ہم نے پہلے اطلاع دی تھی کہ جگر کے فبروسس کے مریضوں میں گٹ سے ماخوذ ٹرپٹوفن میٹابولائٹ انڈول 3-پروپینک ایسڈ (IPA) کے سیرم کی سطح کم ہے۔ اس مطالعے میں، ہم نے سیرم IPA کی سطح کے سلسلے میں موٹے جگروں میں ٹرانسکرپٹوم اور DNA میتھائلوم کے ساتھ ساتھ وٹرو میں ہیپاٹک سٹیلیٹ سیلز (HSCs) کے فینوٹائپک غیر فعال ہونے میں IPA کے کردار کی تحقیقات کی۔
مطالعہ میں 116 موٹے مریض شامل تھے جن کی قسم 2 ذیابیطس میلیتس (T2DM) (عمر 46.8 ± 9.3 سال؛ BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) تھی جنہوں نے Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS) میں باریاٹرک سرجری کروائی تھی۔ گردش کرنے والی IPA کی سطح کو مائع کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹومیٹری (LC-MS) کے ذریعہ ماپا گیا تھا، جگر کا ٹرانسکرپٹوم تجزیہ کل RNA ترتیب کے ذریعہ کیا گیا تھا، اور DNA میتھیلیشن تجزیہ Infinium HumanMethylation450 BeadChip کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ ہیومن ہیپاٹک سٹیلیٹ سیل (LX-2) کو وٹرو تجربات میں استعمال کیا گیا تھا۔
سیرم IPA کی سطح جگر میں apoptotic، mitophagic، اور لمبی عمر کے راستوں میں شامل جینوں کے اظہار کے ساتھ منسلک ہے۔ AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) جین جگر کی نقل اور DNA میتھیلیشن پروفائلز میں سب سے زیادہ پرچر اور غالب بات چیت کرنے والا جین تھا۔ IPA کے علاج نے اپوپٹوس کی حوصلہ افزائی کی، مائٹوکونڈریل سانس لینے میں کمی، اور سیل مورفولوجی اور مائٹوکونڈریل حرکیات کو تبدیل کر کے جینوں کے اظہار کو ماڈیول کر کے جو فائبروسس، اپوپٹوسس، اور LX-2 خلیوں کی بقا کو منظم کرنے کے لیے جانا جاتا ہے۔
ایک ساتھ مل کر، یہ اعداد و شمار اس بات کی تائید کرتے ہیں کہ IPA کے ممکنہ علاج کے اثرات ہیں اور یہ اپوپٹوس کو آمادہ کر سکتا ہے اور HSC فینوٹائپ کو ایک غیر فعال حالت کی طرف منتقل کر سکتا ہے، اس طرح HSC ایکٹیویشن اور مائٹوکونڈریل میٹابولزم میں مداخلت کرکے جگر کے فائبروسس کو روکنے کے امکان کو بڑھاتا ہے۔
موٹاپا اور میٹابولک سنڈروم کا پھیلاؤ میٹابولک طور پر وابستہ فیٹی جگر کی بیماری (MASLD) کے بڑھتے ہوئے واقعات سے وابستہ ہے۔ یہ بیماری عام آبادی کے 25% سے 30% کو متاثر کرتی ہے [1]۔ ایم اے ایس ایل ڈی ایٹولوجی کا بنیادی نتیجہ جگر کی فبروسس ہے، ایک متحرک عمل جس کی خصوصیت فائبروس ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ECM) کے مسلسل جمع ہونے سے ہوتی ہے [2]۔ جگر کے فبروسس میں شامل اہم خلیات ہیپاٹک سٹیلٹ سیل (HSCs) ہیں، جو چار معروف فینوٹائپس کی نمائش کرتے ہیں: خاموش، متحرک، غیر فعال، اور سنسنی [3، 4]۔ HSCs کو چالو کیا جا سکتا ہے اور α-smooth muscle actin (α-SMA) اور ٹائپ I کولیجن (Col-I) [5, 6] کے بڑھتے ہوئے اظہار کے ساتھ، ایک پرسکون شکل سے پھیلنے والے فائبروبلاسٹ جیسے خلیات میں منتقل کیا جا سکتا ہے۔ جگر کے فبروسس کے الٹ جانے کے دوران، فعال HSCs کو اپوپٹوس یا غیر فعال کرنے کے ذریعے ختم کیا جاتا ہے۔ ان عملوں میں فائبروجینک جینز کی کمی اور پروسرائیول جینز کی ماڈیولیشن (جیسے NF-κB اور PI3K/Akt سگنلنگ پاتھ ویز) [7، 8]، نیز مائٹوکونڈریل ڈائنامکس اور فنکشن میں تبدیلیاں شامل ہیں [9]۔
آنت میں پیدا ہونے والے ٹرپٹوفن میٹابولائٹ انڈول-3-پروپینک ایسڈ (IPA) کے سیرم کی سطح کو انسانی میٹابولک امراض بشمول MASLD [10-13] میں کم پایا گیا ہے۔ IPA غذائی ریشہ کی مقدار کے ساتھ منسلک ہے، اس کے اینٹی آکسیڈینٹ اور سوزش کے اثرات کے لیے جانا جاتا ہے، اور Vivo اور in Vitro [11-14] میں غذا سے متاثر غیر الکوحل سٹیٹو ہیپاٹائٹس (NASH) فینوٹائپ کو کم کرتا ہے۔ ہمارے پچھلے مطالعے سے کچھ شواہد سامنے آئے ہیں، جس نے یہ ظاہر کیا ہے کہ کووپیو باریاٹرک سرجری اسٹڈی (KOBS) میں جگر کے فائبروسس کے بغیر موٹے مریضوں کی نسبت جگر کے فائبروسس کے مریضوں میں سیرم IPA کی سطح کم تھی۔ مزید برآں، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ IPA کا علاج ان جینوں کے اظہار کو کم کر سکتا ہے جو سیل آسنجن، سیل ہجرت اور انسانی ہیپاٹک سٹیلیٹ سیل (LX-2) ماڈل میں ہیماٹوپوئٹک سٹیم سیل ایکٹیویشن کے کلاسیکی مارکر ہیں اور ایک ممکنہ ہیپاٹوپروٹیکٹو میٹابولائٹ ہے [15]۔ تاہم، یہ ابھی تک واضح نہیں ہے کہ کس طرح IPA HSC اپوپٹوسس اور mitochondrial bioenergetics کو چالو کرکے جگر کے فبروسس ریگریشن کو اکساتا ہے۔
یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ سیرم IPA موٹے لیکن غیر ٹائپ 2 ذیابیطس (KOBS) افراد کے جگر میں apoptosis، mitophagy، اور لمبی عمر کے راستے میں افزودہ جین کے اظہار سے وابستہ ہے۔ مزید برآں، ہم نے پایا کہ IPA غیر فعال ہونے کے راستے کے ذریعے ایکٹیویٹڈ ہیماٹوپوئٹک اسٹیم سیلز (HSCs) کی کلیئرنس اور انحطاط کا باعث بن سکتا ہے۔ یہ نتائج IPA کے لیے ایک نئے کردار کو ظاہر کرتے ہیں، جو اسے جگر کے فبروسس ریگریشن کو فروغ دینے کے لیے ایک ممکنہ علاج کا ہدف بناتے ہیں۔
KOBS کوہورٹ میں ایک پچھلی تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ جگر کے فبروسس کے مریضوں میں جگر کے فبروسس کے مریضوں کے مقابلے میں کم گردش کرنے والی IPA کی سطح ہوتی ہے [15]۔ ٹائپ 2 ذیابیطس کے ممکنہ الجھنے والے اثر کو خارج کرنے کے لیے، ہم نے 116 موٹے مریضوں کو بغیر ٹائپ 2 ذیابیطس کے بھرتی کیا (مطلب عمر ± SD: 46.8 ± 9.3 سال؛ BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (ٹیبل 1) جاری مطالعہ [KOBS] کے مطالعہ سے۔ تمام شرکاء نے تحریری طور پر باخبر رضامندی دی اور مطالعہ کے پروٹوکول کو ہیلسنکی کے اعلامیہ (54/2005، 104/2008 اور 27/2010) کے مطابق نارتھ ساو کاؤنٹی ہسپتال کی اخلاقیات کمیٹی نے منظور کیا۔
جگر کے بایپسی کے نمونے باریٹرک سرجری کے دوران حاصل کیے گئے تھے اور تجربہ کار پیتھالوجسٹ کے ذریعہ پہلے بیان کردہ معیار [17، 18] کے مطابق ہسٹولوجیکل طور پر اندازہ کیا گیا تھا۔ تشخیص کے معیار کا خلاصہ ضمنی جدول S1 میں کیا گیا ہے اور پہلے بیان کیا جا چکا ہے [19]۔
