فطرت ڈاٹ کام پر جانے کا شکریہ۔ آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔ بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ براؤزر کا تازہ ترین ورژن استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو بند کردیں)۔ مزید برآں، مسلسل سپورٹ کو یقینی بنانے کے لیے، اس سائٹ میں اسٹائل یا جاوا اسکرپٹ شامل نہیں ہوگا۔
سنتھون 3-(اینتھراسین-9-yl)-2-cyanoacryloyl کلورائیڈ 4 کی ترکیب کی گئی تھی اور اسے مختلف نائٹروجن نیوکلیوفائلز کے ساتھ اپنے رد عمل کے ذریعے متعدد انتہائی فعال ہیٹروسائکلک مرکبات کی ترکیب کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ہر ترکیب شدہ ہیٹروسائکلک کمپاؤنڈ کی ساخت کو سپیکٹروسکوپک اور عنصری تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے اچھی طرح سے نمایاں کیا گیا تھا۔ تیرہ نوول ہیٹروسائکلک مرکبات میں سے دس نے ملٹی ڈرگ ریزسٹنٹ بیکٹیریا (MRSA) کے خلاف حوصلہ افزا افادیت ظاہر کی۔ ان میں، مرکبات 6، 7، 10، 13b، اور 14 نے سب سے زیادہ اینٹی بیکٹیریل سرگرمی ظاہر کی جس میں روک تھام والے زون 4 سینٹی میٹر کے قریب ہیں۔ تاہم، مالیکیولر ڈاکنگ اسٹڈیز نے انکشاف کیا کہ مرکبات پینسلن بائنڈنگ پروٹین 2a (PBP2a) سے مختلف پابند وابستگی رکھتے ہیں، جو MRSA مزاحمت کا ایک اہم ہدف ہے۔ کچھ مرکبات جیسے 7، 10 اور 14 نے PBP2a کی فعال سائٹ پر کو-کرسٹلائزڈ کوئنازولینون لیگینڈ کے مقابلے میں زیادہ پابند وابستگی اور تعامل کا استحکام ظاہر کیا۔ اس کے برعکس، مرکبات 6 اور 13b میں کم ڈاکنگ اسکور تھے لیکن پھر بھی اہم اینٹی بیکٹیریل سرگرمی کی نمائش کی گئی، کمپاؤنڈ 6 میں سب سے کم MIC (9.7 μg/100 μL) اور MBC (78.125 μg/100 μL) اقدار ہیں۔ ڈاکنگ کے تجزیے سے ہائیڈروجن بانڈنگ اور π-اسٹیکنگ سمیت کلیدی تعاملات کا انکشاف ہوا، خاص طور پر Lys 273، Lys 316 اور Arg 298 جیسی باقیات کے ساتھ، جن کی شناخت PBP2a کے کرسٹل ڈھانچے میں شریک کرسٹلائزڈ لیگنڈ کے ساتھ تعامل کے طور پر کی گئی تھی۔ یہ باقیات PBP2a کی انزیمیٹک سرگرمی کے لیے ضروری ہیں۔ ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ترکیب شدہ مرکبات مؤثر علاج کے امیدواروں کی شناخت کے لیے بائیوسیز کے ساتھ مالیکیولر ڈاکنگ کے امتزاج کی اہمیت کو اجاگر کرتے ہوئے امید افزا اینٹی MRSA ادویات کے طور پر کام کر سکتے ہیں۔
اس صدی کے پہلے چند سالوں میں، تحقیقی کوششیں بنیادی طور پر آسانی سے دستیاب ابتدائی مواد کا استعمال کرتے ہوئے antimicrobial سرگرمی کے ساتھ کئی اختراعی heterocyclic نظاموں کی ترکیب کے لیے نئے، سادہ طریقہ کار اور طریقے تیار کرنے پر مرکوز تھیں۔
Acrylonitrile moieties کو بہت سے قابل ذکر heterocyclic نظاموں کی ترکیب کے لیے اہم ابتدائی مواد سمجھا جاتا ہے کیونکہ یہ انتہائی رد عمل والے مرکبات ہیں۔ مزید برآں، 2-cyanoacryloyl chloride مشتقات حالیہ برسوں میں فارماسولوجیکل ایپلی کیشنز کے میدان میں اہم اہمیت کی حامل مصنوعات کی نشوونما اور ترکیب کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال کیے گئے ہیں، جیسے کہ منشیات کے انٹرمیڈیٹس 1,2,3، اینٹی ایچ آئی وی کے پیش خیمہ، اینٹی وائرل، اینٹی کینسر، اینٹی بیکٹیریل، اینٹی ڈپریسنٹ، 69، 7، 6، 7، 7، 7۔ حال ہی میں، اینتھراسین اور اس کے ماخوذ کی حیاتیاتی افادیت، بشمول ان کے اینٹی بائیوٹک، اینٹی کینسر 11,12، اینٹی بیکٹیریل 13,14,15 اور کیڑے مار خصوصیات16,17، نے بہت زیادہ توجہ مبذول کی ہے18,19,20,21۔ antimicrobial مرکبات جن میں acrylonitrile اور anthracene moieties شامل ہیں کو اعداد و شمار 1 اور 2 میں دکھایا گیا ہے۔
ورلڈ ہیلتھ آرگنائزیشن (WHO) (2021) کے مطابق، antimicrobial resistance (AMR) صحت اور ترقی کے لیے عالمی خطرہ ہے 22,23,24,25۔ مریضوں کا علاج نہیں کیا جا سکتا، جس کے نتیجے میں ہسپتال میں طویل قیام اور مہنگی ادویات کی ضرورت کے ساتھ ساتھ اموات اور معذوری میں اضافہ ہوتا ہے۔ مؤثر antimicrobials کی کمی اکثر مختلف انفیکشنز کے علاج میں ناکامی کا باعث بنتی ہے، خاص طور پر کیموتھراپی اور بڑی سرجریوں کے دوران۔
