE-Axl2-GFP پلازمیڈ (23) سے بڑھا دیا گیا تھا، اور pBEVY-GL LEU2 ویکٹر کی Bam HI-Pst I سائٹ میں کلون کیا گیا تھا۔ نتیجے میں پلاسمڈ کا نام pRGS12 رکھا گیا۔ اس مطالعے میں استعمال ہونے والے oligonucleotides کی ترتیب ٹیبل S2 میں درج ہے۔
اس تناؤ کو 0.2% ایڈنائن اور 2% گلوکوز [YP-dextrose (YPD)]، 2% raffinose [YP-raffinose] سے بھرپور خمیری ایکسٹریکٹ پروٹین p (YP) میڈیم (1% Yeast extract اور 2% protein ept) کے ساتھ پورا کیا گیا تھا۔ (YPR)] یا 2% galactose [YP-galactose (YPG)] ایک کاربن ماخذ کے طور پر، یا ایک مصنوعی کم سے کم درمیانے درجے میں (0.15% خمیر نائٹروجن بیس اور 0.5% امونیم سلفیٹ) مناسب امینو ایسڈز اور غذائیت کے لیے درکار اڈوں کو پورا کرنے کے لیے، اور gcomalluseluminic %2 پر مشتمل میڈیم) یا 2% گیلیکٹوز (مصنوعی گیلیکٹوز کم سے کم میڈیم) بطور کاربن ماخذ۔
ریئل ٹائم امیجنگ کے لیے، GAL1 پروموٹر کے تحت تعمیر کا اظہار کرنے والے درجہ حرارت کے لیے حساس sec31-1 اتپریورتی خلیے YPR میڈیم میں 24°C پر راتوں رات وسط لاگ مرحلے سے اگائے گئے۔ YPG میں 1 گھنٹہ کے لیے 24 ° C پر شامل کرنے کے بعد، خلیات کو SG میں 37 ° C پر 30 منٹ کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا، اور پھر 24 ° C پر منتقل کیا گیا تاکہ سراو بلاک سے رہائی جا سکے۔ Concanavalin A کا استعمال شیشے کی سلائیڈ پر خلیات کو ٹھیک کرنے کے لیے کیا گیا تھا اور اس کی تصویر SCLIM نے بنائی تھی۔ SCLIM Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope اور UPlanSApo 100×1.4 عددی یپرچر آئل لینس (Olympus)، تیز رفتار اور ہائی سگنل ٹو شور ریشو گھومنے والی ڈسک کنفوکل سکینر (یوکوگاوا، کسٹم اسپیکٹیئر سسٹم)، کسٹم اسپیکٹیئر سسٹم، (Hamamatsu Photonics) ایک میگنفائنگ لینس سسٹم فراہم کر سکتا ہے جس کی حتمی میگنیفیکیشن ×266.7 اور ایک چارج کپلڈ ڈیوائس کیمرہ ہے جو الیکٹرانز (Hamamatsu Photonics) (21) کو ضرب دیتا ہے۔ تصویر کا حصول حسب ضرورت سافٹ ویئر (یوکوگاوا الیکٹرک) کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ 3D امیجز کے لیے، ہم نے معروضی لینس کو عمودی طور پر وائبریٹ کرنے کے لیے ایک حسب ضرورت پیزو الیکٹرک ایکچو ایٹر کا استعمال کیا، اور ایک اسٹیک میں 100 nm کے علاوہ آپٹیکل حصوں کو جمع کیا۔ Z-stack امیج کو 3D ووکسیل ڈیٹا میں تبدیل کیا جاتا ہے، اور گھومنے والی ڈسک کنفوکل مائکروسکوپ کے لیے استعمال ہونے والے نظریاتی پوائنٹ اسپریڈ فنکشن کو Volocity سافٹ ویئر (PerkinElmer) کے ذریعے deconvolution پروسیسنگ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ شریک مقام کے تجزیے کے لیے خودکار حد تک Volocity سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے، ERES بشمول کارگو کی پیمائش کی گئی۔ لائن اسکین تجزیہ MetaMorph سافٹ ویئر (مالیکیولر ڈیوائسز) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔
شماریاتی اہمیت کا تعین کرنے کے لیے گراف پیڈ پرزم سافٹ ویئر استعمال کریں۔ دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ اور ویریئنس (ANOVA) ٹیسٹ کے عام یک طرفہ تجزیہ کے لیے، گروپوں کے درمیان فرق کو P <0.05 (*) پر اہم اثر سمجھا جاتا ہے۔
Gas1-GFP کی فلوروسینس مائیکروسکوپی کے لیے، لاگ فیز سیلز راتوں رات YPD میں اگائے گئے اور سینٹرفیوگریشن کے ذریعے اکٹھے کیے گئے، فاسفیٹ بفرڈ نمکین سے دو بار دھوئے گئے، اور کم از کم 15 منٹ تک برف پر انکیوبیٹ کیے گئے، اور پھر مائکروسکوپ کے نیچے آگے بڑھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (24)۔ Leica DMi8 مائیکروسکوپ (HCX PL APO 1003/1.40 آئل PH3 CS) ایک معروضی لینس، L5 (GFP) فلٹر، ہماتسو کیمرہ اور ایپلیکیشن سویٹ X (LAS X) سافٹ ویئر کے حصول کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ .
نمونوں کو 10 منٹ کے لئے 65 ° C پر SDS نمونہ بفر کے ساتھ منقطع کیا گیا تھا، اور پھر SDS-polyacrylamide جیل الیکٹروفورسس (PAGE) کے ذریعہ الگ کیا گیا تھا۔ امیونوبلوٹنگ تجزیہ کے لیے، فی لین میں 10 μl نمونہ لوڈ کیا گیا تھا۔ پرائمری اینٹی باڈی: خرگوش پولی کلونل اینٹی گیس1 کو 1:3000 کی کمی پر، خرگوش پولی کلونل اینٹی Emp24 کو 1:500 کی کمی پر، اور خرگوش پولی کلونل اینٹی GFP (H. Riezman کی طرف سے تحفہ) 1:3000 کی کمی پر استعمال کریں۔ ماؤس مونوکلونل اینٹی پی جی کے 1 اینٹی باڈی کا استعمال 1:5000 کی کمی پر کیا گیا تھا (جے ڈی لا کروز کا تحفہ)۔ ثانوی اینٹی باڈی: ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز (HRP) کنجوگیٹڈ بکری اینٹی خرگوش امیونوگلوبلین G (IgG) 1:3000 (پیئرس) کے کم ہونے پر استعمال ہوتا ہے۔ HRP-conjugated goat anti-mouse IgG 1:3000 (پیئرس) کے کم ہونے پر استعمال کیا گیا تھا۔ مدافعتی ردعمل کا زون سپر سگنل ویسٹ پیکو ریجنٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک) کے کیمیلومینیسینس طریقہ سے دیکھا گیا۔
جیسا کہ (31) میں بیان کیا گیا ہے، افزودہ ER فریکشن پر ایک قدرتی امیونوپریسیپیٹیشن تجربہ کیا گیا تھا۔ مختصراً، خمیری خلیوں کو TNE بفر [50 mM tris-HCl (pH 7.5)، 150 mM NaCl، 5 mM EDTA، 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride اور protease inhibitor مرکب) کے ساتھ 600 nm (OD600t opdenical at OD600) سے دھوئے۔ اسے شیشے کے موتیوں سے توڑا گیا تھا، اور پھر سیل کے ملبے اور شیشے کے موتیوں کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے ہٹا دیا گیا تھا۔ اس کے بعد سپرنیٹنٹ کو 17,000 گرام پر 15 منٹ کے لیے 4 ° C پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ ٹی این ای میں گولی کو دوبارہ معطل کر دیا گیا تھا اور ڈیجیٹلس سیپونن کو 1٪ کی حتمی حراستی میں شامل کیا گیا تھا۔ معطلی کو 4 ° C پر گردش کے ساتھ 1 گھنٹہ تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور پھر ناقابل حل اجزاء کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے 4 ° C پر 60 منٹ کے لیے 13,000 g پر ہٹا دیا گیا تھا۔ Gas1-GFP امیونوپریسیپیٹیشن کے لیے، پہلے نمونے کو خالی ایگروز موتیوں (ChromoTek) کے ساتھ 4°C پر 1 گھنٹے کے لیے پہلے سے انکیوبیٹ کریں، اور پھر GFP-Trap_A (ChromoTek) کے ساتھ 4°C پر 3 گھنٹے تک انکیوبیٹ کریں۔ مدافعتی موتیوں کو پانچ بار TNE کے ساتھ دھویا گیا جس میں 0.2% digoxigenin تھا، SDS نمونہ بفر کے ساتھ ایلوٹ کیا گیا، SDS-PAGE پر الگ کیا گیا، اور امیونو بلوٹنگ کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔
جیسا کہ (31) میں بیان کیا گیا ہے، کراس لنکنگ کا تعین افزودہ ER فریکشن پر کیا گیا تھا۔ مختصراً، افزودہ ER فریکشن 0.5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (پیئرس، تھرمو فشر سائنٹیفک، راک فورڈ، IL، USA؛ 20 ° C، 20 منٹ) کے ساتھ لگایا گیا تھا۔ کراس لنکنگ رد عمل کو گلائسین (50 ایم ایم حتمی حراستی، 5 منٹ، 20 ° C) شامل کرکے بجھایا گیا۔
جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (50)، جنگلی قسم اور GhLag1 تناؤ میں سیرامائڈ کا MS تجزیہ کیا گیا تھا۔ مختصراً، YPD میں 30 ° C پر خلیات کو ایکسپونینشل فیز (3 سے 4 OD600 یونٹس/ml) تک بڑھایا گیا، اور 25×107 سیلز کاٹے گئے۔ ان کا میٹابولزم ٹرائکلورواسیٹک ایسڈ سے بجھ جاتا ہے۔ نکالنے والے سالوینٹ [ایتھنول، پانی، ایتھر، پائریڈائن اور 4.2 این امونیم ہائیڈرو آکسائیڈ (15:15:5:1:0.018 v/v)] اور 1.2 nmol اندرونی معیاری C17 سیرامائیڈ (860517، Avanti polar lipid) کوالٹی) استعمال کریں۔ ایکسٹریکٹ کی ہلکی الکلائن ہائیڈرولیسس کرنے کے لیے مونو میتھائلمائن ریجنٹ [میتھانول، واٹر، این-بیوٹانول اور میتھائلمائن سلوشن (4:3:1:5 v/v)] کا استعمال کریں، اور پھر پانی سے سیر شدہ n-butanol کو صاف کرنے کے لیے استعمال کریں۔ آخر میں، نچوڑ کو ایک مثبت موڈ سالوینٹ [کلوروفارم/میتھانول/واٹر (2:7:1) + 5 ایم ایم امونیم ایسیٹیٹ] میں دوبارہ معطل کیا گیا اور ماس اسپیکٹومیٹر میں انجکشن لگایا گیا۔ ملٹی ری ایکشن مانیٹرنگ (ایم آر ایم) اسفنگولپیڈ مالیکیولز کی شناخت اور مقدار درست کرنے کے لیے کی گئی تھی۔ TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) لپڈ تجزیہ کے لیے روبوٹک نینو فلو آئن سورس Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) سے لیس ہے۔ تصادم کی توانائی ہر سیرامائڈ زمرے کے لیے موزوں ہے۔ ایم ایس ڈیٹا مثبت موڈ میں حاصل کیا گیا تھا۔ ہر ایک حیاتیاتی نقل کے لیے، لپڈ سگنل تین آزاد پیمائشوں کا میڈین ہے۔