میٹابولومکس تجزیہ (n = 116) کے لئے غیر ہدف شدہ مائع کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹومیٹری (LC-MS) کے ذریعہ روزہ رکھنے والے سیرم کے نمونوں کا تجزیہ کیا گیا۔ نمونوں کا تجزیہ UHPLC-qTOF-MS سسٹم (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ isopropyl الکحل (IPA) کی شناخت برقرار رکھنے کے وقت اور MS/MS سپیکٹرم کے خالص معیارات کے ساتھ موازنہ پر مبنی تھی۔ مزید تمام تجزیوں میں IPA سگنل کی شدت (چوٹی کا علاقہ) پر غور کیا گیا [20]۔
Illumina HiSeq 2500 کا استعمال کرتے ہوئے پورے جگر کی RNA کی ترتیب کی گئی تھی اور ڈیٹا کو پہلے سے پروسیس کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [19، 21، 22]۔ ہم نے MitoMiner 4.0 ڈیٹا بیس [23] سے منتخب کردہ 1957 جینز کا استعمال کرتے ہوئے مائٹوکونڈریل فنکشن/بائیوجینیسیس کو متاثر کرنے والے ٹرانسکرپٹس کے ٹارگٹڈ تفریق اظہار کا تجزیہ کیا۔ جگر کا ڈی این اے میتھیلیشن تجزیہ Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina، San Diego، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے اسی طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا [24، 25]۔
ہیومن ہیپاٹک سٹیلیٹ سیلز (LX-2) برائے مہربانی پروفیسر سٹیفانو رومیو کے ذریعہ فراہم کیے گئے تھے اور انہیں DMEM/F12 میڈیم (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco,010-10) میں مہذب اور برقرار رکھا گیا تھا۔ IPA کی ورکنگ ڈوز کو منتخب کرنے کے لیے، LX-2 سیلز کا علاج DMEM/F12 میڈیم میں IPA کی مختلف ارتکاز (10 μM، 100 μM اور 1 mM؛ سگما، 220027) کے ساتھ 24 گھنٹے کے لیے کیا گیا۔ مزید برآں، HSCs کو غیر فعال کرنے کے لیے IPA کی صلاحیت کی چھان بین کرنے کے لیے، LX-2 خلیوں کو 5 ng/ml TGF-β1 (R&D سسٹمز، 240-B-002/CF) اور 1 mM IPA کے ساتھ سیرم فری میڈیم میں 24 گھنٹے کے لیے علاج کیا گیا۔ متعلقہ گاڑیوں کے کنٹرول کے لیے، 0.1٪ BSA پر مشتمل 4 nM HCL کو TGF-β1 علاج کے لیے استعمال کیا گیا تھا اور 0.05٪ DMSO کو IPA کے علاج کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور دونوں کو امتزاج کے علاج کے لیے ایک ساتھ استعمال کیا گیا تھا۔
مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit کا استعمال کرتے ہوئے Apoptosis کا اندازہ 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) کے ساتھ کیا گیا۔ مختصراً، LX-2 (1 × 105 خلیات/کنویں) کو راتوں رات 12 کنویں پلیٹوں میں کلچر کیا گیا اور پھر IPA یا IPA اور TGF-β1 کی متعدد خوراکوں سے علاج کیا گیا۔ اگلے دن، تیرتے اور پیروکار خلیوں کو اکٹھا کیا گیا، ٹرپسنائز کیا گیا، پی بی ایس سے دھویا گیا، اینیکسن وی بائنڈنگ بفر میں دوبارہ معطل کیا گیا، اور 15 منٹ کے لیے FITC-Annexin V اور 7-AAD کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔
Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (تھرمو فشر سائنٹیفک، کارلسباد، CA) کا استعمال کرتے ہوئے زندہ خلیوں میں مائٹوکونڈریا کو آکسیڈیٹیو سرگرمی کے لیے داغ دیا گیا تھا۔ MTR اسسیس کے لئے، LX-2 خلیات IPA اور TGF-β1 کے ساتھ مساوی کثافت پر لگائے گئے تھے۔ 24 گھنٹے کے بعد، زندہ خلیوں کو ٹرپسنائز کیا گیا، PBS سے دھویا گیا، اور پھر 100 μM MTR کے ساتھ سیرم فری میڈیم میں 37 ° C پر 20 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [26]۔ لائیو سیل مورفولوجی تجزیہ کے لیے، سیل کے سائز اور سائٹوپلاسمک پیچیدگی کا بالترتیب فارورڈ سکیٹر (FSC) اور سائیڈ سکیٹر (SSC) پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔
تمام ڈیٹا (30,000 واقعات) NovoCyte Quanteon (Agilent) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے تھے اور NovoExpress® 1.4.1 یا FlowJo V.10 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا تھا۔
آکسیجن کی کھپت کی شرح (OCR) اور ایکسٹرا سیلولر تیزابیت کی شرح (ECAR) کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) کا استعمال کرتے ہوئے حقیقی وقت میں ناپا گیا۔ مختصراً، 2 × 104 LX-2 خلیات/ کنویں کو XF96 سیل کلچر پلیٹوں پر سیڈ کیا گیا۔ راتوں رات انکیوبیشن کے بعد، خلیوں کا علاج isopropanol (IPA) اور TGF-β1 (ضمنی طریقے 1) سے کیا گیا۔ ڈیٹا کا تجزیہ Seahorse XF Wave سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، جس میں Seahorse XF سیل انرجی فینوٹائپ ٹیسٹ رپورٹ جنریٹر شامل ہے۔ اس سے، ایک Bioenergetic ہیلتھ انڈیکس (BHI) کا حساب لگایا گیا [27]۔
کل آر این اے کو سی ڈی این اے میں نقل کیا گیا تھا۔ مخصوص طریقوں کے لیے حوالہ دیکھیں [15]۔ انسانی 60S رائبوسومل ایسڈک پروٹین P0 (RPLP0) اور cyclophilin A1 (PPIA) mRNA کی سطح کو جزوی جین کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ QuantStudio 6 pro Real-Time PCR سسٹم (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) TaqMan™ فاسٹ ایڈوانسڈ ماسٹر مکس کٹ (اپلائیڈ بایو سسٹم) یا Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) کے ساتھ استعمال کیا گیا تھا، اور اس کا استعمال کرتے ہوئے c-coltated قدر کی گئی تھی۔ سائیکلنگ پیرامیٹرز (ΔΔCt) اور ∆∆Ct طریقہ۔ پرائمر کی تفصیلات سپلیمنٹری ٹیبلز S2 اور S3 میں فراہم کی گئی ہیں۔
نیوکلیئر DNA (ncDNA) اور mitochondrial DNA (mtDNA) DNeasy خون اور ٹشو کٹ (Qiagen) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [28]۔ mtDNA کی نسبتہ مقدار کا حساب ہر ہدف mtDNA خطے کے تناسب کو تین جوہری DNA خطوں (mtDNA/ncDNA) کے ہندسی وسط کے حساب سے لگایا گیا تھا، جیسا کہ ضمنی طریقے 2 میں تفصیل سے بتایا گیا ہے۔ mtDNA اور ncDNA کے لیے پرائمر کی تفصیلات ضمنی 4 میں فراہم کی گئی ہیں۔
انٹر سیلولر اور انٹرا سیلولر مائٹوکونڈریل نیٹ ورکس کو دیکھنے کے لیے لائیو سیلز کو Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) سے داغ دیا گیا تھا۔ LX-2 خلیات (1 × 104 خلیات / کنویں) کو شیشے کے نیچے والی کلچر پلیٹوں (Ibidi GmbH، Martinsried، Germany) میں شیشے کی سلائیڈوں پر کلچر کیا گیا تھا۔ 24 گھنٹے کے بعد، لائیو LX-2 خلیوں کو 100 μM MTR کے ساتھ 20 منٹ کے لیے 37 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا اور سیل نیوکلی کو DAPI (1 μg/ml، سگما-Aldrich) سے داغ دیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [29]۔ Mitochondrial نیٹ ورکس کو Zeiss Axio Observer inverted microscope (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا جو کہ Zeiss LSM 800 confocal ماڈیول سے لیس 37 °C پر مرطوب ماحول میں 5% CO2 کے ساتھ 63×NA 1.3 آبجیکٹ کا استعمال کرتے ہوئے۔ ہم نے ہر نمونے کی قسم کے لیے دس Z سیریز کی تصاویر حاصل کیں۔ ہر Z- سیریز میں 30 حصے ہوتے ہیں، ہر ایک کی موٹائی 9.86 μm ہوتی ہے۔ ہر نمونے کے لیے، ZEN 2009 سافٹ ویئر (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے دس مختلف شعبوں کی تصاویر حاصل کی گئیں، اور Supplementary Methods3 میں تفصیلی پیرامیٹرز کے مطابق ImageJ سافٹ ویئر (v1.54d) [30, 31] کا استعمال کرتے ہوئے مائٹوکونڈریل مورفولوجی تجزیہ کیا گیا۔