ورلڈ ہیلتھ آرگنائزیشن 2024 کی رپورٹ کے مطابق، میتھیسلن مزاحم Staphylococcus aureus (MRSA) اور E. coli ترجیحی پیتھوجینز کی فہرست میں شامل ہیں۔ دونوں بیکٹیریا بہت سی اینٹی بائیوٹکس کے خلاف مزاحم ہیں، اس لیے وہ ان انفیکشنز کی نمائندگی کرتے ہیں جن کا علاج اور کنٹرول کرنا مشکل ہے، اور اس مسئلے سے نمٹنے کے لیے نئے اور موثر antimicrobial مرکبات تیار کرنے کی فوری ضرورت ہے۔ اینتھراسین اور اس کے مشتق معروف اینٹی مائکروبیل ہیں جو گرام مثبت اور گرام منفی دونوں بیکٹیریا پر کام کر سکتے ہیں۔ اس مطالعے کا مقصد ایک نئے مشتق کی ترکیب کرنا ہے جو ان پیتھوجینز کا مقابلہ کر سکے جو صحت کے لیے خطرناک ہیں۔
ورلڈ ہیلتھ آرگنائزیشن (ڈبلیو ایچ او) نے رپورٹ کیا ہے کہ بہت سے بیکٹیریل پیتھوجینز متعدد اینٹی بائیوٹکس کے خلاف مزاحم ہیں، بشمول میتھیسلن مزاحم Staphylococcus aureus (MRSA)، کمیونٹی اور صحت کی دیکھ بھال کی ترتیبات میں انفیکشن کی ایک عام وجہ۔ MRSA کے انفیکشن والے مریضوں کی موت کی شرح ان لوگوں کے مقابلے میں 64% زیادہ بتائی جاتی ہے جو منشیات سے حساس انفیکشن والے ہیں۔ اس کے علاوہ، E. coli ایک عالمی خطرہ ہے کیونکہ carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (یعنی E. coli) کے خلاف دفاع کی آخری لائن کولسٹن ہے، لیکن حال ہی میں کئی ممالک میں کولیسٹن مزاحم بیکٹیریا کی اطلاع ملی ہے۔ 22,23,24,25
لہٰذا، عالمی ادارہ صحت کے عالمی ایکشن پلان آن اینٹی مائکروبیل ریزسٹنس26 کے مطابق، نئے antimicrobials کی دریافت اور ترکیب کی فوری ضرورت ہے۔ اینٹی بیکٹیریل 27، اینٹی فنگل 28، اینٹی کینسر29 اور اینٹی آکسیڈینٹ 30 ایجنٹوں کے طور پر اینتھراسین اور ایکریلونائٹرائل کی بڑی صلاحیت کو متعدد شائع شدہ مقالوں میں اجاگر کیا گیا ہے۔ اس سلسلے میں، یہ کہا جا سکتا ہے کہ یہ مشتق میتھیسلن مزاحم Staphylococcus aureus (MRSA) کے خلاف استعمال کے لیے اچھے امیدوار ہیں۔
پچھلے ادبی جائزوں نے ہمیں ان کلاسوں میں نئے مشتقات کی ترکیب کرنے کی ترغیب دی۔ لہذا، موجودہ مطالعہ کا مقصد اینتھراسین اور ایکریلونائٹرائل موئیٹیز پر مشتمل ناول ہیٹروسائکلک نظام تیار کرنا، ان کی اینٹی مائکروبیل اور اینٹی بیکٹیریل افادیت کا جائزہ لینا، اور مالیکیولر ڈاکنگ کے ذریعے پینسلن بائنڈنگ پروٹین 2a (PBP2a) کے ساتھ ان کے ممکنہ پابند تعاملات کی تحقیقات کرنا ہے۔ پچھلے مطالعات کی بنیاد پر، موجودہ مطالعہ نے ہیٹروسائکلک نظاموں کی ترکیب، حیاتیاتی تشخیص، اور کمپیوٹیشنل تجزیہ کو جاری رکھا تاکہ طاقتور PBP2a روک تھام کے ساتھ امید افزا antitimethicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ایجنٹوں کی شناخت کی جا سکے۔ سرگرمی31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49.
ہماری موجودہ تحقیق اینتھراسین اور ایکریلونیٹرائل موئٹیز پر مشتمل ناول ہیٹروسائکلک مرکبات کی ترکیب اور اینٹی مائکروبیل تشخیص پر مرکوز ہے۔ 3-(anthracen-9-yl)-2-cyanoacryloyl chloride 4 تیار کیا گیا تھا اور ناول ہیٹروسائکلک نظاموں کی تعمیر کے لیے ایک بلڈنگ بلاک کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔
کمپاؤنڈ 4 کی ساخت کا تعین سپیکٹرل ڈیٹا کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ 1H-NMR سپیکٹرم نے CH= کی موجودگی کو 9.26 ppm پر ظاہر کیا، IR سپیکٹرم نے 1737 cm−1 پر کاربونیل گروپ اور 2224 cm−1 پر ایک سائانو گروپ کی موجودگی ظاہر کی، اور 13CNMR سپیکٹرم نے بھی مجوزہ ڈھانچے کی تصدیق کی (تجرباتی سیکشن دیکھیں)۔
3-(anthracen-9-yl)-2-cyanoacryloyl chloride 4 کی ترکیب خوشبودار گروپ 250, 41, 42, 53 کے hydrolysis کے ذریعے ایتھانولک سوڈیم ہائیڈرو آکسائیڈ محلول (10%) کے ساتھ مکمل کی گئی تھی تاکہ تیزابیت 354، 45، 5th پر پانی کے ساتھ ٹریٹ کیا جا سکے۔ اعلی پیداوار (88.5%) میں acryloyl کلورائد مشتق 4 دینے کے لیے غسل، جیسا کہ شکل 3 میں دکھایا گیا ہے۔
متوقع antibacterial افادیت کے ساتھ نئے heterocyclic مرکبات بنانے کے لئے، acyl chloride 4 کا رد عمل مختلف dinucleophiles کے ساتھ کیا گیا۔
