مضمون تحقیقی عنوان کا حصہ ہے "پیتھوجینز اور کیڑوں کے خلاف پھلوں کی مزاحمت کو بہتر بنانا"، تمام 5 مضامین دیکھیں
فنگل پلانٹ کی بیماری نیکروسس Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary کا کارگر ایجنٹ مختلف میزبان پودوں کو متاثر کرنے کے لیے کثیر سطحی حکمت عملی کا استعمال کرتا ہے۔ یہ مطالعہ ڈائمین L-ornithine کے استعمال کی تجویز پیش کرتا ہے، ایک غیر پروٹین امینو ایسڈ جو دوسرے ضروری امینو ایسڈز کی ترکیب کو متحرک کرتا ہے، Pseudomonas sclerotiorum کی وجہ سے سفید سانچے میں Phaseolus vulgaris L. کے مالیکیولر، فزیولوجیکل اور بائیو کیمیکل ردعمل کو بڑھانے کے لیے متبادل انتظامی حکمت عملی کے طور پر۔ ان وٹرو تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ L-ornithine خوراک پر منحصر انداز میں S. pyrenoidosa کی mycelial بڑھوتری کو نمایاں طور پر روکتا ہے۔ مزید یہ کہ یہ گرین ہاؤس حالات میں سفید سڑنا کی شدت کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے۔ مزید برآں، L-ornithine نے علاج شدہ پودوں کی نشوونما کو متحرک کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ L-ornithine کی جانچ شدہ ارتکاز علاج شدہ پودوں کے لیے phytotoxic نہیں تھی۔ اس کے علاوہ، L-ornithine نے غیر انزیمیٹک اینٹی آکسائیڈنٹس (کل گھلنشیل فینولکس اور flavonoids) اور enzymatic antioxidants (catalase (CAT)، peroxidase (POX)، اور polyphenol oxidase (PPO)) کے اظہار کو بڑھایا، اور تین اینٹی آکسیڈینٹ سے متعلق PODCVAT، اور PODCV1 جینز (PODCV1) کے اظہار کو بڑھایا۔ مزید برآں، سلیکو تجزیہ میں S. sclerotiorum genome میں ایک putative oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) پروٹین کی موجودگی کا انکشاف ہوا، جو Aspergillus fijiensis (AfOAH) اور Penicillium sp کے oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) پروٹین سے انتہائی مشابہت رکھتا تھا۔ (PlOAH) فنکشنل تجزیہ، محفوظ ڈومینز، اور ٹوپولوجی کے لحاظ سے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ آلو ڈیکسٹروز شوربے (PDB) میڈیم میں L-ornithine کے اضافے نے S. sclerotiorum mycelia میں SsOAH جین کے اظہار میں نمایاں کمی کی۔ اسی طرح، L-ornithine کے خارجی استعمال نے علاج شدہ پودوں سے جمع ہونے والے فنگل مائسیلیا میں SsOAH جین کے اظہار میں نمایاں کمی کی۔ آخر میں، L-ornithine کے استعمال نے PDB میڈیم اور متاثرہ پتوں دونوں میں آکسالک ایسڈ کے اخراج میں نمایاں کمی کی۔ آخر میں، L-ornithine ریڈوکس کی حیثیت کو برقرار رکھنے کے ساتھ ساتھ متاثرہ پودوں کے دفاعی ردعمل کو بڑھانے میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے۔ اس مطالعے کے نتائج سفید سانچے کو کنٹرول کرنے اور پھلیاں کی پیداوار اور دیگر فصلوں پر اس کے اثرات کو کم کرنے کے لیے جدید، ماحول دوست طریقے تیار کرنے میں مدد کر سکتے ہیں۔
سفید سڑنا، نیکروٹروفک فنگس Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary کی وجہ سے ہوتا ہے، ایک تباہ کن، پیداوار کو کم کرنے والی بیماری ہے جو عالمی بین (Phaseolus vulgaris L.) کی پیداوار کے لیے سنگین خطرہ ہے (Bolton et al.، 2006)۔ Sclerotinia sclerotiorum ایک سب سے مشکل مٹی سے پیدا ہونے والے فنگل پودوں کے پیتھوجینز پر قابو پانا ہے، جس میں 600 سے زیادہ پودوں کی انواع کی وسیع میزبان رینج ہے اور غیر مخصوص انداز میں میزبان ٹشوز کو تیزی سے میسریٹ کرنے کی صلاحیت ہے (لیانگ اور رولنز، 2018)۔ ناموافق حالات میں، یہ اپنی زندگی کے ایک نازک مرحلے سے گزرتا ہے، طویل عرصے تک غیر فعال رہتا ہے جیسا کہ مٹی میں سیاہ، سخت، بیج نما ڈھانچے جسے 'سکلیروٹیا' کہا جاتا ہے یا مائیسیلیم یا متاثرہ پودوں کے تنے کے گڑھے میں سفید، پھڑپھڑا ہوا بڑھوتری (Schwartz et al.، 2005)۔ S. sclerotiorum sclerotia بنانے کی صلاحیت رکھتا ہے، جو اسے متاثرہ کھیتوں میں طویل عرصے تک زندہ رہنے اور بیماری کے دوران برقرار رہنے دیتا ہے (Schwartz et al.، 2005)۔ سکلیروٹیا غذائی اجزاء سے مالا مال ہوتے ہیں، مٹی میں طویل عرصے تک برقرار رہ سکتے ہیں، اور بعد میں آنے والے انفیکشن کے لیے بنیادی انوکولم کے طور پر کام کرتے ہیں (Schwartz et al.، 2005)۔ سازگار حالات میں، سکلیروٹیا اگتا ہے اور ہوا سے چلنے والے بیضوں کو پیدا کرتا ہے جو پودے کے تمام زمینی حصوں کو متاثر کر سکتا ہے، بشمول پھولوں، تنوں، یا پھلیوں تک محدود نہیں (Schwartz et al.، 2005)۔
Sclerotinia sclerotiorum اپنے میزبان پودوں کو متاثر کرنے کے لیے کثیر سطحی حکمت عملی کا استعمال کرتا ہے، جس میں sclerotial انکرن سے لے کر علامات کی نشوونما تک مربوط واقعات کا ایک سلسلہ شامل ہوتا ہے۔ ابتدائی طور پر، S. sclerotiorum کھمبی کی طرح کے ڈھانچے سے معلق بیضوں (جسے ascospores کہا جاتا ہے) پیدا کرتا ہے جسے apothecia کہا جاتا ہے، جو ہوا سے بنتے ہیں اور متاثرہ پودوں کے ملبے پر غیر متحرک سکلیروٹیا بن جاتے ہیں (Bolton et al.، 2006)۔ پھر فنگس آکسالک ایسڈ کو خارج کرتی ہے، جو کہ ایک وائرلیس عنصر ہے، جو پودوں کے خلیے کی دیوار کے پی ایچ کو کنٹرول کرتی ہے، انزیمیٹک انحطاط اور بافتوں کے حملے کو فروغ دیتی ہے (ہیگیڈس اور ریمر، 2005)، اور میزبان پودے کے آکسیڈیٹیو برسٹ کو دباتی ہے۔ تیزابیت کا یہ عمل پودوں کے خلیے کی دیوار کو کمزور کرتا ہے، فنگل سیل وال ڈیگریڈنگ انزائمز (CWDEs) کے نارمل اور موثر آپریشن کے لیے ایک سازگار ماحول فراہم کرتا ہے، جس سے پیتھوجین کو جسمانی رکاوٹ پر قابو پانے اور میزبان ٹشوز میں گھسنے کی اجازت ملتی ہے (Marciano et al., 1983)۔ ایک بار گھس جانے کے بعد، S. sclerotiorum متعدد CWDEs کو چھپاتا ہے، جیسے کہ polygalacturonase اور cellulase، جو متاثرہ ٹشوز میں اس کے پھیلاؤ کو آسان بناتے ہیں اور ٹشو نیکروسس کا سبب بنتے ہیں۔ گھاووں اور ہائفل میٹ کی ترقی سفید سڑنا کی خصوصیت کی علامات کی طرف لے جاتی ہے (ہیگیڈس اور ریمر، 2005)۔ دریں اثنا، میزبان پودے پیٹرن ریکگنیشن ریسیپٹرز (PRRs) کے ذریعے پیتھوجین سے وابستہ مالیکیولر پیٹرن (PAMPs) کو پہچانتے ہیں، جس سے سگنلنگ کے واقعات کا ایک سلسلہ شروع ہوتا ہے جو بالآخر دفاعی ردعمل کو متحرک کرتے ہیں۔