خلیوں کو 0.1 M فاسفیٹ بفر میں 2% glutaraldehyde کے ساتھ طے کیا گیا تھا، اس کے بعد 1% osmium tetroxide محلول (Sigma Aldrich, MO, USA) کے ساتھ طے کیا گیا تھا، آہستہ آہستہ ایسیٹون (Merck, Darmstadt, Germany) کے ساتھ پانی کی کمی کی گئی تھی، اور آخر میں ایمبیڈڈ انڈیپوکس۔ الٹراتھن حصوں کو 1٪ یورینیل ایسیٹیٹ (مرک، ڈرمسٹیٹ، جرمنی) اور 1٪ لیڈ سائٹریٹ (مرک، ڈرمسٹڈ، جرمنی) کے ساتھ تیار اور داغ دیا گیا تھا۔ الٹراسٹرکچرل امیجز JEM 2100F EXII ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) کا استعمال کرتے ہوئے 80 kV کی تیز رفتار وولٹیج پر حاصل کی گئیں۔
IPA کے ساتھ 24 گھنٹے تک علاج کیے گئے LX-2 خلیوں کی شکل کا تجزیہ Zeiss inverted light microscope (Zeiss Axio Vert.A1 اور AxioCam MRm, Jena, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے 50x میگنیفیکیشن پر فیز کنٹراسٹ مائکروسکوپی کے ذریعے کیا گیا۔
کلینیکل ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف یا میڈین (انٹرکوارٹائل رینج: IQR) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ تین مطالعاتی گروپوں کے درمیان فرق کا موازنہ کرنے کے لیے تغیر (مسلسل متغیرات) یا χ² ٹیسٹ (قطعی متغیرات) کا یک طرفہ تجزیہ استعمال کیا گیا۔ غلط مثبت شرح (FDR) کو متعدد ٹیسٹنگ کے لیے درست کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور FDR <0.05 والے جینز کو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔ اسپیئر مین کے ارتباط کا تجزیہ CpG DNA میتھیلیشن کو IPA سگنل کی شدت کے ساتھ جوڑنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، برائے نام p اقدار (p <0.05) کی اطلاع کے ساتھ۔
پاتھ وے کا تجزیہ ویب پر مبنی جین سیٹ تجزیہ ٹول (ویب جیسٹالٹ) کا استعمال کرتے ہوئے 268 ٹرانسکرپٹس ( برائے نام p < 0.01)، 119 مائٹوکونڈریا سے وابستہ ٹرانسکرپٹس ( برائے نام p <0.05)، اور 4350 سی پی جیز کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا جو براہ راست 33 سے زائد اسکرپٹ سے وابستہ تھے۔ IPA کی سطح آزادانہ طور پر دستیاب وینی ڈی بی (ورژن 2.1.0) ٹول اوور لیپنگ جینز کو تلاش کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور اسٹرنگ ڈی بی (ورژن 11.5) کو پروٹین-پروٹین کے تعاملات کو دیکھنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔
LX-2 کے تجربے کے لیے، D'Agostino-Pearson ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے نمونے معمول کے مطابق جانچے گئے۔ ڈیٹا کم از کم تین حیاتیاتی نقلوں سے حاصل کیا گیا اور بونفرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ کے ساتھ یک طرفہ انووا کا نشانہ بنایا گیا۔ 0.05 سے کم کی پی ویلیو کو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔ ڈیٹا کو اوسط ± SD کے طور پر پیش کیا جاتا ہے، اور ہر اعداد و شمار میں تجربات کی تعداد کی نشاندہی کی جاتی ہے۔ تمام تجزیے اور گراف ونڈوز کے لیے گراف پیڈ پرزم 8 شماریاتی سافٹ ویئر (GraphPad Software Inc.، ورژن 8.4.3، San Diego, USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تھے۔
سب سے پہلے، ہم نے جگر، پورے جسم، اور مائٹوکونڈریل ٹرانسکرپٹس کے ساتھ سیرم IPA کی سطح کی وابستگی کی تحقیقات کی۔ کل ٹرانسکرپٹ پروفائل میں، سیرم IPA کی سطحوں سے وابستہ سب سے مضبوط جین MAPKAPK3 تھا (FDR = 0.0077؛ mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3)؛ مائٹوکونڈریا سے متعلقہ ٹرانسکرپٹ پروفائل میں، سب سے مضبوط منسلک جین AKT1 تھا (FDR = 0.7621؛ AKT serine/threonine kinase 1) (اضافی فائل 1 اور اضافی فائل 2)۔
اس کے بعد ہم نے عالمی ٹرانسکرپٹس (n = 268؛ p <0.01) اور مائٹوکونڈریا سے وابستہ ٹرانسکرپٹس (n = 119؛ p <0.05) کا تجزیہ کیا، بالآخر apoptosis کو سب سے اہم کیننیکل راستہ (p = 0.0089) کے طور پر شناخت کیا۔ سیرم IPA کی سطحوں سے وابستہ مائٹوکونڈریل ٹرانسکرپٹس کے لیے، ہم نے اپوپٹوس (FDR = 0.00001)، mitophagy (FDR = 0.00029)، اور TNF سگنلنگ پاتھ ویز (FDR = 0.000006) (شکل 1A، ٹیبل 2، اور SB اپوٹریس) پر توجہ مرکوز کی۔
سیرم IPA کی سطح کے ساتھ مل کر انسانی جگر میں عالمی، مائٹوکونڈریا سے وابستہ ٹرانسکرپٹس، اور ڈی این اے میتھیلیشن کا اوور لیپنگ تجزیہ۔ A 268 عالمی ٹرانسکرپٹس، 119 مائٹوکونڈریا سے وابستہ ٹرانسکرپٹس، اور ڈی این اے میتھلیٹڈ ٹرانسکرپٹس کی نمائندگی کرتا ہے جو سیرم آئی پی اے لیولز سے وابستہ 3092 سی پی جی سائٹس پر میپ کیے گئے ہیں (عالمی ٹرانسکرپٹس اور ڈی این اے میتھلیٹیڈ کے لیے p ویلیوز < 0.01، اور p ویلیوز <0.01 کے لیے p. بڑے اوور لیپنگ ٹرانسکرپٹس کو درمیان میں دکھایا گیا ہے (AKT1 اور YKT6)۔ B دوسرے جینوں کے ساتھ سب سے زیادہ تعامل سکور (0.900) والے 13 جینوں کا تعامل کا نقشہ 56 اوورلیپنگ جینز (بلیک لائن ریجن) سے بنایا گیا تھا جو آن لائن ٹول StringDB کا استعمال کرتے ہوئے سیرم IPA کی سطح سے نمایاں طور پر وابستہ تھے۔ سبز: جینز کو جین اونٹولوجی (GO) سیلولر جزو: مائٹوکونڈریا (GO: 0005739) سے نقشہ بنایا گیا ہے۔ AKT1 وہ پروٹین ہے جس کا سب سے زیادہ سکور (0.900) ڈیٹا کی بنیاد پر دوسرے پروٹین کے ساتھ تعامل کے لیے ہوتا ہے (ٹیکسٹ مائننگ، تجربات، ڈیٹا بیس، اور شریک اظہار کی بنیاد پر)۔ نیٹ ورک نوڈس پروٹین کی نمائندگی کرتے ہیں، اور کنارے پروٹین کے درمیان روابط کی نمائندگی کرتے ہیں۔