تیزاب کلورائد 4 کا علاج ایک گھنٹے کے لیے 0° پر ہائیڈرزائن ہائیڈریٹ کے ساتھ کیا گیا۔ بدقسمتی سے، pyrazolone 5 حاصل نہیں کیا گیا تھا. پروڈکٹ ایکریلامائڈ ڈیریویٹیو تھا جس کی ساخت کی تصدیق اسپیکٹرل ڈیٹا سے ہوئی تھی۔ اس کے IR سپیکٹرم نے C=O کے جذب بینڈ کو 1720 cm−1 پر، C≡N کو 2228 cm−1 پر اور NH کو 3424 cm−1 پر دکھایا۔ 1H-NMR سپیکٹرم نے 9.3 ppm پر اولیفین پروٹون اور NH پروٹون کا ایک ایکسچینج سنگل سگنل دکھایا (تجرباتی سیکشن دیکھیں)۔
تیزابی کلورائد 4 کے دو مولوں کو فینیل ہائیڈرزائن کے ایک تل کے ساتھ رد عمل ظاہر کیا گیا تاکہ N-phenylacryloylhydrazine مشتق 7 کو اچھی پیداوار (77%) میں برداشت کیا جاسکے (شکل 5)۔ 7 کی ساخت کی تصدیق انفراریڈ سپیکٹروسکوپی ڈیٹا سے ہوئی، جس میں 1691 اور 1671 cm−1 پر دو C=O گروپوں کا جذب، 2222 cm−1 پر CN گروپ کا جذب اور 3245 cm−1 پر NH گروپ کا جذب دکھایا گیا، اور اس کے 1H-N1 MR گروپ میں اسپیکٹرم اور 1H-N1 ایم آر کو جذب کیا گیا۔ 8.81 پی ​​پی ایم اور 10.88 پی پی ایم پر این ایچ پروٹون (تجرباتی سیکشن دیکھیں)۔
اس مطالعہ میں، 1,3-ڈینوکلیوفائلز کے ساتھ acyl کلورائڈ 4 کے رد عمل کی تحقیقات کی گئیں۔ Acyl chloride 4 کا علاج 2-aminopyridine کے ساتھ 1,4-dioxane میں TEA کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر بنیادی طور پر acrylamide derivative 8 (Figure 5) کے ساتھ، جس کی ساخت کی شناخت اسپیکٹرل ڈیٹا کے ذریعے کی گئی۔ IR سپیکٹرا نے 2222 cm−1 پر پھیلے ہوئے cyano کے جذب بینڈ کو دکھایا، NH 3148 cm−1 پر، اور carbonyl 1665 cm−1 پر؛ 1H NMR سپیکٹرا نے 9.14 پی پی ایم پر اولیفن پروٹون کی موجودگی کی تصدیق کی (تجرباتی سیکشن دیکھیں)۔
کمپاؤنڈ 4 تھیوریا کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتا ہے تاکہ pyrimidinethione 9 دیتا ہے۔ کمپاؤنڈ 4 thiopyrazole مشتق 10 (شکل 5) دینے کے لیے thiosemicarbazide کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتا ہے۔ مرکبات 9 اور 10 کے ڈھانچے کی تصدیق طیفیاتی اور عنصری تجزیہ سے ہوئی (تجرباتی سیکشن دیکھیں)۔
Tetrazine-3-thiol 11 کمپاؤنڈ 4 کے رد عمل سے thiocarbazide کے ساتھ 1,4-dinucleophile (شکل 5) کے طور پر تیار کیا گیا تھا، اور اس کی ساخت کی تصدیق سپیکٹروسکوپی اور عنصری تجزیہ سے ہوئی۔ انفراریڈ سپیکٹرم میں، C=N بانڈ 1619 cm−1 پر ظاہر ہوا۔ اسی وقت، اس کے 1H-NMR سپیکٹرم نے 7.78–8.66 ppm اور SH پروٹون 3.31 ppm پر خوشبودار پروٹون کے ملٹی پلٹ سگنلز کو برقرار رکھا (تجرباتی سیکشن دیکھیں)۔
Acryloyl کلورائیڈ 4 1,2-diaminobenzene، 2-aminothiophenol، anthranilic acid، 1,2-diaminoethane، اور ethanolamine کے ساتھ 1,4-dinucleophiles کے طور پر نئے heterocyclic نظام (13-16) کی تشکیل کے لیے رد عمل ظاہر کرتا ہے۔
ان نئے ترکیب شدہ مرکبات کے ڈھانچے کی تصدیق طیفیاتی اور عنصری تجزیے سے ہوئی (تجرباتی سیکشن دیکھیں)۔ 2-Hydroxyphenylacrylamide مشتق 17 2-aminophenol کے ساتھ ایک dinucleophile کے طور پر رد عمل کے ذریعے حاصل کیا گیا تھا (شکل 6)، اور اس کی ساخت کی تصدیق اسپیکٹرل اور عنصری تجزیہ سے ہوئی۔ کمپاؤنڈ 17 کے انفراریڈ سپیکٹرم نے ظاہر کیا کہ C=O اور C≡N سگنلز بالترتیب 1681 اور 2226 cm−1 پر ظاہر ہوئے۔ دریں اثنا، اس کے 1H-NMR سپیکٹرم نے 9.19 ppm پر olefin پروٹون کے سنگل سگنل کو برقرار رکھا، اور OH پروٹون 9.82 ppm پر ظاہر ہوا (تجرباتی سیکشن دیکھیں)۔
ایسڈ کلورائد 4 کا ایک نیوکلیوفائل (مثلاً، ایتھیلامین، 4-ٹولوائیڈائن، اور 4-میتھوکسیانلین) کے ساتھ ڈائی آکسین میں سالوینٹ کے طور پر اور TEA کمرے کے درجہ حرارت پر ایک اتپریرک کے طور پر سبز کرسٹل لائن ایکریلامائڈ مشتقات 18، 19a، اور 19b کو فراہم کرتا ہے۔ مرکبات 18، 19a، اور 19b کے عنصری اور سپیکٹرل ڈیٹا نے ان مشتقات کے ڈھانچے کی تصدیق کی ہے (تجرباتی سیکشن دیکھیں) (شکل 7)۔