بیماریوں پر قابو پانے کی دہائیوں کی کوششوں کے باوجود، روگزن کی مزاحمت، بقا اور موافقت کی وجہ سے، دیگر تجارتی فصلوں کی طرح بین میں بھی مناسب مزاحمتی جراثیم کی کمی برقرار ہے۔ اس لیے بیماریوں کا انتظام انتہائی مشکل ہے اور اس کے لیے ایک مربوط، کثیر جہتی حکمت عملی کی ضرورت ہوتی ہے جس میں ثقافتی طریقوں، حیاتیاتی کنٹرول، اور کیمیائی فنگسائڈز (O'Sullivan et al., 2021) کا مجموعہ شامل ہو۔ سفید مولڈ کا کیمیائی کنٹرول سب سے زیادہ مؤثر ہے کیونکہ فنگسائڈس، جب صحیح طریقے سے اور صحیح وقت پر لاگو ہوتے ہیں، مؤثر طریقے سے بیماری کے پھیلاؤ کو کنٹرول کرسکتے ہیں، انفیکشن کی شدت کو کم کرسکتے ہیں، اور پیداوار کے نقصان کو کم کرسکتے ہیں۔ تاہم، فنگسائڈز کا زیادہ استعمال اور حد سے زیادہ انحصار S. sclerotiorum کے مزاحم تناؤ کے ظہور کا باعث بن سکتا ہے اور غیر ہدف والے جانداروں، مٹی کی صحت، اور پانی کے معیار پر منفی اثر ڈال سکتا ہے (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024)۔ اس لیے ماحول دوست متبادل تلاش کرنا اولین ترجیح بن گیا ہے۔
پولی مائنز (PAs)، جیسے کہ پوٹریسین، اسپرمائڈائن، اسپرمائن، اور کیڈاورین، مٹی سے پیدا ہونے والے پودوں کے پیتھوجینز کے خلاف امید افزا متبادل کے طور پر کام کر سکتے ہیں، اس طرح خطرناک کیمیائی فنگسائڈس کے استعمال کو مکمل یا جزوی طور پر کم کر سکتے ہیں (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024)۔ اعلی پودوں میں، PAs بہت سے جسمانی عملوں میں شامل ہیں جن میں سیل کی تقسیم، تفریق، اور ابیوٹک اور بائیوٹک تناؤ کا ردعمل شامل ہیں، لیکن ان تک محدود نہیں (Killiny and Nehela, 2020)۔ وہ اینٹی آکسیڈنٹ کے طور پر کام کر سکتے ہیں، رد عمل والی آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کو صاف کرنے میں مدد کر سکتے ہیں، ریڈوکس ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھ سکتے ہیں (Nehela and Killiny, 2023)، دفاع سے متعلق جینز (Romero et al.، 2018)، مختلف میٹابولک راستوں کو منظم کر سکتے ہیں (Nehela and Killiny, 2019)، نظامی حاصل شدہ مزاحمت (SAR) قائم کریں، اور پودوں کے روگجنوں کے تعامل کو منظم کریں (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022)۔ یہ بات قابل غور ہے کہ پودوں کے دفاع میں PAs کے مخصوص طریقہ کار اور کردار پودوں کی انواع، پیتھوجینز اور ماحولیاتی حالات کے لحاظ سے مختلف ہوتے ہیں۔ پودوں میں سب سے زیادہ وافر مقدار میں PA ضروری پولیمین L-ornithine (Killiny and Nehela, 2020) سے بایو سنتھیسائز کیا جاتا ہے۔
L-ornithine پودوں کی نشوونما اور نشوونما میں متعدد کردار ادا کرتا ہے۔ مثال کے طور پر، پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ چاول (اوریزا سیٹیوا) میں، اورنیتھائن کا تعلق نائٹروجن ری سائیکلنگ (Liu et al.، 2018)، چاول کی پیداوار، معیار اور خوشبو (Lu et al.، 2020)، اور پانی کے دباؤ کے ردعمل (Yang et al.، 2000) سے ہوسکتا ہے۔ مزید برآں، L-ornithine کے خارجی استعمال نے چینی چقندر (Beta vulgaris) (Hussein et al.، 2019) میں خشک سالی کی رواداری کو نمایاں طور پر بڑھایا اور پیاز (Allium Cepa) میں نمک کے تناؤ کو کم کیا پودے (da Rocha et al.، 2012)۔ ابیوٹک تناؤ کے دفاع میں L-ornithine کا ممکنہ کردار علاج شدہ پودوں میں پرولین جمع ہونے میں اس کی شمولیت کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، پرولین میٹابولزم سے متعلق جینز، جیسے کہ اورنیتھائن ڈیلٹا امینوٹرانسفریز (ڈیلٹا-او اے ٹی) اور پرولین ڈیہائیڈروجنیز (پرو ڈی ایچ 1 اور پرو ڈی ایچ 2) جینز، اس سے قبل نکوٹیانا بینتھامیانا اور عربیڈوپسس تھالیانا کے دفاع میں ملوث ہونے کی اطلاع ملی ہے۔ میسور، 2012)۔ دوسری طرف، پیتھوجین کی افزائش کے لیے فنگل اورنیتھائن ڈیکاربوکسیلیس (ODC) کی ضرورت ہے (Singh et al.، 2020)۔ Fusarium oxysporum f کے ODC کو نشانہ بنانا f. ایس پی lycopersici بذریعہ میزبان-حوصلہ افزائی جین سائیلنسنگ (HIGS) نے ٹماٹر کے پودوں کی Fusarium وِلٹ (Singh et al.، 2020) کے خلاف مزاحمت کو نمایاں طور پر بڑھایا۔ تاہم، بائیوٹک تناؤ جیسے فائٹو پیتھوجینز کے خلاف exogenous ornithine ایپلی کیشن کے ممکنہ کردار کا اچھی طرح سے مطالعہ نہیں کیا گیا ہے۔ زیادہ اہم بات یہ ہے کہ بیماری کے خلاف مزاحمت اور اس سے منسلک حیاتیاتی کیمیائی اور جسمانی مظاہر پر اورنیتھائن کے اثرات بڑی حد تک غیر دریافت ہیں۔
پھلیوں کے S. sclerotiorum انفیکشن کی پیچیدگی کو سمجھنا موثر کنٹرول کی حکمت عملیوں کی ترقی کے لیے اہم ہے۔ اس مطالعہ میں، ہم نے ڈیامین L-ornithine کے ممکنہ کردار کو دفاعی طریقہ کار اور پھلی دار پودوں کی Sclerotinia sclerotiorum انفیکشن کے خلاف مزاحمت کو بڑھانے میں ایک اہم عنصر کے طور پر شناخت کرنا تھا۔ ہم یہ قیاس کرتے ہیں کہ، متاثرہ پودوں کے دفاعی ردعمل کو بڑھانے کے علاوہ، L-ornithine بھی ریڈوکس کی حیثیت کو برقرار رکھنے میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے۔ ہم تجویز کرتے ہیں کہ L-ornithine کے ممکنہ اثرات کا تعلق انزیمیٹک اور غیر انزیمیٹک اینٹی آکسیڈینٹ دفاعی میکانزم کے ضابطے اور فنگل روگجنکیت/وائرولنس عوامل اور اس سے وابستہ پروٹین کے ساتھ مداخلت سے ہے۔ L-ornithine کی یہ دوہری فعالیت اسے سفید سانچے کے اثرات کو کم کرنے اور اس طاقتور فنگل روگزنق کے خلاف عام پھلی کی فصلوں کی مزاحمت کو بڑھانے کے لیے پائیدار حکمت عملی کے لیے ایک امید افزا امیدوار بناتی ہے۔ موجودہ مطالعے کے نتائج سفید سڑنا کو کنٹرول کرنے اور پھلوں کی پیداوار پر اس کے اثرات کو کم کرنے کے لیے جدید، ماحول دوست طریقے تیار کرنے میں مدد کر سکتے ہیں۔