چونکہ گٹ مائکرو بائیوٹا میٹابولائٹس ڈی این اے میتھیلیشن [32] کے ذریعے ایپی جینیٹک مرکب کو منظم کرسکتے ہیں، ہم نے جانچ کی کہ آیا سیرم آئی پی اے کی سطح جگر کے ڈی این اے میتھیلیشن سے وابستہ تھی۔ ہم نے پایا کہ سیرم IPA کی سطح سے وابستہ دو بڑی میتھیلیشن سائٹس پرولین سیرین سے بھرپور خطہ 3 (C19orf55) اور ہیٹ شاک پروٹین فیملی بی (چھوٹا) ممبر 6 (HSPB6) (اضافی فائل 3) کے قریب تھیں۔ 4350 CpG (p <0.01) کا DNA میتھیلیشن سیرم IPA کی سطح سے منسلک تھا اور لمبی عمر کے ریگولیٹری راستوں (p = 0.006) (شکل 1A، جدول 2، اور ضمنی شکل 1C) میں افزودہ تھا۔
سیرم IPA کی سطح، عالمی ٹرانسکرپٹس، مائٹوکونڈریا سے وابستہ ٹرانسکرپٹس، اور انسانی جگر میں ڈی این اے میتھیلیشن کے درمیان تعلق رکھنے والے حیاتیاتی میکانزم کو سمجھنے کے لیے، ہم نے پچھلے راستے کے تجزیہ (شکل 1A) میں شناخت شدہ جینوں کا اوورلیپ تجزیہ کیا۔ 56 اوور لیپنگ جینز (شکل 1A میں بلیک لائن کے اندر) کے پاتھ وے افزودگی کے تجزیے کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ اپوپٹوسس پاتھ وے (p = 0.00029) نے تینوں تجزیوں میں مشترک دو جینوں کو اجاگر کیا: AKT1 اور YKT6 (YKT6 v-SNARE)، Venlogy کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ شکل 2 اور شکل 1A)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے پایا کہ AKT1 (cg19831386) اور YKT6 (cg24161647) مثبت طور پر سیرم IPA کی سطح (اضافی فائل 3) کے ساتھ منسلک تھے۔ جین کی مصنوعات کے درمیان ممکنہ پروٹین کے تعاملات کی نشاندہی کرنے کے لیے، ہم نے ان پٹ کے طور پر 56 اوورلیپنگ جینز میں سب سے زیادہ مشترکہ ریجن سکور (0.900) کے ساتھ 13 جینز کا انتخاب کیا اور ایک تعامل کا نقشہ بنایا۔ اعتماد کی سطح (معمولی اعتماد) کے مطابق، سب سے زیادہ سکور (0.900) کے ساتھ AKT1 جین سب سے اوپر تھا (شکل 1B)۔
راستے کے تجزیے کی بنیاد پر، ہم نے پایا کہ اپوپٹوس ایک بڑا راستہ تھا، لہذا ہم نے تفتیش کی کہ آیا IPA کا علاج وٹرو میں HSCs کے apoptosis کو متاثر کرے گا۔ ہم نے پہلے یہ ظاہر کیا تھا کہ IPA کی مختلف خوراکیں (10 μM، 100 μM، اور 1 mM) LX-2 خلیوں کے لیے غیر زہریلی تھیں [15]۔ اس مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ 10 μM اور 100 μM پر IPA کے علاج نے قابل عمل اور نیکروٹک خلیوں کی تعداد میں اضافہ کیا۔ تاہم، کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، سیل کی عملداری 1 ایم ایم IPA حراستی میں کم ہوئی، جبکہ سیل نیکروسس کی شرح میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی (شکل 2A، B)۔ اگلا، LX-2 خلیوں میں apoptosis دلانے کے لیے زیادہ سے زیادہ ارتکاز تلاش کرنے کے لیے، ہم نے 24 h کے لیے 10 μM، 100 μM، اور 1 mM IPA کا تجربہ کیا (شکل 2A-E اور ضمنی شکل 3A-B)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ IPA 10 μM اور 100 μM نے apoptosis کی شرح (%) کو کم کیا، تاہم، IPA 1 mM نے کنٹرول کے مقابلے میں دیر سے apoptosis اور apoptosis کی شرح (%) میں اضافہ کیا اور اس لیے اسے مزید تجربات کے لیے منتخب کیا گیا (اعداد و شمار 2A – D)۔
IPA LX-2 خلیوں کے apoptosis کو اکساتا ہے۔ انیکسن V اور 7-AAD ڈبل سٹیننگ کا طریقہ اپوپٹوٹک ریٹ اور سیل مورفولوجی کو بہاؤ سائٹوومیٹری کے ذریعہ مقدار درست کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ BA خلیوں کو 24 گھنٹے کے لیے 10 μM، 100 μM اور 1 mM IPA کے ساتھ یا F–H TGF-β1 (5 ng/ml) اور 1 mM IPA کے ساتھ 24 گھنٹے کے لیے سیرم فری میڈیم میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ A: زندہ خلیات (Annexin V -/ 7AAD-)؛ B: necrotic خلیات (Annexin V -/ 7AAD+)؛ C, F: ابتدائی (Annexin V +/ 7AAD-)؛ D, G: لیٹ (Annexin V+/7AAD.+)؛ ای، ایچ: اپوپٹوٹک ریٹ (%) میں کل ابتدائی اور دیر سے اپوپٹوٹک خلیوں کا فیصد۔ ڈیٹا کو اوسط ± SD، n = 3 آزاد تجربات کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ بونفرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ کے ساتھ یک طرفہ انووا کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی موازنہ کیا گیا۔ *p <0.05; ****p <0.0001
جیسا کہ ہم نے پہلے دکھایا ہے، 5 ng/ml TGF-β1 کلاسیکی مارکر جینز [15] کے اظہار کو بڑھا کر HSC ایکٹیویشن کو آمادہ کر سکتا ہے۔ LX-2 خلیوں کا علاج 5 ng/ml TGF-β1 اور 1 mM IPA کے ساتھ کیا گیا (تصویر 2E–H)۔ TGF-β1 کے علاج سے اپوپٹوس کی شرح میں کوئی تبدیلی نہیں آئی، تاہم، IPA کے شریک علاج نے TGF-β1 علاج (تصویر 2E–H) کے مقابلے میں دیر سے اپوپٹوسس اور اپوپٹوس کی شرح (%) میں اضافہ کیا۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ 1 ایم ایم IPA TGF-β1 انڈکشن سے آزادانہ طور پر LX-2 خلیوں میں apoptosis کو فروغ دے سکتا ہے۔
ہم نے LX-2 خلیوں میں mitochondrial سانس پر IPA کے اثر کی مزید تفتیش کی۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 1 ایم ایم آئی پی اے نے آکسیجن کی کھپت کی شرح (او سی آر) کے پیرامیٹرز میں کمی کی: غیر مائٹوکونڈریل سانس، بنیادی اور زیادہ سے زیادہ سانس، پروٹون لیک اور اے ٹی پی کی پیداوار کنٹرول گروپ (فگر 3 اے، بی) کے مقابلے میں، جبکہ بائیو انرجیٹک ہیلتھ انڈیکس (BHI) تبدیل نہیں ہوا۔
IPA LX-2 خلیوں میں مائٹوکونڈریل سانس کو کم کرتا ہے۔ mitochondrial respiration curve (OCR) کو mitochondrial respiration parameters کے طور پر پیش کیا جاتا ہے (نان مائٹوکونڈریل ریسپیریشن، بیسل ریسپیریشن، زیادہ سے زیادہ ریسیپشن، پروٹون لیک، ATP جنریشن، SRC اور BHI)۔ سیل A اور B بالترتیب 24 گھنٹے کے لئے 10 μM، 100 μM اور 1 mM IPA کے ساتھ لگائے گئے تھے۔ سیل C اور D کو بالترتیب 24 گھنٹے کے لئے سیرم فری میڈیم میں TGF-β1 (5 ng/ml) اور 1 mM IPA کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ سائکوانٹ کٹ کا استعمال کرتے ہوئے تمام پیمائشوں کو ڈی این اے مواد میں معمول بنایا گیا تھا۔ BHI: بایو انرجیٹک ہیلتھ انڈیکس؛ ایس آر سی: سانس کی ریزرو صلاحیت؛ OCR: آکسیجن کی کھپت کی شرح۔ ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف (SD)، n = 5 آزاد تجربات کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ شماریاتی موازنہ یک طرفہ انووا اور بونفرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ *p <0.05; **p <0.01؛ اور ***p <0.001