مختلف مصنوعی مرکبات کی antimicrobial سرگرمی کی اسکریننگ کے بعد، مختلف نتائج حاصل کیے گئے جیسا کہ جدول 1 اور شکل 8 میں دکھایا گیا ہے (فگر فائل دیکھیں)۔ تمام جانچے گئے مرکبات نے گرام پازیٹو بیکٹیریم MRSA کے خلاف مختلف درجات کی روک تھام ظاہر کی، جب کہ گرام منفی بیکٹیریم Escherichia coli نے تمام مرکبات کے خلاف مکمل مزاحمت ظاہر کی۔ ٹیسٹ شدہ مرکبات کو MRSA کے خلاف روکے جانے والے زون کے قطر کی بنیاد پر تین زمروں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔ پہلی قسم سب سے زیادہ فعال تھی اور پانچ مرکبات (6، 7، 10، 13b اور 14) پر مشتمل تھی۔ ان مرکبات کے انحبیشن زون کا قطر 4 سینٹی میٹر کے قریب تھا۔ اس زمرے میں سب سے زیادہ فعال مرکبات مرکبات 6 اور 13b تھے۔ دوسری قسم اعتدال پسند تھی اور اس میں مزید پانچ مرکبات (11، 13a، 15، 18 اور 19a) شامل تھے۔ ان مرکبات کا انحبیشن زون 3.3 سے 3.65 سینٹی میٹر تک تھا، کمپاؤنڈ 11 کے ساتھ سب سے بڑا انابیشن زون 3.65 ± 0.1 سینٹی میٹر ظاہر ہوتا ہے۔ دوسری طرف، آخری گروپ میں تین مرکبات (8، 17 اور 19b) تھے جن میں سب سے کم اینٹی مائکروبیل سرگرمی (3 سینٹی میٹر سے کم) تھی۔ شکل 9 مختلف انحبیشن زونز کی تقسیم کو ظاہر کرتی ہے۔
ٹیسٹ شدہ مرکبات کی antimicrobial سرگرمی کی مزید تفتیش میں ہر مرکب کے لیے MIC اور MBC کا تعین شامل ہے۔ نتائج قدرے مختلف تھے (جیسا کہ جدول 2، 3 اور شکل 10 میں دکھایا گیا ہے (فگر فائل دیکھیں))، مرکبات 7، 11، 13a اور 15 کو بظاہر بہترین مرکبات کے طور پر دوبارہ درجہ بندی کیا گیا ہے۔ ان کی ایک ہی سب سے کم MIC اور MBC قدریں تھیں (39.06 μg/100 μL)۔ اگرچہ مرکبات 7 اور 8 کی MIC قدریں کم تھیں (9.7 μg/100 μL)، ان کی MBC قدریں زیادہ تھیں (78.125 μg/100 μL)۔ لہذا، وہ پہلے ذکر کردہ مرکبات کے مقابلے میں کمزور سمجھا جاتا تھا. تاہم، یہ چھ مرکبات ٹیسٹ کیے جانے والوں میں سب سے زیادہ موثر تھے، کیونکہ ان کی MBC کی قدریں 100 μg/100 μL سے کم تھیں۔
مرکبات (10، 14، 18 اور 19b) دوسرے ٹیسٹ شدہ مرکبات کے مقابلے میں کم فعال تھے کیونکہ ان کی MBC قدریں 156 سے 312 μg/100 μL تک تھیں۔ دوسری طرف، مرکبات (8، 17 اور 19a) سب سے کم امید افزا تھے کیونکہ ان کی اعلیٰ ترین MBC قدریں تھیں (بالترتیب 625، 625 اور 1250 μg/100 μL)۔
آخر میں، جدول 3 میں دکھائے گئے رواداری کی سطح کے مطابق، ٹیسٹ شدہ مرکبات کو ان کے عمل کے طریقہ کار کی بنیاد پر دو قسموں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے: بیکٹیریسائڈل اثر والے مرکبات (7, 8, 10, 11, 13a, 15, 18, 19b) اور اینٹی بیکٹیریل اثر والے مرکبات, 6, 13, 19b)۔ ان میں، مرکبات 7، 11، 13a اور 15 کو ترجیح دی جاتی ہے، جو انتہائی کم ارتکاز (39.06 μg/100 μL) میں قتل کی سرگرمی کو ظاہر کرتے ہیں۔
ٹیسٹ کیے گئے تیرہ میں سے دس مرکبات نے اینٹی بائیوٹک مزاحم میتھیسلن مزاحم Staphylococcus aureus (MRSA) کے خلاف صلاحیت ظاہر کی۔ اس لیے، زیادہ اینٹی بائیوٹک مزاحم پیتھوجینز (خاص طور پر مقامی الگ تھلگ جو پیتھوجینک گرام پازیٹو اور گرام نیگیٹو بیکٹیریا کو ڈھانپتے ہیں) اور پیتھوجینک خمیر کے ساتھ ساتھ اس کی حفاظت کا اندازہ لگانے کے لیے ہر مرکب کی سائٹوٹوکسک جانچ کی سفارش کی جاتی ہے۔
مالیکیولر ڈاکنگ اسٹڈیز میتھیسلن مزاحم Staphylococcus aureus (MRSA) میں پینسلن بائنڈنگ پروٹین 2a (PBP2a) کے روکنے والے کے طور پر ترکیب شدہ مرکبات کی صلاحیت کا جائزہ لینے کے لیے کی گئیں۔ PBP2a ایک کلیدی انزائم ہے جو بیکٹیریل سیل وال بائیو سنتھیسس میں ملوث ہے، اور اس انزائم کی روک تھام سیل کی دیوار کی تشکیل میں مداخلت کرتی ہے، جو بالآخر بیکٹیریل لیسز اور سیل کی موت کا باعث بنتی ہے۔ ڈاکنگ کے نتائج ٹیبل 4 میں درج ہیں اور ضمنی ڈیٹا فائل میں مزید تفصیل کے ساتھ بیان کیے گئے ہیں، اور نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ کئی مرکبات PBP2a کے لیے مضبوط پابند وابستگی کا مظاہرہ کرتے ہیں، خاص طور پر کلیدی فعال سائٹ کی باقیات جیسے Lys 273، Lys 316، اور Arg 298۔ تعاملات، بشمول ہائیڈرجن اور π کے بہت ملتے جلتے تھے۔ شریک کرسٹلائزڈ کوئنازولینون لیگنڈ (سی سی ایل)، جو ان مرکبات کی صلاحیت کو طاقتور روکنے والے کے طور پر ظاہر کرتا ہے۔