اس مطالعہ میں، عام بین کی ایک حساس تجارتی قسم، گیزا 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3)، کو تجرباتی مواد کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ صحت مند بیج برائے مہربانی پھلی کے ریسرچ ڈیپارٹمنٹ، فیلڈ کراپس ریسرچ انسٹی ٹیوٹ (FCRI)، زرعی تحقیقی مرکز (ARC)، مصر کی طرف سے فراہم کیے گئے۔ پانچ بیج پلاسٹک کے برتنوں میں بوئے گئے تھے (اندرونی قطر 35 سینٹی میٹر، گہرائی 50 سینٹی میٹر) گرین ہاؤس حالات میں S. sclerotiorum-infected مٹی سے بھرے ہوئے تھے (25 ± 2 ° C، رشتہ دار نمی 75 ± 1%، 8 h روشنی/16 h تاریک)۔ بوائی کے 7-10 دن بعد (DPS)، پودوں کو پتلا کیا گیا تاکہ ہر برتن میں یکساں نشوونما کے ساتھ صرف دو پودے اور تین مکمل پھیلے ہوئے پتے رہ جائیں۔ تمام گملے والے پودوں کو ہر دو ہفتوں میں ایک بار پانی پلایا جاتا ہے اور دی گئی اقسام کے لیے تجویز کردہ شرح پر ماہانہ کھاد ڈالی جاتی ہے۔
L-ornithinediamine (جسے (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic ایسڈ بھی کہا جاتا ہے؛ سگما-Aldrich، Darmstadt، جرمنی) کی 500 mg/L ارتکاز تیار کرنے کے لیے، 50 mg کو پہلے 100 mL جراثیم سے پاک ڈسٹل واٹر میں تحلیل کیا گیا۔ اس کے بعد اسٹاک حل کو پتلا کر کے بعد کے تجربات میں استعمال کیا گیا۔ مختصراً، L-ornithine ارتکاز کی چھ سیریز (12.5، 25، 50، 75، 100، اور 125 mg/L) وٹرو میں جانچی گئیں۔ اس کے علاوہ، جراثیم سے پاک آست پانی کو منفی کنٹرول (مک) کے طور پر استعمال کیا گیا اور تجارتی فنگسائڈ "Rizolex-T" 50% wettable پاؤڈر (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Psticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governo, ایک مثبت کنٹرول مصر کے طور پر استعمال کیا گیا۔ تجارتی فنگسائڈ "Rizolex-T" کا وٹرو میں پانچ ارتکاز (2، 4، 6، 8 اور 10 ملی گرام/L) پر تجربہ کیا گیا۔
عام پھلیوں کے تنوں اور پھلیوں کے نمونے جو سفید سانچے کی مخصوص علامات کو ظاہر کرتے ہیں (تخلیق کی شرح: 10–30%) تجارتی فارموں سے جمع کیے گئے تھے۔ اگرچہ زیادہ تر متاثرہ پودوں کے مواد کی شناخت انواع/قسم (حساس تجارتی قسم گیزا 3) سے کی گئی تھی، لیکن دیگر، خاص طور پر مقامی بازاروں سے حاصل کیے گئے، نامعلوم انواع کے تھے۔ جمع کیے گئے متاثرہ مواد کو پہلے سطح پر 0.5% سوڈیم ہائپوکلورائٹ محلول سے 3 منٹ تک جراثیم سے پاک کیا گیا، پھر جراثیم سے پاک پانی سے کئی بار دھویا گیا اور اضافی پانی کو نکالنے کے لیے جراثیم سے پاک فلٹر پیپر سے خشک کیا گیا۔ اس کے بعد متاثرہ اعضاء کو درمیانی بافتوں (صحت مند اور متاثرہ ٹشوز کے درمیان) سے چھوٹے چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹا جاتا تھا، آلو ڈیکسٹروز ایگر (PDA) میڈیم پر کلچر کیا جاتا تھا اور 25 ± 2 ° C پر 12 h لائٹ/ 12 h تاریک سائیکل کے ساتھ 5 دن کے لیے انکیوبیٹ کیا جاتا تھا۔ مخلوط یا آلودہ ثقافتوں سے فنگل الگ تھلگ کو پاک کرنے کے لیے بھی mycelial ٹپ کا طریقہ استعمال کیا جاتا تھا۔ پیوریفائیڈ فنگل آئسولیٹ کو پہلے اس کی ثقافتی مورفولوجیکل خصوصیات کی بنیاد پر شناخت کیا گیا اور پھر خوردبینی خصوصیات کی بنیاد پر S. sclerotiorum ہونے کی تصدیق کی گئی۔ آخر میں، تمام پیوریفائیڈ آئسولیٹس کا ٹیسٹ کیا گیا تاکہ کوچ کی پوسٹولیٹس کو پورا کرنے کے لیے حساس عام بین کی کاشت گیزا 3 پر روگزنقیت کی جانچ کی گئی۔
اس کے علاوہ، سب سے زیادہ ناگوار S. sclerotiorum isolate (Isolate #3) کی مزید تصدیق اندرونی نقل شدہ اسپیسر (ITS) کی ترتیب کی بنیاد پر کی گئی جیسا کہ White et al.، 1990 کے ذریعے بیان کیا گیا ہے۔ Baturo-Ciesniewska et al.، 2017. مختصراً، الگ تھلگ آلو کے ڈیکسٹروز شوربے (PDB) میں کلچر کیے گئے تھے اور 5–7 دنوں کے لیے 25 ± 2 °C پر انکیوبیٹ کیے گئے تھے۔ اس کے بعد فنگل مائسیلیم کو اکٹھا کیا گیا، چیزکلوت کے ذریعے فلٹر کیا گیا، جراثیم سے پاک پانی سے دو بار دھویا گیا، اور جراثیم سے پاک فلٹر پیپر سے خشک کیا گیا۔ جینومک ڈی این اے کو Quick-DNA™ فنگل/بیکٹیریل منیپریپ کٹ (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ITS rDNA ریجن کو مخصوص پرائمر جوڑی ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC؛ متوقع سائز: 540 bp) ( Baturo-Ciesniewska et al.، 2017) کا استعمال کرتے ہوئے بڑھا دیا گیا۔ پیوریفائیڈ پی سی آر پروڈکٹس کو ترتیب دینے کے لیے جمع کرایا گیا تھا (بیجنگ آوکے ڈنگشینگ بائیو ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ)۔ سنجر کی ترتیب کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے آئی ٹی ایس آر ڈی این اے کی ترتیب کو دو طرفہ طور پر ترتیب دیا گیا تھا۔ اس کے بعد جمع کردہ سوالات کے سلسلے کا BLASTn سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے GenBank اور نیشنل سینٹر فار بائیو ٹیکنالوجی انفارمیشن (NCBI، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) کے تازہ ترین ڈیٹا سے موازنہ کیا گیا۔ سوال کی ترتیب کا موازنہ 20 دیگر S. sclerotiorum strains/isolates کے ساتھ کیا گیا جو NCBI GenBank (ضمنی جدول S1) کے تازہ ترین ڈیٹا سے حاصل کیے گئے مالیکیولر ایوولیوشنری جینیٹکس انالیسس پیکج (MEGA-11؛ ورژن 11) میں کلسٹال ڈبلیو کا استعمال کرتے ہوئے (Kumaret20)۔ ارتقائی تجزیہ زیادہ سے زیادہ امکان کے طریقہ کار اور عام وقت کے بدلے جانے والے نیوکلیوٹائڈ متبادل ماڈل (نی اور کمار، 2000) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ سب سے زیادہ لاگ ان کا امکان والا درخت دکھایا گیا ہے۔ ہیورسٹک تلاش کے لیے ابتدائی درخت کا انتخاب پڑوسی-جوائننگ (NJ) درخت (Kumar et al., 2024) اور زیادہ سے زیادہ پارسمونی (MP) درخت کے درمیان زیادہ لاگ ان امکان کے ساتھ درخت کا انتخاب کرکے کیا جاتا ہے۔ این جے ٹری کو جوڑے کی طرف فاصلہ میٹرکس کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا تھا جس کا حساب عام ٹائم ریورسیبل ماڈل (نی اور کمار، 2000) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔
L-ornithine اور bactericide "Rizolex-T" کی اینٹی بیکٹیریل سرگرمی کا تعین وٹرو میں ایگر ڈفیوژن طریقہ سے کیا گیا تھا۔ طریقہ: L-ornithine (500 mg/L) کے سٹاک محلول کی مناسب مقدار لیں اور اسے PDA نیوٹرینٹ میڈیم کے 10 ملی لیٹر کے ساتھ اچھی طرح مکس کریں تاکہ بالترتیب 12.5، 25، 50، 75، 100 اور 125 mg/L کی حتمی مقدار کے ساتھ حل تیار کیا جا سکے۔ فنگسائڈ "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 اور 10 mg/L) کے پانچ ارتکاز اور جراثیم سے پاک آست پانی کو بطور کنٹرول استعمال کیا گیا۔ میڈیم کے ٹھوس ہونے کے بعد، Sclerotinia sclerotiorum کلچر کا ایک تازہ تیار کردہ mycelial پلگ، جس کا قطر 4 ملی میٹر تھا، کو پیٹری ڈش کے مرکز میں منتقل کیا گیا اور 25 ± 2 ° C پر اس وقت تک کلچر کیا گیا جب تک کہ مائیسیلیم پوری کنٹرول پیٹری ڈش کو ڈھانپ نہ لے، جس کے بعد فنگل کی افزائش ریکارڈ کی گئی۔ مساوات 1 کا استعمال کرتے ہوئے S. sclerotiorum کی شعاعی نمو کے فیصد کی روک تھام کا حساب لگائیں:
تجربے کو دو بار دہرایا گیا، ہر کنٹرول/تجرباتی گروپ کے لیے چھ حیاتیاتی نقلیں اور ہر حیاتیاتی نقل کے لیے پانچ برتن (دو پودے فی برتن)۔ تجرباتی نتائج کی درستگی، وشوسنییتا اور تولیدی صلاحیت کو یقینی بنانے کے لیے ہر حیاتیاتی نقل کا دو بار تجزیہ کیا گیا (دو تکنیکی نقلیں)۔ اس کے علاوہ، پروبٹ ریگریشن تجزیہ کا استعمال نصف زیادہ سے زیادہ روکنے والے ارتکاز (IC50) اور IC99 (Prentice، 1976) کا حساب لگانے کے لیے کیا گیا تھا۔
گرین ہاؤس حالات میں L-ornithine کی صلاحیت کا جائزہ لینے کے لیے، لگاتار دو برتنوں کے تجربات کیے گئے۔ مختصراً، برتنوں کو جراثیم سے پاک مٹی کی ریت (3:1) سے بھرا گیا اور S. sclerotiorum کی تازہ تیار شدہ ثقافت سے ٹیکہ لگایا گیا۔ سب سے پہلے، S. sclerotiorum (Isolate #3) کے سب سے زیادہ ناگوار الگ تھلگ کو ایک سکلیروٹیم کو آدھے حصے میں کاٹ کر، PDA پر منہ کی طرف رکھ کر اور 25 ° C پر مسلسل اندھیرے (24 h) میں 4 دن تک انکیوبیٹ کر کے مائیسیئل کی نشوونما کو متحرک کیا گیا۔ اس کے بعد 5 ملی میٹر قطر کے چار ایگر پلگ آگے کے کنارے سے لیے گئے اور 100 گرام گندم اور چاول کی چوکر کے جراثیم سے پاک مکسچر (1:1، v/v) کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا اور تمام فلاسکس کو 25 ± 2 ° C پر 12 گھنٹے روشنی/12 گھنٹہ گھنٹہ سے تاریک دن کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔ مٹی ڈالنے سے پہلے یکسانیت کو یقینی بنانے کے لیے تمام فلاسکس کے مواد کو اچھی طرح سے ملایا گیا تھا۔ پھر، پیتھوجینز کی مستقل حراستی کو یقینی بنانے کے لیے ہر برتن میں 100 گرام کالونائزنگ بران مکسچر شامل کیا گیا۔ پھپھوندی کی نشوونما کو چالو کرنے کے لیے ٹیکے لگائے گئے برتنوں کو پانی پلایا گیا اور 7 دن تک گرین ہاؤس کے حالات میں رکھا گیا۔
پھر ہر برتن میں گیزا 3 قسم کے پانچ بیج بوئے گئے۔ L-ornithine اور فنگسائڈ Rizolex-T کے ساتھ علاج کیے جانے والے برتنوں کے لیے، جراثیم سے پاک بیجوں کو پہلے دو گھنٹے کے لیے دو مرکبات کے ایک آبی محلول میں بالترتیب تقریباً 250 mg/L اور 50 mg/L کے حتمی IC99 ارتکاز کے ساتھ بھگو دیا گیا، اور پھر بوائی سے ایک گھنٹہ پہلے ہوا میں خشک کیا گیا۔ دوسری طرف، بیجوں کو ایک منفی کنٹرول کے طور پر جراثیم سے پاک آست پانی میں بھگو دیا گیا تھا۔ 10 دن کے بعد، پہلے پانی سے پہلے، پودوں کو پتلا کر دیا گیا، ہر برتن میں صرف دو صاف پودے رہ گئے۔ مزید برآں، S. sclerotiorum کے انفیکشن کو یقینی بنانے کے لیے، سیم کے پودے کے تنوں کو ایک ہی ترقی کے مرحلے (10 دن) میں دو مختلف جگہوں پر جراثیم سے پاک اسکیلپل کا استعمال کرتے ہوئے کاٹا گیا اور ہر زخم میں تقریباً 0.5 گرام کالونائزنگ بران مکسچر ڈالا گیا، جس کے بعد زیادہ نمی کی وجہ سے تمام انوکول شدہ پودوں میں انفیکشن اور بیماری کی نشوونما کو تیز کیا گیا۔ کنٹرول پلانٹس کو بھی اسی طرح زخمی کیا گیا تھا اور مساوی مقدار میں (0.5 جی) جراثیم سے پاک، غیر کالونی چوکر کا مرکب زخم میں رکھا گیا تھا اور اسے زیادہ نمی کے تحت رکھا گیا تھا تاکہ بیماری کی نشوونما کے لیے ماحول کی تقلید اور علاج کے گروپوں کے درمیان مستقل مزاجی کو یقینی بنایا جا سکے۔
علاج کا طریقہ: سیم کے بیجوں کو 500 ملی لیٹر پانی کے محلول L-ornithine (250 mg/l) یا فنگسائڈ Rizolex-T (50 mg/l) کے ساتھ زمین کو سیراب کیا گیا، پھر 10 دن کے وقفے سے علاج کو تین بار دہرایا گیا۔ پلیسبو سے علاج شدہ کنٹرولز کو 500 ملی لیٹر جراثیم سے پاک آست پانی سے سیراب کیا گیا تھا۔ تمام علاج گرین ہاؤس کے حالات (25 ± 2 ° C، 75 ± 1% رشتہ دار نمی، اور 8 h روشنی/16 h تاریک کا فوٹو پیریڈ) کے تحت کئے گئے تھے۔ تمام برتنوں کو پندرہ ہفتہ میں پانی پلایا جاتا تھا اور مخصوص قسم کی سفارشات اور مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق 3-4 گرام/l کے ارتکاز میں متوازن NPK کھاد (20-20-20، 3.6% سلفر اور TE مائیکرو عناصر کے ساتھ؛ زین سیڈز، مصر) کے ساتھ ماہانہ علاج کیا جاتا تھا۔ جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا گیا ہو، مکمل طور پر پھیلے ہوئے پختہ پتے (اوپر سے دوسرے اور تیسرے پتے) ہر ایک حیاتیاتی نقل سے 72 گھنٹے پوسٹ ٹریٹمنٹ (ایچ پی ٹی) پر اکٹھے کیے گئے، مزید تجزیوں کے لیے یکساں، پولڈ اور -80 °C پر ذخیرہ کیا گیا، بشمول، لیکن ان تک محدود نہیں، ہسٹو کیمیکل لوکلائزیشن انسٹیٹیو ہسٹو کیمیکل، سٹریس کی مقامی سطح پر۔ اور غیر انزیمیٹک اینٹی آکسیڈینٹ اور جین اظہار۔