TGF-β1-ایکٹیویٹڈ LX-2 سیلز کے بائیو انرجیٹک پروفائل پر IPA کے اثر کے بارے میں مزید جامع تفہیم حاصل کرنے کے لیے، ہم نے OCR (تصویر 3C،D) کے ذریعے مائٹوکونڈریل آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن کا تجزیہ کیا۔ نتائج سے ظاہر ہوا کہ TGF-β1 کا علاج کنٹرول گروپ (تصویر 3C،D) کے مقابلے میں زیادہ سے زیادہ سانس لینے، سانس لینے کی ریزرو صلاحیت (SRC) اور BHI کو کم کر سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، امتزاج کے علاج سے بنیادی تنفس، پروٹون لیک اور اے ٹی پی کی پیداوار میں کمی واقع ہوئی، لیکن SRC اور BHI TGF-β1 (تصویر 3C،D) کے ساتھ علاج کیے جانے والوں سے نمایاں طور پر زیادہ تھے۔
ہم نے سی ہارس سافٹ ویئر کے ذریعہ فراہم کردہ "سیلولر انرجی فینوٹائپ ٹیسٹ" بھی انجام دیا (ضمنی شکل 4A–D)۔ جیسا کہ ضمنی شکل 3B میں دکھایا گیا ہے، TGF-β1 علاج کے بعد OCR اور ECAR دونوں میٹابولک صلاحیتوں میں کمی واقع ہوئی، تاہم، کنٹرول گروپ کے مقابلے میں امتزاج اور IPA ٹریٹمنٹ گروپس میں کوئی فرق نہیں دیکھا گیا۔ مزید برآں، کنٹرول گروپ (ضمیمہ تصویر 4C) کے مقابلے امتزاج اور IPA علاج کے بعد OCR کی بنیادی اور تناؤ کی سطح دونوں میں کمی واقع ہوئی۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ امتزاج تھراپی کے ساتھ بھی ایسا ہی نمونہ دیکھا گیا، جہاں TGF-β1 علاج (ضمیمہ تصویر 4C) کے مقابلے ECAR کی بنیادی اور تناؤ کی سطح میں کوئی تبدیلی نہیں دیکھی گئی۔ HSCs میں، mitochondrial oxidative phosphorylation میں کمی اور TGF-β1 علاج کی نمائش کے بعد SCR اور BHI کو بحال کرنے کے امتزاج علاج کی صلاحیت نے میٹابولک صلاحیت (OCR اور ECAR) کو تبدیل نہیں کیا۔ ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ IPA HSCs میں بائیو انرجیٹکس کو کم کر سکتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ IPA ایک کم توانائی بخش پروفائل پیدا کر سکتا ہے جو HSC فینوٹائپ کو غیر فعال کرنے کی طرف لے جاتا ہے (ضمنی شکل 4D)۔
مائٹوکونڈریل ڈائنامکس پر آئی پی اے کے اثر کی جانچ مائٹوکونڈریل مورفولوجی اور نیٹ ورک کنیکشن کے ساتھ ساتھ ایم ٹی آر سٹیننگ (شکل 4 اور ضمنی شکل 5) کی سہ جہتی مقدار کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ شکل 4 سے پتہ چلتا ہے کہ، کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، TGF-β1 کے علاج نے اوسط سطح کے رقبے، برانچ نمبر، کل برانچ کی لمبائی، اور برانچ جنکشن نمبر (شکل 4A اور B) میں کمی کی اور مائٹوکونڈریا کے تناسب کو کروی سے انٹرمیڈیٹ مورفولوجی میں تبدیل کر دیا (شکل 4C)۔ صرف IPA کے علاج نے ہی مائٹوکونڈریل حجم کو کم کیا اور کنٹرول گروپ (شکل 4A) کے مقابلے مائٹوکونڈریا کے تناسب کو کروی سے انٹرمیڈیٹ مورفولوجی میں تبدیل کردیا۔ اس کے برعکس، گولائی، اوسط شاخ کی لمبائی، اور مائٹوکونڈریل سرگرمی جس کا اندازہ مائٹوکونڈریل جھلی پوٹینشل پر منحصر ایم ٹی آر (فگر 4A اور E) کے ذریعے کیا گیا ہے، کوئی تبدیلی نہیں کی گئی اور یہ پیرامیٹرز گروپوں کے درمیان مختلف نہیں تھے۔ ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ TGF-β1 اور IPA کا علاج مائٹوکونڈریل شکل اور سائز کے ساتھ ساتھ LX-2 خلیوں میں نیٹ ورک کی پیچیدگی کو ماڈیول کرتا ہے۔
IPA LX-2 خلیوں میں مائٹوکونڈریل ڈائنامکس اور مائٹوکونڈریل ڈی این اے کی کثرت کو تبدیل کرتا ہے۔ A. سیرم فری میڈیم میں 24 گھنٹے کے لیے TGF-β1 (5 ng/ml) اور 1 mM IPA کے ساتھ انکیوبیٹڈ لائیو LX-2 سیلز کی نمائندہ کنفوکل تصاویر جو Mitotracker™ Red CMXRos سے داغے ہوئے مائٹوکونڈریل نیٹ ورک اور DAPI کے ساتھ نیلے رنگ کے داغے ہوئے دکھائے گئے ہیں۔ تمام ڈیٹا میں فی گروپ کم از کم 15 تصاویر شامل ہیں۔ ہم نے ہر نمونہ کی قسم کے لیے 10 زیڈ اسٹیک تصاویر حاصل کیں۔ ہر Z-axis تسلسل میں 30 سلائسیں ہوتی ہیں، ہر ایک کی موٹائی 9.86 μm ہوتی ہے۔ اسکیل بار: 10 μm۔ B. نمائندہ آبجیکٹ (صرف مائٹوکونڈریا) تصویر پر انکولی حد کو لاگو کرکے شناخت کیا جاتا ہے۔ مقداری تجزیہ اور مائٹوکونڈریل مورفولوجیکل نیٹ ورک کنیکشن کا موازنہ ہر گروپ کے تمام خلیوں کے لئے کیا گیا تھا۔ C. مائٹوکونڈریل شکل کے تناسب کی فریکوئنسی۔ 0 کے قریب کی قدریں کروی شکلوں کی نشاندہی کرتی ہیں، اور 1 کے قریب کی قدریں تنتی شکلوں کی نشاندہی کرتی ہیں۔ D Mitochondrial DNA (mtDNA) مواد کا تعین کیا گیا جیسا کہ مواد اور طریقوں میں بیان کیا گیا ہے۔ E Mitotracker™ Red CMXRos تجزیہ فلو سائٹومیٹری (30,000 واقعات) کے ذریعے کیا گیا جیسا کہ مواد اور طریقوں میں بیان کیا گیا ہے۔ ڈیٹا کو اوسط ± SD، n = 3 آزاد تجربات کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ شماریاتی موازنہ یک طرفہ انووا اور بونفرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ *p <0.05; **p <0.01؛ ***p <0.001؛ ****p <0.0001
اس کے بعد ہم نے LX-2 خلیوں میں mtDNA مواد کا تجزیہ مائٹوکونڈریل نمبر کے اشارے کے طور پر کیا۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، TGF-β1-علاج شدہ گروپ (شکل 4D) میں mtDNA مواد میں اضافہ کیا گیا تھا۔ TGF-β1-علاج شدہ گروپ کے ساتھ مقابلے میں، ایم ٹی ڈی این اے کے مواد کو کمبی نیشن ٹریٹمنٹ گروپ (فگر 4 ڈی) میں کم کیا گیا تھا، یہ تجویز کرتا ہے کہ آئی پی اے ایم ٹی ڈی این اے مواد کو کم کر سکتا ہے اور ممکنہ طور پر مائٹوکونڈریل نمبر کے ساتھ ساتھ مائٹوکونڈریل سانس (فگر 3C)۔ مزید برآں، ایسا لگتا ہے کہ IPA امتزاج کے علاج میں mtDNA مواد کو کم کرتا ہے لیکن MTR- ثالثی مائٹوکونڈریل سرگرمی (اعداد و شمار 4A – C) کو متاثر نہیں کرتا ہے۔