مالیکیولر ڈاکنگ ڈیٹا، دیگر کمپیوٹیشنل پیرامیٹرز کے ساتھ، سختی سے تجویز کرتا ہے کہ PBP2a روکنا ان مرکبات کی مشاہدہ شدہ اینٹی بیکٹیریل سرگرمی کے لیے ذمہ دار کلیدی طریقہ کار تھا۔ ڈاکنگ اسکورز اور روٹ کا مطلب مربع انحراف (RMSD) قدروں نے اس مفروضے کی حمایت کرتے ہوئے پابند تعلق اور استحکام کا مزید انکشاف کیا۔ جیسا کہ جدول 4 میں دکھایا گیا ہے، جب کہ کئی مرکبات نے اچھی بائنڈنگ وابستگی ظاہر کی، کچھ مرکبات (مثال کے طور پر، 7، 9، 10، اور 14) کو کو-کرسٹلائزڈ لیگینڈ کے مقابلے میں زیادہ ڈاکنگ اسکور حاصل تھے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ان کا PBP2a کی فعال سائٹ کی باقیات کے ساتھ مضبوط تعامل ہو سکتا ہے۔ تاہم، سب سے زیادہ بایو ایکٹیو مرکبات 6 اور 13b نے دوسرے لیگنڈس کے مقابلے میں قدرے کم ڈاکنگ اسکور (بالترتیب -5.98 اور -5.63) دکھائے۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ اگرچہ ڈاکنگ اسکور کا استعمال بائنڈنگ وابستگی کی پیش گوئی کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے، لیکن دیگر عوامل (مثلاً، ligand کے استحکام اور حیاتیاتی ماحول میں سالماتی تعامل) بھی اینٹی بیکٹیریل سرگرمی کا تعین کرنے میں کلیدی کردار ادا کرتے ہیں۔ خاص طور پر، تمام ترکیب شدہ مرکبات کی RMSD قدریں 2 Å سے کم تھیں، اس بات کی تصدیق کرتی ہے کہ ان کے ڈاکنگ پوز ساختی طور پر کو-کرسٹالائزڈ لیگینڈ کی بائنڈنگ کنفرمیشن کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں، جو کہ PBP2a inhibitors کے طور پر ان کی صلاحیت کی مزید حمایت کرتے ہیں۔
اگرچہ ڈاکنگ اسکورز اور RMS قدریں قیمتی پیشین گوئیاں فراہم کرتی ہیں، لیکن ان ڈاکنگ کے نتائج اور antimicrobial سرگرمی کے درمیان تعلق ہمیشہ پہلی نظر میں واضح نہیں ہوتا ہے۔ اگرچہ PBP2a کی روک تھام کو اینٹی مائکروبیل سرگرمی کو متاثر کرنے والے ایک اہم عنصر کے طور پر مضبوطی سے سپورٹ کیا جاتا ہے، لیکن کئی اختلافات بتاتے ہیں کہ دیگر حیاتیاتی خصوصیات بھی ایک اہم کردار ادا کرتی ہیں۔ مرکبات 6 اور 13b نے سب سے زیادہ antimicrobial سرگرمی ظاہر کی، جس میں دونوں کا انحبیشن زون قطر 4 سینٹی میٹر ہے اور سب سے کم MIC (9.7 μg/100 μL) اور MBC (78.125 μg/100 μL) اقدار، ان کے کم ڈاکنگ سکور کے باوجود، مرکبات کے مقابلے، یہ تجویز کرتا ہے کہ یہ 91.47۔ اگرچہ PBP2a روکنا اینٹی مائکروبیل سرگرمی میں حصہ ڈالتا ہے، بیکٹیریل ماحول میں حل پذیری، حیاتیاتی دستیابی اور تعامل کی حرکیات بھی مجموعی سرگرمی کو متاثر کرتے ہیں۔ چترا 11 ان کے ڈاکنگ پوز کو ظاہر کرتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ دونوں مرکبات، نسبتاً کم بائنڈنگ اسکور کے باوجود، PBP2a کی کلیدی باقیات کے ساتھ تعامل کرنے کے قابل ہیں، ممکنہ طور پر روکنا کمپلیکس کو مستحکم کرتے ہیں۔ یہ اس بات پر روشنی ڈالتا ہے کہ جبکہ مالیکیولر ڈاکنگ PBP2a کی روک تھام میں اہم بصیرت فراہم کرتی ہے، ان مرکبات کے حقیقی دنیا کے antimicrobial اثرات کو مکمل طور پر سمجھنے کے لیے دیگر حیاتیاتی عوامل پر غور کیا جانا چاہیے۔
PBP2a (PDB ID: 4CJN) کے کرسٹل ڈھانچے کا استعمال کرتے ہوئے، سب سے زیادہ فعال مرکبات 6 اور 13b کے 2D اور 3D تعامل کے نقشے پینسلن بائنڈنگ پروٹین 2a (PBP2a) کے ساتھ میتھیسلن مزاحم Staphylococcus aureus (MRSA) بنائے گئے تھے۔ یہ نقشے ان مرکبات کے تعامل کے نمونوں کا دوبارہ ڈاک شدہ کو-کرسٹالائزڈ کوئنازولینون لیگنڈ (CCL) کے ساتھ موازنہ کرتے ہیں، کلیدی تعاملات جیسے ہائیڈروجن بانڈنگ، π-اسٹیکنگ، اور آئنک تعاملات کو نمایاں کرتے ہیں۔
اسی طرح کا نمونہ کمپاؤنڈ 7 کے لیے دیکھا گیا، جس نے نسبتاً زیادہ ڈاکنگ سکور (-6.32) اور کمپاؤنڈ 10 سے ملتا جلتا انحبیشن زون قطر (3.9 سینٹی میٹر) ظاہر کیا۔ تاہم، اس کا MIC (39.08 μg/100 μL) اور MBC (39.06 μg/100 μL میں نمایاں طور پر زیادہ ہونا ضروری تھا)۔ اینٹی بیکٹیریل اثر کو ظاہر کرتا ہے۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ اگرچہ کمپاؤنڈ 7 نے ڈاکنگ اسٹڈیز میں مضبوط پابند وابستگی ظاہر کی ہے، تاہم حیاتیاتی دستیابی، سیلولر اپٹیک، یا دیگر فزیکو کیمیکل خصوصیات جیسے عوامل اس کی حیاتیاتی افادیت کو محدود کر سکتے ہیں۔ اگرچہ کمپاؤنڈ 7 نے جراثیم کش خصوصیات ظاہر کیں، لیکن یہ مرکبات 6 اور 13b کے مقابلے میں بیکٹیریا کی افزائش کو روکنے میں کم موثر تھا۔