جیسا کہ (31) میں بیان کیا گیا ہے، گیس 1-GFP کا اظہار کرنے والے خلیات (800×107) قدرتی مدافعتی عمل کا شکار تھے۔ پیوریفائیڈ Gas1-GFP کو SDS-PAGE کے ذریعے الگ کیا گیا تھا اور اسے پولی وینیلائیڈین فلورائیڈ (PVDF) جھلی میں منتقل کیا گیا تھا۔ امائڈ بلیک کے ساتھ پی وی ڈی ایف کو داغ لگا کر پروٹین کا تصور کیا گیا تھا۔ Gas1-GFP بینڈ کو PVDF سے کاٹ کر 5 بار میتھانول سے اور ایک بار مائع کرومیٹوگرافی-MS (LC-MS) گریڈ کے پانی سے دھویا گیا۔ جھلی کی پٹی کو 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0)، بفر اور 500μl تازہ تحلیل شدہ 1 M سوڈیم نائٹریٹ مکسچر کو 37 ° C پر 3 گھنٹے تک انکیوبیٹ کرنے سے، لپڈ فریکشن گیس1-GFP اور lysedecephos کے درمیان لیس ریموف سے خارج ہوتا ہے۔ گلوکوزامین اور انوسیٹول (51)۔ اس کے بعد، جھلی کی پٹی کو LC-MS گریڈ کے پانی سے چار بار دھویا گیا، کمرے کے درجہ حرارت پر خشک کیا گیا، اور تجزیہ تک -80°C پر نائٹروجن ماحول میں محفوظ کیا گیا۔ ایک کنٹرول کے طور پر، PVDF جھلی کا ایک خالی نمونہ ہر تجربے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔ Gas1-GFP سے نکالا گیا لپڈ پھر MS کے ذریعہ تجزیہ کیا گیا جیسا کہ بیان کیا گیا ہے (50)۔ مختصراً، GPI-lipid پر مشتمل PVDF سٹرپس کو 75μl منفی مولڈ سالوینٹ [کلوروفارم/میتھانول (1:2) + 5 ایم ایم امونیم ایسیٹیٹ] میں دوبارہ معطل کیا گیا اور الیکٹرو سپرے آئنائزیشن (ESI) -MRM/MS تجزیہ آف اسفنگولیپڈ پرجاتیوں (TSQ Vantage) کو پاس کیا گیا۔ اس صورت میں، ایم ایس ڈیٹا منفی آئن موڈ میں حاصل کیا گیا تھا۔
جیسا کہ پہلے ذکر کیا گیا ہے، GPI اینکر کا لپڈ حصہ [3H]-inositol-lebeled GPI-AP (16) سے الگ کیا گیا تھا۔ لپڈس کو سالوینٹ سسٹم (55:45:10 کلوروفارم-میتھانول-0.25% KCl) کا استعمال کرتے ہوئے پتلی پرت کی کرومیٹوگرافی کے ذریعے الگ کیا گیا تھا اور FLA-7000 (Fujifilm) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔
Gas1-GFP (600×107) کا اظہار کرنے والے خلیوں کو TNE بفر کے ساتھ TNE بفر کے ساتھ دو بار دھویا گیا، اور شیشے کے موتیوں سے توڑا گیا، اور پھر سیل کے ملبے اور شیشے کے موتیوں کو ہٹانے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ اس کے بعد سپرناٹینٹ کو 17,000 گرام پر 4 ° C پر 1 گھنٹے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ گولی کو TNE میں دھویا گیا اور TNE میں 1 U PI-PLC (انویٹروجن) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا جس میں 37 ° C پر 1 گھنٹہ کے لئے 0.2% ڈیجیٹلس سیپونین موجود ہے۔ انزائم کے علاج کے بعد، جھلی کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے 17,000 گرام پر 4 ° C پر 1 گھنٹے کے لیے ہٹا دیا گیا۔ Gas1-GFP کو امیونوپریسیپیٹیٹ کرنے کے لیے، سپرنٹنٹ کو رات بھر 4°C پر GFP-Trap_A (ChromoTek) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ SDS-PAGE کے ذریعہ الگ کردہ پیوریفائیڈ Gas1-GFP کو کوماسی شاندار نیلے رنگ سے داغ دیا گیا تھا۔ Gas1-GFP سٹیننگ بینڈ کو آبی نالی کے آس پاس کے سرمئی رنگ سے کاٹ دیا گیا تھا، اور پھر iodoacetamide کے ساتھ alkylation اور dithiothreitol کے ساتھ کمی کے بعد، ٹرپسن کے ساتھ جیل میں ہاضمہ کیا گیا تھا۔ GPI-glycans کے ساتھ ٹرپٹک پیپٹائڈس اور پیپٹائڈس کو نکالیں اور خشک کریں۔ خشک پیپٹائڈ کو 20 μl پانی میں تحلیل کیا گیا تھا۔ LC میں ایک حصہ (8μl) لگائیں۔ ایک اوکٹاڈیسیلسیلین (ODS) کالم (Develosil 300ODS-HG-5؛ اندرونی قطر 150 ملی میٹر × 1.0 ملی میٹر؛ نومورا کیمیکل، ایچی پریفیکچر، جاپان) کو مخصوص تدریجی حالات میں پیپٹائڈس کو الگ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ موبائل فیز سالوینٹ A (0.08% فارمک ایسڈ) اور سالوینٹ B (80% acetonitrile میں 0.15% فارمک ایسڈ) ہے۔ ایک Accela HPLC سسٹم (تھرمو فشر سائنٹیفک، بوسٹن، میساچوسٹس) کا استعمال سالوینٹ A کے ساتھ کالم کو 55 منٹ کے اندر اندر 50 μl min-1 کے بہاؤ کی شرح پر 5 منٹ کے لیے کیا گیا تھا، اور پھر سالوینٹ B کا ارتکاز بڑھا کر 40% کر دیا گیا تھا۔ ، ریاستہائے متحدہ)۔ ایلیویٹ کو مسلسل ESI آئن سورس میں متعارف کرایا گیا، اور GPI-glycans کے ساتھ ٹرپٹک پیپٹائڈس اور پیپٹائڈس کا تجزیہ LTQ Orbitrap XL (ہائبرڈ لکیری آئن ٹریپ-آربٹریپ ماس اسپیکٹومیٹر؛ تھرمو فشر سائنٹیفک) نے کیا۔ MS سیٹ اپ میں، کیپلیری سورس کا وولٹیج 4.5 kV پر سیٹ کیا گیا تھا، اور ٹرانسفر کیپلیری کا درجہ حرارت 300 ° C پر رکھا گیا تھا۔ کیپلیری وولٹیج اور ٹیوب لینس وولٹیج کو بالترتیب 15 V اور 50 V پر سیٹ کیا گیا تھا۔ MS ڈیٹا مثبت آئن موڈ میں حاصل کیا گیا تھا (60,000 کی ریزولوشن؛ 10 پارٹس فی ملین کی بڑے پیمانے پر درستگی) 300/m/z ماس/چارج تناسب (m/z) 3000 کی وسیع رینج میں۔ MS/MS ڈیٹا LTQ میں آئن ٹریپ کے ذریعے حاصل کیا جاتا ہے جس پر پہلے ہندسوں کا انحصار XL پر ہوتا ہے۔ induced dissociation (CID)]۔
MD تخروپن کو GROMACS (52) سافٹ ویئر اور MARTINI 2 فورس فیلڈ (53-55) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ CHARMM GUI میمبرین بلڈر (56, 57) کو پھر ایک بیلیئر بنانے کے لیے استعمال کیا گیا جس میں dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) اور Cer C18 یا DOPC اور Cer C26 شامل تھے۔ Cer C26 کی ٹوپولوجی اور نقاط اسفنگوسین دم سے اضافی موتیوں کو ہٹا کر DXCE سے اخذ کیے گئے ہیں۔ ڈبل لیئر کو متوازن کرنے اور اسے چلانے کے لیے نیچے بیان کردہ عمل کا استعمال کریں، پھر Emp24 پر مشتمل سسٹم بنانے کے لیے سسٹم کے آخری نقاط کا استعمال کریں۔ خمیر Emp24 (اوشیشوں 173 سے 193) کا ٹرانس میبرن ڈومین بصری MD (VMD) ٹول مالیکیولر ڈھانچہ (58) کا استعمال کرتے ہوئے α-ہیلکس کے طور پر بنایا گیا تھا۔ پھر، اوورلیپنگ لپڈس کو ہٹانے کے بعد، پروٹین کو موٹے طور پر دانے دار کیا گیا اور CHARMM GUI کا استعمال کرتے ہوئے بیلیئر میں داخل کیا گیا۔ حتمی نظام میں 1202 DOPC اور 302 Cer C26 یا 1197 DOPC اور 295 Cer C18 اور Emp24 شامل ہیں۔ سسٹم کو 0.150M کے ارتکاز پر آئنائز کریں۔ دو بیلیئر کمپوزیشنز کے لیے چار آزاد نقلیں تیار کی گئیں۔
لپڈ بیلیئر کو CHARMM GUI عمل کا استعمال کرتے ہوئے متوازن کیا جاتا ہے، جس میں 405,000 قدموں کو کم سے کم اور پھر متوازن کرنا شامل ہوتا ہے، جہاں پوزیشن کی رکاوٹوں کو بتدریج کم اور ختم کیا جاتا ہے، اور وقت کا مرحلہ 0.005 ps سے بڑھا کر 0.02 ps کیا جاتا ہے۔ توازن کے بعد، یہ 0.02 پی ایس کے ٹائم سٹیپ کے ساتھ 6 µs پیدا کرتا ہے۔ Emp24 داخل کرنے کے بعد، سسٹم کو کم سے کم اور متوازن کرنے کے لیے اسی CHARMM GUI عمل کو استعمال کریں، اور پھر پیداوار میں 8 سیکنڈ تک چلائیں۔
تمام نظاموں کے لیے، توازن کے عمل کے دوران، دباؤ کو بیرینڈسن باروسٹیٹ (59) کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے، اور پیداواری عمل کے دوران، دباؤ کو Parrinello-Rahman barostat (60) کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔ تمام معاملات میں، اوسط دباؤ 1 بار ہے اور ایک نیم آئسوٹروپک پریشر کپلنگ اسکیم استعمال کی جاتی ہے۔ توازن اور پیداوار کے عمل میں، ایک تھرموسٹیٹ (61) رفتار کی بحالی کے ساتھ بالترتیب پروٹین، لپڈ اور سالوینٹ ذرات کے درجہ حرارت کو جوڑنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ پورے آپریشن کے دوران، ہدف کا درجہ حرارت 310K ہے۔ نان بانڈنگ تعامل کا حساب 0.005 بفر رواداری کے ساتھ ورلیٹ اسکیم کا استعمال کرتے ہوئے جوڑی کی فہرست بنا کر کیا جاتا ہے۔ Coulomb اصطلاح کا حساب رد عمل کے میدان اور 1.1 nm کے کٹ آف فاصلے کا استعمال کرتے ہوئے کیا جاتا ہے۔ Vander Waals کی اصطلاح 1.1 nm کے کٹ آف فاصلے کے ساتھ کٹ آف اسکیم کا استعمال کرتی ہے، اور Verlet کٹ آف اسکیم ممکنہ بڑھے ہوئے (62) کے لیے استعمال ہوتی ہے۔
VMD کا استعمال کرتے ہوئے، DOPC فاسفیٹ موتیوں یا سیرامائڈ AM1 موتیوں اور پروٹین کے درمیان کٹ آف طول موج 0.7 nm ہے، اور پروٹین کے ساتھ تعامل کرنے والے لپڈس کی تعداد کا حساب لگایا جاتا ہے۔ مندرجہ ذیل فارمولے کے مطابق، (63) کی طرح کمی کی افزودگی (DE) عنصر کا حساب لگائیں: DE عنصر = (پروٹین میں کل لپڈز کی مقدار 0.7) پروٹین 0.7 میں (کل لپڈ میں Cer کی مقدار)
رپورٹ کردہ قدر اوسط کے طور پر حاصل کی جاتی ہے، اور ایرر بارز SE کی چار آزاد کاپیاں ہیں۔ DE فیکٹر کی شماریاتی اہمیت کا تخمینہ ٹی ٹیسٹ [(اوسط ڈی ای فیکٹر-1)/SE] سے لگایا جاتا ہے۔ ایک دم والی تقسیم سے P قدر کا حساب لگائیں۔