وائٹ مولڈ انفیکشن کی شدت کا اندازہ ہفتہ وار 21 دن بعد ٹیکہ لگانے (dpi) کے پیمانے پر 1–9 (ضمنی جدول S2) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا جس کی بنیاد پر پیٹزولڈٹ اور ڈکسن اسکیل (1996) ٹیران ایٹ ال نے ترمیم کی تھی۔ (2006)۔ مختصراً، بین کے پودوں کے تنوں اور شاخوں کا معائنہ ٹیکہ لگانے کے وقت سے کیا گیا تاکہ انٹرنوڈس اور نوڈس کے ساتھ گھاووں کے بڑھنے پر عمل کیا جا سکے۔ ٹیکہ لگانے کے مقام سے تنے یا شاخ کے ساتھ سب سے دور تک گھاو کا فاصلہ پھر ماپا گیا اور گھاو کے مقام کی بنیاد پر 1–9 کا سکور تفویض کیا گیا، جہاں (1) ٹیکہ لگانے کے مقام کے قریب کوئی دکھائی دینے والا انفیکشن نہیں ہوا اور (2–9) نے اشارہ کیا کہ گھاووں کے سائز میں بتدریج اضافہ اور نوڈس/انٹرن ایبل Supplementary 2 کے ساتھ بڑھنا۔ وائٹ مولڈ انفیکشن کی شدت کو پھر فارمولہ 2 کا استعمال کرتے ہوئے فیصد میں تبدیل کیا گیا:
اس کے علاوہ، بیماری کے بڑھنے کے منحنی خطوط (AUDPC) کے تحت رقبہ کا حساب فارمولہ (شینر اینڈ فنی، 1977) کے ذریعے کیا گیا، جسے حال ہی میں مساوات 3 کا استعمال کرتے ہوئے عام بین (چوہان ایٹ ال، 2020) کے سفید سڑ کے لیے ڈھال لیا گیا تھا:
جہاں Yi = بیماری کی شدت ti کے وقت، Yi+1 = بیماری کی شدت اگلی وقت ti+1، ti = پہلی پیمائش کا وقت (دنوں میں)، ti+1 = اگلی پیمائش کا وقت (دنوں میں)، n = ٹائم پوائنٹس یا مشاہداتی پوائنٹس کی کل تعداد۔ پھلیوں کے پودے کی نشوونما کے پیرامیٹرز بشمول پودے کی اونچائی (سینٹی میٹر)، فی پودے کی شاخوں کی تعداد، اور فی پودے کے پتوں کی تعداد تمام حیاتیاتی نقلوں میں ہفتہ وار 21 دنوں کے لیے ریکارڈ کی گئی۔
ہر ایک حیاتیاتی نقل میں، پتوں کے نمونے (اوپر سے دوسرے اور تیسرے مکمل طور پر تیار شدہ پتے) علاج کے بعد 45 دن (آخری علاج کے 15 دن بعد) جمع کیے گئے تھے۔ ہر حیاتیاتی نقل پانچ برتنوں پر مشتمل ہوتی ہے (ہر برتن میں دو پودے)۔ تقریباً 500 ملی گرام پسے ہوئے ٹشو کو اندھیرے میں 4 °C پر 80% ایسیٹون کا استعمال کرتے ہوئے فوٹو سنتھیٹک پگمنٹس (کلوروفیل اے، کلوروفیل بی اور کیروٹینائڈز) نکالنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ 24 گھنٹے کے بعد، نمونوں کو سینٹرفیوج کیا گیا اور کلوروفیل اے، کلوروفل بی اور کیروٹینائڈ مواد کے تعین کے لیے سپرناٹینٹ کو ایک UV-160A اسپیکٹرو فوٹومیٹر (شیماڈزو کارپوریشن، جاپان) کے طریقہ کار کے مطابق (Lichtenthaler، 1987th پر مختلف لہروں کے ذریعے) کا استعمال کرتے ہوئے جمع کیا گیا۔ (A470, A646 اور A663 nm)۔ آخر میں، فوتوسنتھیٹک روغن کے مواد کا حساب درج ذیل فارمولوں 4-6 کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا جسے Lichtenthaler (1987) نے بیان کیا ہے۔
72 گھنٹے پوسٹ ٹریٹمنٹ (ایچ پی ٹی) پر، ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (H2O2) اور سپر آکسائیڈ اینون (O2•−) کے سیٹو ہسٹو کیمیکل لوکلائزیشن کے لیے ہر ایک حیاتیاتی نقل سے پتے (اوپر سے دوسرے اور تیسرے مکمل طور پر تیار شدہ پتے) اکٹھے کیے گئے۔ ہر حیاتیاتی نقل پانچ برتنوں پر مشتمل ہوتی ہے (ہر برتن میں دو پودے)۔ طریقہ کار کی درستگی، وشوسنییتا اور تولیدی صلاحیت کو یقینی بنانے کے لیے ہر حیاتیاتی نقل کا نقل (دو تکنیکی نقل) میں تجزیہ کیا گیا۔ H2O2 اور O2•− کا تعین بالترتیب 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) یا nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ (2004) اور آدم وغیرہ۔ (1989) معمولی ترمیم کے ساتھ۔ H2O2 کی ہسٹو کیمیکل لوکلائزیشن کے لیے، 10 ایم ایم ٹریس بفر (pH 7.8) میں 0.1% DAB کے ساتھ لیفلیٹس کو خلا میں گھسایا گیا اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر روشنی میں 60 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ لیفلیٹس کو 0.15% (v/v) TCA میں 4:1 (v/v) ایتھنول میں بلیچ کیا گیا: کلوروفارم (الگوموریہ فارماسیوٹیکلز اینڈ میڈیکل سپلائیز، قاہرہ، مصر) اور پھر اندھیرے ہونے تک روشنی کے سامنے رکھا گیا۔ اسی طرح، والوز کو 10 mM پوٹاشیم فاسفیٹ بفر (pH 7.8) کے ساتھ خلا میں گھسایا گیا جس میں O2•− کی ہسٹو کیمیکل لوکلائزیشن کے لیے 0.1 w/v % HBT موجود تھا۔ کتابچے کو کمرے کے درجہ حرارت پر روشنی میں 20 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا، پھر اوپر کی طرح بلیچ کیا گیا، اور پھر اس وقت تک روشن کیا گیا جب تک کہ گہرے نیلے / بنفشی دھبے ظاہر نہ ہوں۔ نتیجے میں براؤن (H2O2 اشارے کے طور پر) یا نیلے بنفشی (O2•− اشارے کے طور پر) رنگ کی شدت کا اندازہ امیج پروسیسنگ پیکج ImageJ (http://fiji.sc؛ 7 مارچ 2024 تک رسائی) کے فجی ورژن کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔
Malondialdehyde (MDA؛ لپڈ پیرو آکسیڈیشن کے مارکر کے طور پر) کا تعین Du and Bramlage (1992) کے طریقہ کار کے مطابق معمولی ترمیم کے ساتھ کیا گیا تھا۔ ہر حیاتیاتی نقل سے پتے (اوپر سے دوسرے اور تیسرے مکمل طور پر تیار شدہ پتے) 72 گھنٹے بعد علاج (hpt) جمع کیے گئے۔ ہر حیاتیاتی نقل میں پانچ برتن (ہر برتن میں دو پودے) شامل تھے۔ طریقہ کار کی درستگی، وشوسنییتا اور تولیدی صلاحیت کو یقینی بنانے کے لیے ہر حیاتیاتی نقل کا نقل (دو تکنیکی نقل) میں تجزیہ کیا گیا۔ مختصراً، 0.5 گرام زمینی پتوں کے ٹشو کو MDA نکالنے کے لیے 20% trichloroacetic acid (TCA; MilliporSigma, Burlington, MA, USA) کے ساتھ استعمال کیا گیا جس میں 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT؛ سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، MO، USA) شامل ہیں۔ اس کے بعد سپرنٹنٹ میں ایم ڈی اے کے مواد کا تعین UV-160A سپیکٹرو فوٹومیٹر (Shimadzu Corporation، Japan) کا استعمال کرتے ہوئے 532 اور 600 nm پر جاذبیت کی پیمائش کرکے اور پھر nmol g−1 FW کے طور پر اظہار کیا گیا۔