کمپاؤنڈ 10 نے سب سے زیادہ ڈاکنگ سکور (-6.40) کے ساتھ زیادہ ڈرامائی فرق دکھایا، جو PBP2a سے مضبوط پابند وابستگی کی نشاندہی کرتا ہے۔ تاہم، اس کا روک قطر کا زون (3.9 سینٹی میٹر) کمپاؤنڈ 7 سے موازنہ تھا، اور اس کا MBC (312 μg/100 μL) مرکبات 6، 7، اور 13b سے نمایاں طور پر زیادہ تھا، جو کمزور جراثیم کش سرگرمی کی نشاندہی کرتا ہے۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ اچھی ڈاکنگ پیشین گوئیوں کے باوجود، مرکب 10 دیگر محدود عوامل جیسے حل پذیری، استحکام، یا بیکٹیریل جھلی کی ناقص پارگمیتا کی وجہ سے MRSA کو مارنے میں کم موثر تھا۔ یہ نتائج اس تفہیم کی حمایت کرتے ہیں کہ اگرچہ PBP2a کی روک تھام اینٹی بیکٹیریل سرگرمی میں کلیدی کردار ادا کرتی ہے، لیکن یہ آزمائشی مرکبات کے درمیان مشاہدہ کی گئی حیاتیاتی سرگرمی میں فرق کی پوری طرح وضاحت نہیں کرتا ہے۔ یہ اختلافات بتاتے ہیں کہ اس میں شامل اینٹی بیکٹیریل میکانزم کو مکمل طور پر واضح کرنے کے لیے مزید تجرباتی تجزیوں اور گہرائی سے حیاتیاتی تشخیص کی ضرورت ہے۔
جدول 4 میں مالیکیولر ڈاکنگ کے نتائج اور سپلیمنٹری ڈیٹا فائل ڈاکنگ سکور اور اینٹی مائکروبیل سرگرمی کے درمیان پیچیدہ تعلق کو نمایاں کرتی ہے۔ اگرچہ مرکبات 6 اور 13b مرکبات 7، 9، 10 اور 14 کے مقابلے میں کم ڈاکنگ سکور رکھتے ہیں، لیکن وہ سب سے زیادہ اینٹی مائکروبیل سرگرمی کو ظاہر کرتے ہیں۔ ان کے تعامل کے نقشے (شکل 11 میں دکھائے گئے ہیں) اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ ان کے کم بائنڈنگ اسکور کے باوجود، وہ PBP2a کی اہم باقیات کے ساتھ اب بھی اہم ہائیڈروجن بانڈز اور π-اسٹیکنگ تعاملات بناتے ہیں جو حیاتیاتی طور پر فائدہ مند طریقے سے انزائم-انحیبیٹر کمپلیکس کو مستحکم کر سکتے ہیں۔ 6 اور 13b کے نسبتاً کم ڈاکنگ اسکور کے باوجود، ان کی بڑھی ہوئی antimicrobial سرگرمی سے پتہ چلتا ہے کہ دیگر خصوصیات جیسے حل پذیری، استحکام، اور سیلولر اپٹیک کو ڈاکنگ ڈیٹا کے ساتھ مل کر جب روکنے والے کی صلاحیت کا اندازہ لگایا جانا چاہیے۔ یہ نئے مرکبات کی علاج کی صلاحیت کا درست اندازہ لگانے کے لیے تجرباتی antimicrobial تجزیہ کے ساتھ ڈاکنگ اسٹڈیز کو یکجا کرنے کی اہمیت کو اجاگر کرتا ہے۔
یہ نتائج اس بات پر روشنی ڈالتے ہیں کہ اگرچہ مالیکیولر ڈاکنگ پابند وابستگی کی پیش گوئی کرنے اور روک تھام کے ممکنہ میکانزم کی نشاندہی کرنے کے لیے ایک طاقتور ٹول ہے، لیکن اینٹی مائکروبیل افادیت کا تعین کرنے کے لیے اس پر اکیلے انحصار نہیں کیا جانا چاہیے۔ سالماتی اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ PBP2a روکنا ایک اہم عنصر ہے جو antimicrobial سرگرمی کو متاثر کرتا ہے، لیکن حیاتیاتی سرگرمی میں تبدیلیاں تجویز کرتی ہیں کہ علاج کی افادیت کو بڑھانے کے لیے دیگر فزیکو کیمیکل اور فارماکوکینیٹک خصوصیات کو بہتر بنایا جانا چاہیے۔ مستقبل کے مطالعے کو حیاتیاتی دستیابی اور سیلولر اپٹیک کو بہتر بنانے کے لیے مرکبات 7 اور 10 کے کیمیائی ڈھانچے کو بہتر بنانے پر توجہ مرکوز کرنی چاہیے، اس بات کو یقینی بنانا کہ مضبوط ڈاکنگ تعاملات کو حقیقی antimicrobial سرگرمی میں ترجمہ کیا جائے۔ مزید مطالعات، بشمول اضافی بایواسیز اور ڈھانچے کی سرگرمی کا رشتہ (SAR) تجزیہ، ہماری سمجھ کو مزید آگے بڑھانے کے لیے اہم ہوں گے کہ یہ مرکبات PBP2a روکنے والے کے طور پر کیسے کام کرتے ہیں اور زیادہ موثر antimicrobial ایجنٹ تیار کرتے ہیں۔
3-(anthracen-9-yl)-2-cyanoacryloyl chloride 4 سے ترکیب شدہ مرکبات اینٹی مائکروبیل سرگرمی کی مختلف ڈگریوں کی نمائش کرتے ہیں، جس میں متعدد مرکبات میتھیسلن مزاحم Staphylococcus aureus (MRSA) کی نمایاں روک تھام کا مظاہرہ کرتے ہیں۔ ساخت اور سرگرمی کے تعلقات (SAR) کے تجزیے سے ان مرکبات کی اینٹی مائکروبیل افادیت کی بنیادی ساختی خصوصیات کا انکشاف ہوا۔
ایکریلونیٹرائل اور اینتھراسین دونوں گروپوں کی موجودگی antimicrobial سرگرمی کو بڑھانے کے لیے اہم ثابت ہوئی۔ acrylonitrile میں انتہائی رد عمل کا حامل نائٹریل گروپ بیکٹیریل پروٹین کے ساتھ تعامل کو آسان بنانے کے لیے ضروری ہے، اس طرح کمپاؤنڈ کی antimicrobial خصوصیات میں حصہ ڈالتا ہے۔ ایکریلونیٹریل اور اینتھراسین دونوں پر مشتمل مرکبات نے مستقل طور پر مضبوط اینٹی مائکروبیل اثرات کا مظاہرہ کیا۔ اینتھراسین گروپ کی خوشبو نے ان مرکبات کو مزید مستحکم کیا، ممکنہ طور پر ان کی حیاتیاتی سرگرمی کو بڑھایا۔