ہم نے LX-2 خلیات (شکل 5A – D) میں فائبروسس، اپوپٹوسس، بقا، اور مائٹوکونڈریل ڈائنامکس سے وابستہ جینوں کی mRNA سطحوں کے ساتھ IPA کی وابستگی کی تحقیقات کی۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، TGF-β1-علاج شدہ گروپ نے جینوں کے بڑھتے ہوئے اظہار کو ظاہر کیا جیسے کولیجن قسم I α2 چین (COL1A2)، α-ہموار پٹھوں کی ایکٹین (αSMA)، میٹرکس میٹالوپروٹینیس 2 (MMP2)، میٹالوپروٹینیس کے ٹشو روکنے والا (TIMP11)، dyRPnae1 (dyRPnae1)، بڑھتی ہوئی فبروسس اور ایکٹیویشن کا اشارہ. مزید برآں، کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، TGF-β1 علاج نے نیوکلیئر پریگنین ایکس ریسیپٹر (PXR)، کیسپیس 8 (CASP8)، MAPKAPK3، B-cell α کو روکنے والا، جوہری عنصر κ جین لائٹ پیپٹائڈ (NFκB1A) کو بڑھانے والا، اور نیوکلیئر فیکٹر β κ نیوکلیئر کو روکنے والے کی ایم آر این اے کی سطح کو کم کیا۔ (IKBKB) (شکل 5A–D)۔ TGF-β1 علاج کے مقابلے میں، TGF-β1 اور IPA کے ساتھ امتزاج علاج نے COL1A2 اور MMP2 کے اظہار کو کم کیا، لیکن PXR، TIMP1، B-cell lymphoma-2 (BCL-2)، CASP8، NFκB1A، NFκB1-، BKβ اور BK کی mRNA کی سطح میں اضافہ کیا۔ IPA کے علاج سے MMP2، Bcl-2 سے وابستہ پروٹین X (BAX)، AKT1، آپٹک ایٹروفی پروٹین 1 (OPA1) اور mitochondrial fusion protein 2 (MFN2) کے اظہار میں نمایاں کمی واقع ہوئی، جبکہ CASP8، NFκB1A، NFκB1B، اور IKBKB کے مقابلے میں گروپ کنٹرول میں اضافہ ہوا۔ تاہم، کیسپیس 3 (CASP3)، apoptotic peptidase ایکٹیوٹنگ فیکٹر 1 (APAF1)، mitochondrial فیوژن پروٹین 1 (MFN1)، اور فِشن پروٹین 1 (FIS1) کے اظہار میں کوئی فرق نہیں پایا گیا۔ اجتماعی طور پر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ IPA کا علاج فبروسس، اپوپٹوسس، بقا، اور مائٹوکونڈریل حرکیات سے وابستہ جینوں کے اظہار کو ماڈیول کرتا ہے۔ ہمارے اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ IPA علاج LX-2 خلیوں میں فائبروسس کو کم کرتا ہے۔ ایک ہی وقت میں، یہ فینوٹائپ کو غیر فعال کرنے کی طرف منتقل کرکے بقا کو متحرک کرتا ہے۔
IPA LX-2 خلیوں میں fibroblast، apoptotic، viability، اور mitochondrial dynamics genes کے اظہار کو ماڈیول کرتا ہے۔ ہسٹوگرامز اینڈوجینس کنٹرول (RPLP0 یا PPIA) کے نسبت mRNA اظہار ظاہر کرتے ہیں جب LX-2 خلیوں کو TGF-β1 اور IPA کے ساتھ 24 گھنٹے تک سیرم فری میڈیم میں شامل کیا گیا تھا۔ A fibroblasts کی نشاندہی کرتا ہے، B apoptotic خلیات کی نشاندہی کرتا ہے، C زندہ رہنے والے خلیوں کی نشاندہی کرتا ہے، اور D مائٹوکونڈریل ڈائنامکس جین اظہار کی نشاندہی کرتا ہے۔ ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف (SD)، n = 3 آزاد تجربات کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ شماریاتی موازنہ یک طرفہ انووا اور بونفرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ *p <0.05; **p <0.01؛ ***p <0.001؛ ****p <0.0001
اس کے بعد، سیل کے سائز (FSC-H) اور سائٹوپلاسمک پیچیدگی (SSC-H) میں تبدیلیوں کا اندازہ بہاؤ سائٹومیٹری (شکل 6A، B) کے ذریعے کیا گیا، اور IPA کے علاج کے بعد سیل مورفولوجی میں تبدیلیوں کا اندازہ ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM) اور فیز کنٹراسٹ مائیکروسکوپی (Supplementary F6B) کے ذریعے کیا گیا۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، TGF-β1-علاج شدہ گروپ کے خلیات کنٹرول گروپ (فگر 6A,B) کے مقابلے میں سائز میں بڑھے ہیں، جو کسی نہ کسی طرح کے اینڈوپلاسمک ریٹیکولم (ER*) اور phagolysosomes (P) کی کلاسک توسیع کو ظاہر کرتے ہیں، جو کہ hematopoietic اسٹیم سیل (HSC) ایکٹیویشن (ضمنی شکل 6) کی نشاندہی کرتے ہیں۔ تاہم، TGF-β1-علاج شدہ گروپ کے مقابلے میں، TGF-β1 اور IPA امتزاج علاج گروپ (ضمیمہ تصویر 6A) میں سیل سائز، سائٹوپلاسمک پیچیدگی (تصویر 6A,B) اور ER* مواد میں کمی واقع ہوئی۔ مزید برآں، کنٹرول گروپ کے مقابلے میں IPA ٹریٹمنٹ نے سیل کے سائز، سائٹوپلاسمک پیچیدگی (Figs. 6A,B)، P اور ER* مواد (ضمنی شکل 6A) میں کمی کی۔ اس کے علاوہ، کنٹرول گروپ (سفید تیر، ضمنی شکل 6B) کے مقابلے IPA علاج کے 24 گھنٹے کے بعد اپوپٹوٹک خلیوں کے مواد میں اضافہ ہوا۔ اجتماعی طور پر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ 1 ایم ایم آئی پی اے ایچ ایس سی اپوپٹوسس کو متحرک کر سکتا ہے اور TGF-β1 کے ذریعہ سیل مورفولوجیکل پیرامیٹرز میں ہونے والی تبدیلیوں کو ریورس کر سکتا ہے، اس طرح سیل کے سائز اور پیچیدگی کو منظم کرتا ہے، جو HSC کے غیر فعال ہونے سے وابستہ ہو سکتا ہے۔
IPA LX-2 خلیوں میں سیل کے سائز اور سائٹوپلاسمک پیچیدگی کو تبدیل کرتا ہے۔ بہاؤ سائٹومیٹری تجزیہ کی نمائندہ تصاویر۔ تجزیہ میں LX-2 خلیوں کے لیے مخصوص گیٹنگ حکمت عملی کا استعمال کیا گیا: سیل کی آبادی کی وضاحت کے لیے SSC-A/FSC-A، FSC-H/FSC-A ڈبلٹس کی شناخت کے لیے، اور SSC-H/FSC-H سیل کے سائز اور پیچیدگی کے تجزیہ کے لیے۔ خلیوں کو 24 گھنٹے کے لئے سیرم فری میڈیم میں TGF-β1 (5 ng/ml) اور 1 mM IPA کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ LX-2 خلیوں کو نچلے بائیں کواڈرینٹ (SSC-H-/FSC-H-)، اوپری بائیں کواڈرینٹ (SSC-H+/FSC-H-)، نچلے دائیں کواڈرینٹ (SSC-H-/FSC-H+)، اور اوپری دائیں کواڈرینٹ (SSC-H+/FSC-H+) میں تقسیم کیا گیا تھا۔ B. سیل مورفولوجی کا تجزیہ FSC-H (فارورڈ سکیٹر، سیل سائز) اور SSC-H (سائیڈ سکیٹر، سائٹوپلاسمک پیچیدگی) (30,000 واقعات) کا استعمال کرتے ہوئے فلو سائٹومیٹری کے ذریعے کیا گیا۔ ڈیٹا کو اوسط ± SD، n = 3 آزاد تجربات کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ شماریاتی موازنہ یک طرفہ انووا اور بونفرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ *p <0.05; **p <0.01؛ ***p <0.001 اور ****p <0.0001
گٹ میٹابولائٹس جیسے کہ آئی پی اے تحقیق کا ایک گرما گرم موضوع بن گیا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ گٹ مائیکرو بائیوٹا میں نئے اہداف دریافت کیے جا سکتے ہیں۔ لہذا یہ دلچسپ ہے کہ IPA، ایک میٹابولائٹ جسے ہم نے انسانوں میں جگر کے فبروسس سے منسلک کیا ہے [15]، جانوروں کے ماڈلز میں ایک ممکنہ اینٹی فبروٹک مرکب دکھایا گیا ہے [13، 14]۔ یہاں، ہم پہلی بار سیرم IPA اور گلوبل لیور ٹرانسکرپٹومکس اور DNA میتھیلیشن کے درمیان وابستگی کا مظاہرہ کرتے ہیں بغیر ٹائپ 2 ذیابیطس (T2D) کے موٹے افراد میں، apoptosis، mitophagy اور لمبی عمر کو نمایاں کرتے ہوئے، نیز جگر کے ہومیوسٹاسس کو منظم کرنے والے ممکنہ امیدوار جین AKT1۔ ہمارے مطالعے کا ایک اور نیاپن یہ ہے کہ ہم نے LX-2 خلیوں میں اپوپٹوس، سیل مورفولوجی، مائٹوکونڈریل بائیو اینرجیٹکس اور ڈائنامکس کے ساتھ IPA کے علاج کے تعامل کا مظاہرہ کیا، جس سے کم توانائی کے اسپیکٹرم کی نشاندہی ہوتی ہے جو HSC فینوٹائپ کو غیر فعال کرنے کی طرف لے جاتا ہے، IPA کو جگر کے فائیروسیس کو بہتر بنانے کا ایک ممکنہ امیدوار بناتا ہے۔