غیر انزیمیٹک اور انزیمیٹک اینٹی آکسیڈنٹس کی تشخیص کے لیے، ہر ایک حیاتیاتی نقل سے پتے (اوپر سے دوسرے اور تیسرے مکمل طور پر تیار شدہ پتے) 72 گھنٹے بعد علاج (hpt) پر اکٹھے کیے گئے۔ ہر حیاتیاتی نقل پانچ برتنوں پر مشتمل ہوتی ہے (ہر برتن میں دو پودے)۔ ہر حیاتیاتی نمونے کا نقل (دو تکنیکی نمونے) میں تجزیہ کیا گیا تھا۔ دو پتے مائع نائٹروجن کے ساتھ گرے ہوئے تھے اور انزائیمیٹک اور غیر انزیمیٹک اینٹی آکسیڈنٹس، کل امینو ایسڈز، پرولین مواد، جین اظہار، اور آکسالیٹ کی مقدار کے تعین کے لیے براہ راست استعمال کیے گئے تھے۔
Kahkonen et al کی طرف سے بیان کردہ طریقہ کار میں معمولی ترمیم کے ساتھ Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) کا استعمال کرتے ہوئے کل حل پذیر فینولکس کا تعین کیا گیا تھا۔ (1999)۔ مختصراً، تقریباً 0.1 جی ہوموجینائزڈ لیف ٹشو کو 20 ملی لیٹر 80% میتھانول کے ساتھ 24 گھنٹے تک اندھیرے میں نکالا گیا اور سنٹرفیوگریشن کے بعد سپرناٹینٹ کو جمع کیا گیا۔ نمونے کے نچوڑ کے 0.1 ملی لیٹر کو 0.5 ملی لیٹر Folin-Ciocalteu reagent (10%) کے ساتھ ملایا گیا، 30 سیکنڈ تک ہلایا گیا اور 5 منٹ تک اندھیرے میں چھوڑ دیا گیا۔ پھر ہر ٹیوب میں 0.5 ملی لیٹر 20% سوڈیم کاربونیٹ محلول (Na2CO3؛ Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egypt) شامل کیا گیا، اچھی طرح ملایا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر اندھیرے میں 1 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ انکیوبیشن کے بعد، رد عمل کے مرکب کی جاذبیت کو UV-160A سپیکٹرو فوٹومیٹر (شمادزو کارپوریشن، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے 765 nm پر ماپا گیا۔ نمونے کے نچوڑوں میں کل گھلنشیل فینول کے ارتکاز کا تعین گیلک ایسڈ کیلیبریشن کریو (فشر سائنٹیفک، ہیمپٹن، NH، USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور اس کا اظہار فی گرام تازہ وزن (mg GAE g-1 تازہ وزن) کے برابر گیلک ایسڈ کے ملی گرام کے طور پر کیا گیا تھا۔
کل گھلنشیل فلیوونائڈ مواد کا تعین Djeridane et al کے طریقہ کار کے مطابق کیا گیا تھا۔ (2006) معمولی ترمیم کے ساتھ۔ مختصراً، مندرجہ بالا میتھانول کے نچوڑ کے 0.3 ملی لیٹر کو 0.3 ملی لیٹر 5% ایلومینیم کلورائد محلول (AlCl3؛ فشر سائنٹیفک، ہیمپٹن، NH، USA) کے ساتھ ملایا گیا اور پھر اسے کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ تک سینک دیا گیا، اس کے بعد 0.3 ملی لیٹر 0.3 ملی لیٹر assium asset %10et کا اضافہ کیا گیا۔ (الگوموریہ فارماسیوٹیکلز اینڈ میڈیکل سپلائیز، قاہرہ، مصر)، اچھی طرح مکس کر کے کمرے کے درجہ حرارت پر اندھیرے میں 30 منٹ تک سینک دیا جاتا ہے۔ انکیوبیشن کے بعد، رد عمل کے مرکب کی جاذبیت کو UV-160A سپیکٹرو فوٹومیٹر (شمادزو کارپوریشن، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے 430 nm پر ماپا گیا۔ نمونے کے نچوڑوں میں کل گھلنشیل فلیوونائڈز کا ارتکاز روٹین کیلیبریشن کریو (TCI America, Portland, OR, USA) کا استعمال کرتے ہوئے طے کیا گیا تھا اور پھر اس کا اظہار فی گرام تازہ وزن (mg RE g-1 تازہ وزن) کے برابر روٹین کے ملی گرام کے طور پر کیا گیا تھا۔
پھلیوں کے پتوں میں کل مفت امینو ایسڈ مواد کا تعین ایک ترمیم شدہ نین ہائیڈرن ریجنٹ (تھرمو سائنٹیفک کیمیکلز، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) کے طریقہ کار کی بنیاد پر کیا گیا تھا جو یوکویاما اور ہیراماتسو (2003) کے تجویز کردہ اور سن ایٹ ال کے ذریعہ تبدیل کیا گیا تھا۔ (2006)۔ مختصراً، 0.1 جی زمینی بافتوں کو پی ایچ 5.4 بفر کے ساتھ نکالا گیا، اور 200 μL سپرناٹینٹ کو 200 μL ninhydrin (2%) اور 200 μL پائریڈائن (10%؛ سپیکٹرم کیمیکل، نیو برنسوِک، یو ایس اے میں پانی کے لیے 200 μL) کے ساتھ رد عمل ظاہر کیا گیا۔ 30 منٹ، پھر ٹھنڈا کیا گیا اور UV-160A سپیکٹرو فوٹومیٹر (Shimadzu Corporation، Japan) کا استعمال کرتے ہوئے 580 nm پر ماپا گیا۔ دوسری طرف، پرولین کا تعین بیٹس کے طریقہ کار سے کیا گیا تھا (بیٹس ایٹ ال۔، 1973)۔ پرولین کو 3% سلفوسالیسیلک ایسڈ (تھرمو سائنٹیفک کیمیکلز، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) کے ساتھ نکالا گیا اور سینٹرفیوگریشن کے بعد، 0.5 ملی لیٹر سپرنٹنٹ کو 1 ملی لیٹر گلیشیل ایسٹک ایسڈ (فشر سائنٹیفک، ہیمپٹن، این ایچ، یو ایس اے) کے ساتھ ملایا گیا اور 490 ° C کے لیے ninincubin ° C. min، ٹھنڈا اور 520 nm پر اسی سپیکٹرو فوٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے ماپا جیسا کہ اوپر ہے۔ پتی کے نچوڑ میں کل مفت امینو ایسڈ اور پرولین کا تعین بالترتیب گلائسین اور پرولین کیلیبریشن کروز (سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، ایم او، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، اور اس کا اظہار mg/g تازہ وزن کے طور پر کیا گیا تھا۔
اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کی انزیمیٹک سرگرمی کا تعین کرنے کے لیے، تقریباً 500 ملی گرام ہوموجنائزڈ ٹشو کو 3 ملی لیٹر 50 ایم ایم ٹریس بفر (پی ایچ 7.8) کے ساتھ نکالا گیا جس میں 1 ایم ایم EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich، St. Louis, MO, USA.55%) اور پولی وِن (PH 7.8) شامل تھے۔ Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) کو 20 منٹ کے لیے ریفریجریشن (4 ° C) کے لیے 10,000 × g پر سینٹری فیوج کیا گیا، اور سپرنٹنٹ (خام انزائم ایکسٹریکٹ) کو جمع کیا گیا (El-Nagar et al.، 2023؛ Osman et al. 0223)۔ Catalase (CAT) کو پھر 0.1 M سوڈیم فاسفیٹ بفر (pH 6.5؛ Sigma-Aldrich، St. Louis, MO, USA) کے 2 ملی لیٹر اور 100 μl 269 mM H2O2 محلول کے ساتھ رد عمل کا اظہار کیا گیا تاکہ اس کی انزیمیٹک سرگرمی کا تعین کیا جا سکے۔ (النگر وغیرہ، 2023؛ عثمان وغیرہ، 2023)۔ Guaiacol-dependent peroxidase (POX) انزیمیٹک سرگرمی کا تعین Harrach et al کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ (2009)۔ (2008) معمولی ترمیم کے ساتھ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) اور polyphenol oxidase (PPO) کی انزیمیٹک سرگرمی کا تعین 100 mM سوڈیم فاسفیٹ بفر کے 2.2 ملی لیٹر کے ساتھ رد عمل کے بعد کیا گیا تھا۔ (TCI کیمیکلز، پورٹلینڈ، OR، USA) اور 12 mM H2O2 کا 100 μl۔ طریقہ کار میں قدرے ترمیم کی گئی تھی (ال نگر ایٹ ال۔، 2023؛ عثمان ایٹ ال۔، 2023)۔ پرکھ 3 ملی لیٹر کیٹیکول محلول (تھرمو سائنٹیفک کیمیکلز، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) (0.01 ایم) کے ساتھ رد عمل کے بعد انجام دی گئی جو 0.1 ایم فاسفیٹ بفر (پی ایچ 6.0) میں تازہ تیار کی گئی تھی۔ CAT سرگرمی کی پیمائش H2O2 کے گلنے کی 240 nm (A240) پر نگرانی کر کے کی گئی، POX کی سرگرمی 436 nm (A436) پر جاذبیت میں اضافے کی نگرانی کر کے ناپی گئی، اور PPO سرگرمی کی پیمائش 495 nm (A435) کے لیے ہر ایک منٹ میں جذب کے اتار چڑھاو کو ریکارڈ کر کے کی گئی۔ UV-160A سپیکٹرو فوٹومیٹر (شمادزو، جاپان)۔
ریئل ٹائم RT-PCR کا استعمال تین اینٹی آکسیڈینٹ سے متعلق جینز کی ٹرانسکرپٹ لیولز کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا، بشمول پیروکسیسومل کیٹالیس (PvCAT1؛ GenBank Accession No. KF033307.1)، سپر آکسائیڈ ڈسمیوٹیز (PvSOD؛ GenBank Accession No. XM_0568)، اور genBank Accession No. XM_0568. (PvGR؛ GenBank Accession No. KY195009.1)، سیم کے پتوں میں (اوپر سے دوسرے اور تیسرے مکمل طور پر تیار شدہ پتے) آخری علاج کے 72 گھنٹے بعد۔ مختصراً، RNA کو مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق Simply P ٹوٹل RNA ایکسٹریکشن کٹ (Cat. No. BSC52S1؛ BioFlux، Biori Technology، China) کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ پھر، سی ڈی این اے کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق TOP اسکرپٹ™ cDNA سنتھیسس کٹ کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیا گیا۔ مندرجہ بالا تینوں جینوں کے پرائمر سلسلے کو ضمنی جدول S3 میں درج کیا گیا ہے۔ PvActin-3 (GenBank الحاق نمبر: XM_068616709.1) کو ہاؤس کیپنگ جین کے طور پر استعمال کیا گیا تھا اور 2-ΔΔCT طریقہ (Livak and Schmittgen, 2001) کا استعمال کرتے ہوئے متعلقہ جین اظہار کا حساب لگایا گیا تھا۔ حیاتیاتی تناؤ کے تحت ایکٹین استحکام (عام پھلیوں اور اینتھراکنوز فنگس کولیٹوٹریچم لنڈیموتھینم کے درمیان غیر مطابقت پذیر تعامل) اور ابیوٹک تناؤ (خشک سالی، نمکیات، کم درجہ حرارت) کا مظاہرہ کیا گیا تھا (بورجس ایٹ ال۔، 2012)۔
ہم نے ابتدائی طور پر پروٹین-پروٹین BLAST ٹول (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) کا استعمال کرتے ہوئے S. sclerotiorum میں oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) پروٹینز کے سلیکو تجزیہ میں جینوم وسیع انجام دیا۔ مختصراً، ہم نے Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH؛ ٹیکسائڈ: 1191702؛ GenBank کے الحاق نمبر XP_040799428.1؛ 342 امینو ایسڈز) اور Penicillium lagena (PlOAH؛ ٹیکسائڈ: 94Bank؛ GenBank) سے OAH استعمال کیا۔ XP_056833920.1; 316 امینو ایسڈ) S. sclerotiorum (taxide: 5180) میں ہومولوگس پروٹین کا نقشہ بنانے کے لیے سوال کی ترتیب کے طور پر۔ BLASTp نیشنل سینٹر فار بائیو ٹیکنالوجی انفارمیشن (NCBI) کی ویب سائٹ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ پر GenBank میں حال ہی میں دستیاب S. sclerotiorum جینوم ڈیٹا کے خلاف انجام دیا گیا تھا۔
اس کے علاوہ، S. sclerotiorum (SsOAH) سے پیش گوئی شدہ OAH جین اور A. fijiensis CBS 313.89 سے AfOAH کے A. fijiensis CBS 313.89 اور P. lagena سے PlOAH کے پیشن گوئی شدہ OAH جین کو MEGA11 (Tamurabased-20) میں زیادہ سے زیادہ امکان کا طریقہ استعمال کرتے ہوئے اندازہ لگایا گیا تھا۔ ماڈل (Jones et al.، 1992)۔ فائیلوجنیٹک درخت کو S. sclerotiorum سے تمام پیش گوئی شدہ OAH جینز (SsOAH) کے پروٹین کی ترتیب کے ایک سے زیادہ سیدھ کے تجزیے اور Constraint-based alignment Tool (COBALT؛ https://www.ncbi.nlm.nih/t.co.balt (پاپاڈوپولوس اور اگروالا، 2007)۔ اس کے علاوہ، S. sclerotiorum سے SsOAH کے بہترین مماثل امینو ایسڈ کی ترتیب کو استفسار کے سلسلے (AfOAH اور PlOAH) (Larkin et al.، 2007) کے ساتھ ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) کا استعمال کرتے ہوئے منسلک کیا گیا تھا، اور ای ایس پی کے استعمال سے ای ایس پی کو ترتیب دیا گیا تھا۔ ٹول (ورژن 3.0؛ https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)۔
مزید برآں، S. sclerotiorum SsOAH کی پیش گوئی شدہ فنکشنل نمائندہ ڈومینز اور محفوظ کردہ سائٹس کو انٹر پرو ٹول (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al. آخر میں، پیش گوئی شدہ S. sclerotiorum SsOAH کی سہ جہتی (3D) ساخت کی ماڈلنگ پروٹین ہومولوجی/اینالوجی ریکگنیشن انجن (Phyre2 سرور ورژن 2.0؛ http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.index) (id.k.5.5) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ اور SWISS-MODEL سرور (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) کا استعمال کرتے ہوئے تصدیق شدہ۔ پیش گوئی شدہ سہ جہتی ڈھانچے (PDB فارمیٹ) کو UCSF-Chimera پیکیج (ورژن 1.15؛ https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al.، 2004) کا استعمال کرتے ہوئے انٹرایکٹو انداز میں تصور کیا گیا تھا۔