GROMACS ٹول کو ٹریس کے آخری 250 ns کے اندر Emp24 پر مشتمل سسٹم کے 2D پس منظر کی کثافت کے نقشے کا حساب لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ سیرامائیڈ کی افزودگی/کمی کا نقشہ حاصل کرنے کے لیے، Cer کے کثافت کے نقشے کو Cer اور DOPC کے نقشے کے مجموعہ سے تقسیم کیا جاتا ہے، اور پھر جسم میں Cer کے ارتکاز سے تقسیم کیا جاتا ہے۔ ایک ہی رنگ کا نقشہ پیمانہ استعمال کیا جاتا ہے۔
اس مضمون کے ضمنی مواد کے لیے، براہ کرم دیکھیں http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
یہ تخلیقی العام انتساب-غیر تجارتی لائسنس کی شرائط کے تحت تقسیم کیا گیا ایک کھلا رسائی مضمون ہے، جو کسی بھی میڈیم میں استعمال، تقسیم اور تولید کی اجازت دیتا ہے، جب تک کہ حتمی استعمال تجارتی فائدے کے لیے نہ ہو اور بنیاد یہ ہے کہ اصل کام درست ہے۔ حوالہ۔
نوٹ: ہم آپ سے صرف اپنا ای میل ایڈریس فراہم کرنے کو کہتے ہیں تاکہ آپ جس شخص کو صفحہ پر تجویز کرتے ہیں اسے معلوم ہو کہ آپ چاہتے ہیں کہ وہ ای میل دیکھیں اور یہ سپیم نہیں ہے۔ ہم کسی بھی ای میل ایڈریس پر قبضہ نہیں کریں گے۔
یہ سوال یہ جانچنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے کہ آیا آپ وزیٹر ہیں اور خودکار سپیم جمع کرانے سے روکتے ہیں۔
Sofia Rodriguez-Gallardo، Kazuo Kurokawa، Susana Sabido-bozo، Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez)، Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda)، Valeria Zoni (Valeria Zoni)، Auxiliadora Aguilera-Romero، Ana Loezio-Seriope Mario-Seriogie لوپیز، میہو واگا (میہو واگا)، میساکو ارمان (میساکو ارمان)، میاکو ریمان (میاکو ریمان)، پرو اکیرا، اسٹیفانو فینی، اکی ہیکو ناکانو، مینوئل منیز
3D ہائی ریزولوشن ریئل ٹائم امیجنگ سلیکٹیو آؤٹ پٹ سائٹس میں پروٹین کی چھانٹی کے لیے سیرامائیڈ چین کی لمبائی کی اہمیت کو ظاہر کرتی ہے۔
Sofia Rodriguez-Gallardo، Kazuo Kurokawa، Susana Sabido-bozo، Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez)، Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda)، Valeria Zoni (Valeria Zoni)، Auxiliadora Aguilera-Romero، Ana Loezio-Seriope Mario-Seriogie لوپیز، میہو واگا (میہو واگا)، میساکو ارمان (میساکو ارمان)، میاکو ریمان (میاکو ریمان)، پرو اکیرا، اسٹیفانو فینی، اکی ہیکو ناکانو، مینوئل منیز
3D ہائی ریزولوشن ریئل ٹائم امیجنگ سلیکٹیو آؤٹ پٹ سائٹس میں پروٹین کی چھانٹی کے لیے سیرامائیڈ چین کی لمبائی کی اہمیت کو ظاہر کرتی ہے۔
©2020 امریکن ایسوسی ایشن فار دی ایڈوانسمنٹ آف سائنس۔ تمام حقوق محفوظ ہیں۔ AAAS HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef اور COUNTER کا پارٹنر ہے۔ سائنس ایڈوانسز ISSN 2375-2548۔