ہیٹروسائکلک رِنگز کے متعارف ہونے سے متعدد مشتقات کی اینٹی بیکٹیریل افادیت میں نمایاں بہتری آئی۔ خاص طور پر، benzothiazole derivative 13b اور acrylhydrazide derivative 6 نے تقریباً 4 سینٹی میٹر کی روک تھام کے زون کے ساتھ سب سے زیادہ اینٹی بیکٹیریل سرگرمی ظاہر کی۔ ان ہیٹروسائکلک مشتقات نے زیادہ اہم حیاتیاتی اثرات دکھائے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ ہیٹروسائکلک ڈھانچہ اینٹی بیکٹیریل اثرات میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے۔ اسی طرح، کمپاؤنڈ 9 میں پائریمائڈینتھیون، کمپاؤنڈ 10 میں تھیوپیرازول، اور کمپاؤنڈ 11 میں ٹیٹرازائن رنگ نے مرکبات کی اینٹی بیکٹیریل خصوصیات میں حصہ ڈالا، جس سے ہیٹروسائکلک ترمیم کی اہمیت کو مزید اجاگر کیا گیا۔
ترکیب شدہ مرکبات میں، 6 اور 13b اپنی بہترین اینٹی بیکٹیریل سرگرمیوں کے لیے نمایاں تھے۔ کمپاؤنڈ 6 کا کم از کم روک تھام کرنے والا ارتکاز (MIC) 9.7 μg/100 μL تھا، اور کم از کم جراثیم کش ارتکاز (MBC) 78.125 μg/100 μL تھا، جو میتھیسلن مزاحم Staphylococcusure a (Staphylococcusure) کو صاف کرنے کی بہترین صلاحیت کو اجاگر کرتا ہے۔ اسی طرح، کمپاؤنڈ 13b میں 4 سینٹی میٹر اور کم MIC اور MBC قدروں کا روکنا زون تھا، جو اس کی طاقتور اینٹی بیکٹیریل سرگرمی کی تصدیق کرتا ہے۔ یہ نتائج ان مرکبات کی حیاتیاتی افادیت کا تعین کرنے میں acrylohydrazide اور benzothiazole کے فنکشنل گروپس کے کلیدی کردار کو اجاگر کرتے ہیں۔
اس کے برعکس، مرکبات 7، 10، اور 14 نے 3.65 سے 3.9 سینٹی میٹر تک کی روک تھام والے زون کے ساتھ معتدل اینٹی بیکٹیریل سرگرمی کی نمائش کی۔ ان مرکبات کو بیکٹیریا کو مکمل طور پر ختم کرنے کے لیے زیادہ ارتکاز کی ضرورت ہوتی ہے، جیسا کہ ان کی نسبتاً زیادہ MIC اور MBC اقدار سے ظاہر ہوتا ہے۔ اگرچہ یہ مرکبات مرکبات 6 اور 13b کے مقابلے میں کم فعال تھے، پھر بھی انہوں نے اہم اینٹی بیکٹیریل صلاحیت ظاہر کی، جس سے یہ تجویز کیا گیا کہ ہیٹروسائکلک رنگ میں ایکریلونائٹرائل اور اینتھراسین موئیٹیز کو شامل کرنا ان کے اینٹی بیکٹیریل اثر میں معاون ہے۔
مرکبات کے عمل کے مختلف طریقے ہوتے ہیں، کچھ جراثیم کش خصوصیات کی نمائش کرتے ہیں اور دیگر بیکٹیریاسٹیٹک اثرات کی نمائش کرتے ہیں۔ مرکبات 7، 11، 13a، اور 15 جراثیم کش ہیں اور بیکٹیریا کو مکمل طور پر ختم کرنے کے لیے کم ارتکاز کی ضرورت ہوتی ہے۔ اس کے برعکس، مرکبات 6، 13b، اور 14 بیکٹیریاسٹیٹک ہیں اور کم ارتکاز میں بیکٹیریا کی نشوونما کو روک سکتے ہیں، لیکن بیکٹیریا کو مکمل طور پر ختم کرنے کے لیے زیادہ ارتکاز کی ضرورت ہوتی ہے۔
مجموعی طور پر، ساخت اور سرگرمی کے تعلقات کا تجزیہ اہم اینٹی بیکٹیریل سرگرمی کو حاصل کرنے کے لیے ایکریلونیٹرائل اور اینتھراسین موئیٹیز اور ہیٹروسائکلک ڈھانچے کو متعارف کرانے کی اہمیت کو اجاگر کرتا ہے۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ان ساختی اجزاء کی اصلاح اور حل پذیری اور جھلی کی پارگمیتا کو بہتر بنانے کے لیے مزید ترمیمات کی تلاش زیادہ موثر اینٹی MRSA ادویات کی ترقی کا باعث بن سکتی ہے۔
تمام ریجنٹس اور سالوینٹس کو معیاری طریقہ کار (ایل گوموریہ، مصر) کا استعمال کرتے ہوئے صاف اور خشک کیا گیا تھا۔ پگھلنے والے پوائنٹس کا تعین GallenKamp الیکٹرانک پگھلنے والے نقطہ اپریٹس کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور بغیر کسی اصلاح کے رپورٹ کیا جاتا ہے۔ انفراریڈ (IR) سپیکٹرا (cm⁻1) کو تھرمو الیکٹران نیکلیٹ iS10 FTIR سپیکٹرومیٹر (تھرمو فشر سائنٹیفک، والتھم، MA، USA) پر پوٹاشیم برومائڈ (KBr) چھرے کا استعمال کرتے ہوئے کیمسٹری، فیکلٹی آف سائنس، عین شمس یونیورسٹی میں ریکارڈ کیا گیا۔
1H NMR سپیکٹرا GEMINI NMR سپیکٹرو میٹر (GEMINI Manufacturing & Engineering, Anaheim, CA, USA) اور BRUKER 300 MHz NMR سپیکٹرو میٹر (BRUKER Manufacturing & Engineering, Inc.) کا استعمال کرتے ہوئے 300 MHz پر حاصل کیا گیا۔ Tetramethylsilane (TMS) کو ڈیوٹریٹڈ ڈائمتھائل سلفوکسائڈ (DMSO-d₆) کے ساتھ اندرونی معیار کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا۔ NMR پیمائش فیکلٹی آف سائنس، قاہرہ یونیورسٹی، گیزا، مصر میں کی گئی۔ عنصری تجزیہ (CHN) ایک Perkin-Elmer 2400 Elemental Analyzer کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور حاصل کردہ نتائج حسابی اقدار کے ساتھ اچھے موافق ہیں۔