ہم نے پایا کہ apoptosis، mitophagy اور لمبی عمر سیرم IPA سے وابستہ جگر کے جینوں میں افزودہ سب سے اہم کینونیکل راستے تھے۔ مائٹوکونڈریل کوالٹی کنٹرول (MQC) کے نظام میں خلل مائٹوکونڈریل dysfunction، mitophagy اور apoptosis کا باعث بن سکتا ہے، اس طرح MASLD کی موجودگی کو فروغ دیتا ہے[33, 34]۔ لہذا، ہم قیاس کر سکتے ہیں کہ IPA جگر میں apoptosis، mitophagy اور لمبی عمر کے ذریعے سیل کی حرکیات اور mitochondrial سالمیت کو برقرار رکھنے میں ملوث ہو سکتا ہے۔ ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ دو جین تین اسسیس میں عام تھے: YKT6 اور AKT1۔ یہ بات قابل غور ہے کہ YKT6 ایک SNARE پروٹین ہے جو سیل میمبرین فیوژن کے عمل میں شامل ہے۔ یہ آٹوفاگوسوم پر STX17 اور SNAP29 کے ساتھ ایک ابتدائی کمپلیکس تشکیل دے کر آٹوفجی اور مائٹوفگی میں ایک کردار ادا کرتا ہے، اس طرح آٹوفاگوسوم اور لائزوسومز کے فیوژن کو فروغ دیتا ہے[35]۔ مزید برآں، YKT6 فنکشن میں کمی کے نتیجے میں خرابی مائٹوفجی[36]، جبکہ YKT6 کی اپ گریجشن ہیپاٹو سیلولر کارسنوما (HCC) کے بڑھنے سے وابستہ ہے، جس میں خلیوں کی بقا میں اضافہ ہوتا ہے[37]۔ دوسری طرف، AKT1 سب سے اہم بات چیت کرنے والا جین ہے اور جگر کی بیماریوں میں اہم کردار ادا کرتا ہے، بشمول PI3K/AKT سگنلنگ پاتھ وے، سیل سائیکل، سیل ہجرت، پھیلاؤ، فوکل آسنجن، مائٹوکونڈریل فنکشن، اور کولیجن سراو[38–40]۔ ایکٹیویٹڈ PI3K/AKT سگنلنگ پاتھ وے ہیماٹوپوئٹک اسٹیم سیلز (HSCs) کو چالو کر سکتا ہے، جو ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ECM) کی تیاری کے لیے ذمہ دار خلیات ہیں، اور اس کی بے ضابطگی جگر کے فبروسس کی موجودگی اور بڑھنے میں معاون ثابت ہو سکتی ہے[40]۔ اس کے علاوہ، AKT سیل کی بقا کے اہم عوامل میں سے ایک ہے جو p53 پر منحصر سیل اپوپٹوسس کو روکتا ہے، اور AKT ایکٹیویشن جگر کے سیل اپوپٹوسس کی روک تھام سے وابستہ ہو سکتا ہے[41, 42]۔ حاصل کردہ نتائج بتاتے ہیں کہ IPA جگر کے مائٹوکونڈریا سے وابستہ اپوپٹوسس میں شامل ہو سکتا ہے اور اپوپٹوسس میں داخل ہونے یا بقا کے درمیان ہیپاٹوسائٹس کے فیصلے کو متاثر کر سکتا ہے۔ ان اثرات کو AKT اور/یا YKT6 امیدوار جینز کے ذریعے منظم کیا جا سکتا ہے، جو جگر کے ہومیوسٹاسس کے لیے اہم ہیں۔
ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 1 ایم ایم آئی پی اے نے اپوپٹوسس کی حوصلہ افزائی کی اور TGF-β1 علاج سے آزاد LX-2 خلیوں میں مائٹوکونڈریل سانس میں کمی واقع ہوئی۔ یہ قابل ذکر ہے کہ اپوپٹوس فبروسس ریزولوشن اور ہیماٹوپوائٹک اسٹیم سیل (HSC) ایکٹیویشن کا ایک اہم راستہ ہے، اور یہ جگر کے فبروسس [4، 43] کے الٹ جانے والے جسمانی ردعمل میں بھی ایک اہم واقعہ ہے۔ مزید یہ کہ، امتزاج علاج کے بعد LX-2 خلیوں میں BHI کی بحالی نے mitochondrial bioenergetics کے ضابطے میں IPA کے ممکنہ کردار کے بارے میں نئی ​​بصیرت فراہم کی۔ آرام کرنے اور غیر فعال حالات میں، ہیماٹوپوئٹک خلیات عام طور پر مائٹوکونڈریل آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن کو اے ٹی پی بنانے کے لیے استعمال کرتے ہیں اور ان کی میٹابولک سرگرمی کم ہوتی ہے۔ دوسری طرف، HSC ایکٹیویشن مائٹوکونڈریل سانس اور بائیو سنتھیسز کو بڑھاتا ہے تاکہ گلیکولٹک حالت میں داخل ہونے کی توانائی کی ضروریات کو پورا کیا جا سکے [44]۔ حقیقت یہ ہے کہ IPA نے میٹابولک صلاحیت کو متاثر نہیں کیا اور ECAR سے پتہ چلتا ہے کہ گلیکولیٹک راستے کو کم ترجیح دی گئی ہے۔ اسی طرح، ایک اور تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ 1 ایم ایم آئی پی اے کارڈیو مایوسائٹس، ہیومن ہیپاٹوسائٹ سیل لائن (Huh7) اور انسانی نال کی رگوں کے اینڈوتھیلیل سیلز (HUVEC) میں مائٹوکونڈریل سانس کی زنجیر کی سرگرمی کو ماڈیول کرنے کے قابل تھا۔ تاہم، کارڈیو مایوسائٹس میں گلائکولائسز پر IPA کا کوئی اثر نہیں پایا گیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ IPA دیگر خلیوں کی اقسام کے بائیو انرجیٹکس کو متاثر کر سکتا ہے [45]۔ لہذا، ہم قیاس کرتے ہیں کہ 1 ایم ایم آئی پی اے ایک ہلکے کیمیکل انکوپلر کے طور پر کام کر سکتا ہے، کیونکہ یہ ایم ٹی ڈی این اے کی مقدار کو تبدیل کیے بغیر فائبروجینک جین کے اظہار، سیل مورفولوجی اور مائٹوکونڈریل بائیو اینرجیٹکس کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے [46]۔ Mitochondrial uncouplers ثقافت کی حوصلہ افزائی فبروسس اور HSC ایکٹیویشن کو روک سکتے ہیں [47] اور mitochondrial ATP کی پیداوار کو کم کر سکتے ہیں جو کچھ پروٹینز جیسے کہ uncoupling proteins (UCP) یا ایڈنائن نیوکلیوٹائڈ ٹرانسلوکیس (ANT) کے ذریعے ریگولیٹ یا حوصلہ افزائی کرتے ہیں۔ سیل کی قسم پر منحصر ہے، یہ رجحان خلیات کو apoptosis سے بچا سکتا ہے اور/یا apoptosis کو فروغ دے سکتا ہے [46]۔ تاہم، ہیماٹوپوئٹک اسٹیم سیل غیر فعال ہونے میں ایک مائٹوکونڈریل انکوپلر کے طور پر IPA کے کردار کو واضح کرنے کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے۔
اس کے بعد ہم نے تفتیش کی کہ آیا مائٹوکونڈریل سانس میں تبدیلیاں زندہ LX-2 خلیوں میں مائٹوکونڈریل مورفولوجی میں ظاہر ہوتی ہیں۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ، TGF-β1 کا علاج مائٹوکونڈریل تناسب کو کروی سے انٹرمیڈیٹ میں تبدیل کرتا ہے، جس میں مائٹوکونڈریل برانچنگ میں کمی اور DRP1 کے اظہار میں اضافہ ہوتا ہے، جو مائٹوکونڈریل فِشن کا ایک اہم عنصر ہے [48]۔ مزید برآں، مائٹوکونڈریل فریگمنٹیشن نیٹ ورک کی مجموعی پیچیدگی سے وابستہ ہے، اور فیوژن سے فیوژن میں منتقلی ہیماٹوپوئٹک اسٹیم سیل (HSC) ایکٹیویشن کے لیے اہم ہے، جب کہ mitochondrial fission کی روک تھام HSC apoptosis [49] کا باعث بنتی ہے۔ اس طرح، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ TGF-β1 کا علاج برانچنگ میں کمی کے ساتھ مائٹوکونڈریل نیٹ ورک کی پیچیدگی میں کمی کا باعث بن سکتا ہے، جو کہ ایکٹیویٹڈ ہیماٹوپوئٹک اسٹیم سیلز (HSCs) سے وابستہ مائٹوکونڈریل فیوژن میں زیادہ عام ہے۔ مزید برآں، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ IPA مائٹوکونڈریا کے تناسب کو کروی سے درمیانی شکل میں تبدیل کر سکتا ہے، اس طرح OPA1 اور MFN2 کے اظہار کو کم کر سکتا ہے۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ OPA1 کی تنزلی مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت میں کمی کا سبب بن سکتی ہے اور سیل اپوپٹوس کو متحرک کر سکتی ہے[50]۔ MFN2 mitochondrial فیوژن اور apoptosis [51] میں ثالثی کے لیے جانا جاتا ہے۔ حاصل کردہ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ TGF-β1 اور/یا IPA کے ذریعہ LX-2 خلیوں کی شمولیت مائٹوکونڈریل شکل اور سائز کے ساتھ ساتھ ایکٹیویشن اسٹیٹ اور نیٹ ورک کی پیچیدگی کو ماڈیول کرتی ہے۔
ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ TGFβ-1 اور IPA کا امتزاج علاج ایم ٹی ڈی این اے اور سیل مورفولوجیکل پیرامیٹرز کو اپوپٹوس سے بچنے والے خلیوں میں فائبروسس، اپوپٹوسس اور بقا سے متعلق جینوں کے ایم آر این اے اظہار کو منظم کرکے کم کرسکتا ہے۔ درحقیقت، IPA نے AKT1 کے mRNA اظہار کی سطح اور COL1A2 اور MMP2 جیسے اہم فبروسس جینز کو کم کیا، لیکن CASP8 کے اظہار کی سطح میں اضافہ کیا، جو apoptosis سے وابستہ ہے۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ IPA کے علاج کے بعد، BAX اظہار میں کمی آئی اور TIMP1 فیملی سبونٹس، BCL-2 اور NF-κB کے mRNA اظہار میں اضافہ ہوا، یہ تجویز کرتا ہے کہ IPA ہیماٹوپوئٹک اسٹیم سیلز (HSCs) میں بقا کے اشاروں کو متحرک کر سکتا ہے جو اپوپٹوسس سے بچتے ہیں۔ یہ مالیکیول فعال ہیماٹوپوئٹک اسٹیم سیلز میں بقا کے حامی سگنل کے طور پر کام کر سکتے ہیں، جو کہ اینٹی اپوپٹوٹک پروٹینز (جیسے Bcl-2) کے بڑھتے ہوئے اظہار، پرو اپوپٹوٹک BAX کے اظہار میں کمی، اور TIMP اور NF-κB کے درمیان ایک پیچیدہ تعامل سے وابستہ ہو سکتے ہیں۔ IPA PXR کے ذریعے اپنے اثرات مرتب کرتا ہے، اور ہم نے پایا کہ TGF-β1 اور IPA کے ساتھ امتزاج کے علاج سے PXR mRNA اظہار کی سطح میں اضافہ ہوا ہے، جو HSC ایکٹیویشن کو دبانے کی نشاندہی کرتا ہے۔ چالو PXR سگنلنگ ویوو اور وٹرو دونوں میں HSC ایکٹیویشن کو روکنے کے لیے جانا جاتا ہے [52، 53]۔ ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ IPA اپوپٹوسس کو فروغ دے کر، فبروسس اور مائٹوکونڈریل میٹابولزم کو کم کر کے، اور بقا کے سگنلز کو بڑھا کر ایکٹیویٹڈ HSCs کی کلیئرنس میں حصہ لے سکتا ہے، جو کہ عام عمل ہیں جو فعال HSC فینوٹائپ کو غیر فعال میں تبدیل کر دیتے ہیں۔ اپوپٹوسس میں IPA کے ممکنہ طریقہ کار اور کردار کی ایک اور ممکنہ وضاحت یہ ہے کہ یہ بنیادی طور پر مائٹوفجی (اندرونی راستہ) اور خارجی TNF سگنلنگ پاتھ وے (ٹیبل 1) کے ذریعے غیر فعال مائٹوکونڈریا کو ختم کرتا ہے، جس کا براہ راست تعلق NF-κB سروائیول سائن اپ وے (NF-κB) سے جڑا ہوا ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ IPA سے متعلق افزودہ جین اپوپٹوٹک پاتھ وے [54] میں پرو اپوپٹوٹک اور بقا کے حامی سگنلز کو دلانے کے قابل ہیں، یہ تجویز کرتے ہیں کہ IPA ان جینوں کے ساتھ بات چیت کرکے اپوپٹوٹک پاتھ وے یا بقا کو آمادہ کرسکتا ہے۔ تاہم، HSC ایکٹیویشن کے دوران IPA کس طرح اپوپٹوس یا بقا کی حوصلہ افزائی کرتا ہے اور اس کے میکانکی راستے ابھی تک واضح نہیں ہیں۔
IPA ایک مائکروبیل میٹابولائٹ ہے جو گٹ مائکرو بائیوٹا کے ذریعے غذائی ٹریپٹوفن سے بنتا ہے۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ اس میں آنتوں کے ماحول میں سوزش، اینٹی آکسیڈینٹ، اور ایپی جینیٹک ریگولیٹری خصوصیات ہیں۔[55] مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ IPA آنتوں کی رکاوٹ کے کام کو تبدیل کر سکتا ہے اور آکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کر سکتا ہے، جو اس کے مقامی جسمانی اثرات میں حصہ ڈال سکتا ہے۔[56] درحقیقت، IPA کو گردش کے ذریعے ہدف کے اعضاء تک پہنچایا جاتا ہے، اور چونکہ IPA ٹرپٹوفن، سیروٹونن، اور انڈول ڈیریویٹوز کے ساتھ ایک جیسا بڑا میٹابولائٹ ڈھانچہ رکھتا ہے، اس لیے IPA میٹابولک کارروائیوں کو انجام دیتا ہے جس کے نتیجے میں مسابقتی میٹابولک قسمت ہوتی ہے۔[52] IPA ممکنہ طور پر عام میٹابولک راستوں میں خلل ڈالتے ہوئے خامروں یا رسیپٹرز پر بائنڈنگ سائٹس کے لیے ٹرپٹوفن سے ماخوذ میٹابولائٹس کا مقابلہ کر سکتا ہے۔ یہ اس کے فارماکوکائنیٹکس اور فارماکوڈینامکس پر مزید مطالعات کی ضرورت کو اجاگر کرتا ہے تاکہ اس کے علاج کی کھڑکی کو بہتر طور پر سمجھا جا سکے۔[57] یہ دیکھنا باقی ہے کہ آیا یہ ہیماٹوپوئٹک اسٹیم سیلز (HSCs) میں بھی ہوسکتا ہے۔
ہم تسلیم کرتے ہیں کہ ہمارے مطالعے کی کچھ حدود ہیں۔ خاص طور پر IPA سے متعلق انجمنوں کا جائزہ لینے کے لیے، ہم نے ٹائپ 2 ذیابیطس mellitus (T2DM) والے مریضوں کو خارج کر دیا۔ ہم تسلیم کرتے ہیں کہ یہ ہمارے نتائج کے وسیع اطلاق کو ٹائپ 2 ذیابیطس اور جدید جگر کی بیماری والے مریضوں پر محدود کرتا ہے۔ اگرچہ انسانی سیرم میں IPA کا جسمانی ارتکاز 1–10 μM [11, 20] ہے، لیکن 1 mM IPA کا ارتکاز سب سے زیادہ غیر زہریلا ارتکاز [15] اور اپوپٹوسس کی بلند ترین شرح کی بنیاد پر منتخب کیا گیا تھا، جس میں نیکروٹک سیل کی آبادی کے فیصد میں کوئی فرق نہیں تھا۔ اگرچہ اس مطالعے میں IPA کی سپر فزیولوجیکل سطحوں کا استعمال کیا گیا تھا، فی الحال IPA کی مؤثر خوراک کے بارے میں کوئی اتفاق رائے نہیں ہے [52]۔ اگرچہ ہمارے نتائج اہم ہیں، IPA کی وسیع تر میٹابولک قسمت تحقیق کا ایک فعال علاقہ ہے۔ مزید یہ کہ سیرم آئی پی اے کی سطح اور جگر کی نقلوں کے ڈی این اے میتھیلیشن کے مابین وابستگی کے بارے میں ہمارے نتائج نہ صرف ہیماٹوپوائٹک اسٹیم سیلز (HSCs) سے حاصل کیے گئے تھے بلکہ جگر کے ٹشوز سے بھی حاصل کیے گئے تھے۔ ہم نے ٹرانسکرپٹوم تجزیہ سے اپنے پچھلے نتائج کی بنیاد پر انسانی LX-2 خلیوں کو استعمال کرنے کا انتخاب کیا کہ IPA ہیماٹوپوائٹک اسٹیم سیل (HSC) ایکٹیویشن [15] سے وابستہ ہے، اور HSCs جگر کے فبروسس کے بڑھنے میں ملوث بڑے خلیات ہیں۔ جگر متعدد سیل اقسام پر مشتمل ہوتا ہے، اس لیے دوسرے سیل ماڈلز جیسے ہیپاٹوسائٹ-ایچ ایس سی-امیون سیل کو کلچر سسٹم جس میں کیسپیس ایکٹیویشن اور ڈی این اے فریگمنٹیشن کے ساتھ ساتھ عمل کے طریقہ کار بشمول پروٹین لیول پر غور کیا جانا چاہیے تاکہ IPA کے کردار اور جگر کی دیگر اقسام کے ساتھ اس کے تعامل کا مطالعہ کیا جا سکے۔