تیزاب 3 (5 ملی میٹر) اور تھیونائل کلورائڈ (5 ملی لیٹر) کے مرکب کو پانی کے غسل میں 65 ° C پر 4 گھنٹے تک گرم کیا گیا۔ اضافی تھیونائل کلورائد کو کم دباؤ میں کشید کرکے ہٹا دیا گیا۔ نتیجے میں سرخ ٹھوس جمع کیا گیا تھا اور مزید صاف کیے بغیر استعمال کیا گیا تھا۔ پگھلنے کا مقام: 200-202 °C، پیداوار: 88.5%۔ IR (KBr, ν, cm−1): 2224 (C≡N), 1737 (C=O)۔ 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9.26 (s, 1H, CH=), 7.27-8.57 (m, 9H, heteroaromatization)۔ 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 115.11 (C≡N)، 124.82–130.53 (CH اینتھراسین)، 155.34، 114.93 (CH=C–C=O)، 162.22 (C=O)؛ HRMS (ESI) m/z [M + H]+: 291.73111۔ تجزیہ کار۔ C18H10ClNO (291.73): C, 74.11; ح، 3.46; این، 4.80۔ ملا: ج، 74.41; ح، 3.34; N، 4.66%۔
0 ° C پر، 4 (2 mmol, 0.7 g) کو اینہائیڈروس ڈائی آکسین (20 ملی لیٹر) میں تحلیل کیا گیا اور ہائیڈرزائن ہائیڈریٹ (2 ملی میٹر، 0.16 ملی لیٹر، 80%) کو ڈراپ وائز میں شامل کیا گیا اور 1 گھنٹے تک ہلایا گیا۔ تیز ٹھوس کو فلٹریشن کے ذریعے اکٹھا کیا گیا اور کمپاؤنڈ 6 دینے کے لیے ایتھنول سے دوبارہ تیار کیا گیا۔
سبز کرسٹل، پگھلنے کا نقطہ 190-192℃، پیداوار 69.36%؛ IR (KBr) ν=3424 (NH), 2228 (C≡N), 1720 (C=O), 1621 (C=N) cm−1۔ 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9.3 (br s, H, NH, قابل تبادلہ), 7.69-8.51 (m, 18H, heteroaromatic), 9.16 (s, 1H, CH=), 8.54 (s, 1H=)؛ C33H21N3O (475.53): C, 83.35; ح، 4.45; این، 8.84۔ ملا: سی، 84.01; ح، 4.38; N، 8.05%۔
اینہائیڈروس ڈائی آکسین محلول کے 20 ملی لیٹر میں 4 (2 ملی میٹر، 0.7 جی) کو گھولیں (ٹرائیتھیلامین کے چند قطرے پر مشتمل)، فینی ہائیڈرازائن/2-امینوپیریڈین (2 ملی میٹر) شامل کریں اور کمرے کے درجہ حرارت پر بالترتیب 1 اور 2 گھنٹے تک ہلائیں۔ رد عمل کے آمیزے کو برف یا پانی میں ڈالیں اور ہائیڈروکلورک ایسڈ کے ساتھ تیزابیت کریں۔ الگ کیے گئے ٹھوس کو فلٹر کریں اور 7 حاصل کرنے کے لیے ایتھنول سے دوبارہ کرسٹالائز کریں اور 8 حاصل کرنے کے لیے بینزین سے دوبارہ کرسٹالائز کریں۔
سبز کرسٹل، پگھلنے کا نقطہ 160-162℃، پیداوار 77%؛ IR (KBr, ν, cm−1): 3245 (NH), 2222 (C≡N), 1691 (C=O), 1671 (C=O) cm−1۔ 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 10.88 (s, 1H, NH, قابل تبادلہ), 9.15 (s, 1H, CH=), 8.81 (s, 1H, CH=), 6.78-8.58 (m, oaromatic, heter); C42H26N4O2 (618.68): C, 81.54; ح، 4.24; این، 9.06۔ ملا: ج، 81.96; ح، 3.91; N، 8.91%۔
4 (2 ملی میٹر، 0.7 جی) کو 20 ملی لیٹر اینہائیڈروس ڈائی آکسین محلول میں تحلیل کیا گیا تھا (جس میں ٹرائیتھیلامین کے چند قطرے شامل تھے)، 2-امینوپیریڈین (2 ملی میٹر، 0.25 جی) شامل کیا گیا تھا اور اس مرکب کو کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک ہلایا گیا تھا۔ رد عمل کے مرکب کو برف کے پانی میں ڈالا گیا اور اسے پتلا ہائیڈروکلورک ایسڈ سے تیزاب بنایا گیا۔ تشکیل شدہ ورن کو فلٹر کیا گیا اور بینزین سے دوبارہ تشکیل دیا گیا، جس سے 146-148 °C کے پگھلنے کے نقطہ کے ساتھ 8 کے سبز کرسٹل اور 82.5% کی پیداوار حاصل ہوئی۔ انفراریڈ سپیکٹرم (KBr) ν: 3148 (NH)، 2222 (C≡N)، 1665 (C=O) cm−1۔ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 8.78 (s, H, NH, قابل تبادلہ), 9.14 (s, 1H, CH=), 7.36-8.55 (m, 13H, heteroaromatization); C23H15N3O (348.38): C, 79.07; ح، 4.33; N، 12.03. ملا: ج، 78.93; ح، 3.97; N، 12.36%۔
مرکب 4 (2 ملی میٹر، 0.7 جی) کو 20 ملی لیٹر خشک ڈائی آکسین میں تحلیل کیا گیا تھا (جس میں ٹرائیتھیلامین کے چند قطرے اور تھیوریا/سیمی کاربازائڈ کے 2 ملی میٹر ہوتے ہیں) اور ریفلوکس کے نیچے 2 گھنٹے تک گرم کیا جاتا ہے۔ سالوینٹس vacuo میں بخارات بن گیا تھا۔ مکسچر دینے کے لیے باقیات کو ڈائی آکسین سے دوبارہ تیار کیا گیا تھا۔