مقداری ریئل ٹائم فلوروسینس PCR کا استعمال Sclerotinia sclerotiorum کے مائسیلیا میں oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH؛ GenBank الحاق نمبر: XM_001590428.1) کی نقل کی سطح کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ مختصراً، S. sclerotiorum کو PDB پر مشتمل ایک فلاسک میں ٹیکہ لگایا گیا تھا اور اسے ہلاتے ہوئے انکیوبیٹر میں رکھا گیا تھا (ماڈل: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 25 ± 2 °C پر 24 گھنٹے کے لیے 150 rpm پر اور مستقل اندھیرے میں (مسلسل اندھیرے میں) اس کے بعد، خلیوں کا علاج L-ornithine اور فنگسائڈ Rizolex-T سے حتمی IC50 ارتکاز (تقریباً 40 اور 3.2 mg/L، بالترتیب) پر کیا گیا اور پھر انہی حالات میں مزید 24 گھنٹے کے لیے کلچر کیا گیا۔ انکیوبیشن کے بعد، ثقافتوں کو 5 منٹ کے لیے 2500 rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا اور جین کے اظہار کے تجزیہ کے لیے سپرنٹنٹ (فنگل مائسیلیم) کو جمع کیا گیا۔ اسی طرح، فنگل مائیسیلیم کو 0، 24، 48، 72، 96، اور 120 گھنٹہ بعد انفیکشن زدہ پودوں سے جمع کیا گیا جس نے متاثرہ ٹشوز کی سطح پر سفید سڑنا اور کاٹنی مائیسیلیم بنایا تھا۔ آر این اے کو فنگل مائیسیلیم سے نکالا گیا تھا اور پھر سی ڈی این اے کو ترکیب کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ SsOAH کے لیے پرائمر ترتیب ضمنی جدول S3 میں درج ہیں۔ SsActin (GenBank الحاق نمبر: XM_001589919.1) کو ہاؤس کیپنگ جین کے طور پر استعمال کیا گیا تھا، اور 2-ΔΔCT طریقہ (Livak and Schmittgen، 2001) کا استعمال کرتے ہوئے متعلقہ جین اظہار کا حساب لگایا گیا تھا۔
آکسالک ایسڈ کا تعین آلو کے ڈیکسٹروز شوربے (PDB) اور پودوں کے نمونوں میں کیا گیا تھا جس میں فنگل پیتھوجین Sclerotinia sclerotiorum شامل تھے سو اور ژانگ (2000) کے طریقہ کار کے مطابق معمولی ترمیم کے ساتھ۔ مختصراً، S. sclerotiorum isolates کو PDB پر مشتمل فلاسکس میں ٹیکہ لگایا گیا اور پھر ہلاتے ہوئے انکیوبیٹر (ماڈل I2400، نیو برنسوک سائنٹیفک کمپنی، ایڈیسن، NJ، USA) میں 150 rpm پر 25 ± 2 °C پر 3–5 دن تک اندھیرے میں 3 سے 5 دن تک اندھیرے میں اضافہ کیا گیا۔ انکیوبیشن کے بعد، فنگس کلچر کو پہلے واٹ مین #1 فلٹر پیپر کے ذریعے فلٹر کیا گیا اور پھر 2500 rpm پر 5 منٹ کے لیے بقیہ مائیسیلیم کو ہٹانے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ آکسیلیٹ کے مزید مقداری تعین کے لیے سپرنٹنٹ کو 4 ° C پر جمع اور ذخیرہ کیا گیا تھا۔ پودوں کے نمونوں کی تیاری کے لیے، تقریباً 0.1 جی پودوں کے ٹشو کے ٹکڑوں کو آست پانی (ہر بار 2 ملی لیٹر) کے ساتھ تین بار نکالا گیا۔ اس کے بعد نمونوں کو 5 منٹ کے لیے 2500 rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا، سپرنٹنٹ کو واٹ مین نمبر 1 فلٹر پیپر کے ذریعے خشک فلٹر کیا گیا اور مزید تجزیہ کے لیے جمع کیا گیا۔
آکسالک ایسڈ کے مقداری تجزیہ کے لیے، رد عمل کا مرکب شیشے کی سٹاپڈ ٹیوب میں درج ذیل ترتیب میں تیار کیا گیا تھا: نمونہ کا 0.2 ملی لیٹر (یا پی ڈی بی کلچر فلٹریٹ یا آکسالک ایسڈ معیاری محلول)، 0.11 ملی لیٹر بروموفینول بلیو (بی پی بی، 1 ایم ایم؛ فشر کیمیکل، یو ایس اے 9 پی اے 9 پی اے، 19 ملی لیٹر)۔ M سلفیورک ایسڈ (H2SO4؛ Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) اور 0.176 ملی لیٹر 100 mM پوٹاشیم ڈائکرومیٹ (K2Cr2O7؛ TCI کیمیکلز، پورٹ لینڈ، یا، USA) اور پھر اس محلول کو فوری طور پر 4.8 ملی لیٹر پانی میں گھول کر پانی میں ڈال دیا گیا۔ 60 ° C پانی کا غسل۔ 10 منٹ کے بعد، رد عمل کو 0.5 ملی لیٹر سوڈیم ہائیڈرو آکسائیڈ محلول (NaOH؛ 0.75 M) شامل کرکے روک دیا گیا۔ رد عمل کے مرکب کی جاذبیت (A600) کو UV-160 سپیکٹرو فوٹومیٹر (Shimadzu Corporation، Japan) کا استعمال کرتے ہوئے 600 nm پر ماپا گیا۔ PDB اور آست پانی کو بالترتیب کلچر فلٹریٹس اور پودوں کے نمونوں کی مقدار کے لیے بطور کنٹرول استعمال کیا جاتا تھا۔ کلچر فلٹریٹس میں آکسالک ایسڈ کی ارتکاز، جس کا اظہار آکسالک ایسڈ فی ملی لیٹر PDB میڈیم (μg.mL−1) کے طور پر کیا جاتا ہے، اور پتیوں کے نچوڑ میں، آکسالک ایسڈ کے مائیکروگرامس فی گرام تازہ وزن (μg.g−1 FW) کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے، کا تعین ایک آکسالک ایسڈ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ والتھم، ایم اے، امریکہ)۔
پورے مطالعے کے دوران، تمام تجربات کو مکمل طور پر بے ترتیب ڈیزائن (CRD) میں ڈیزائن کیا گیا تھا جس میں فی علاج چھ حیاتیاتی نقلیں اور پانچ برتن فی حیاتیاتی نقل (دو پودے فی برتن) تھے جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا جائے۔ حیاتیاتی نقلوں کا نقل میں تجزیہ کیا گیا (دو تکنیکی نقلیں)۔ تکنیکی نقلیں اسی تجربے کی تولیدی صلاحیت کو جانچنے کے لیے استعمال کی گئیں لیکن جعلی نقلوں سے بچنے کے لیے شماریاتی تجزیے میں استعمال نہیں کی گئیں۔ اعداد و شمار کا تغیرات (ANOVA) کے تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے اعداد و شمار کا تجزیہ کیا گیا جس کے بعد Tukey-Kramer ایمانداری سے اہم فرق (HSD) ٹیسٹ (p ≤ 0.05)۔ ان وٹرو تجربات کے لیے، IC50 اور IC99 اقدار کا حساب پروبٹ ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا اور 95% اعتماد کے وقفوں کا حساب لگایا گیا۔
مصر کے الغابیہ گورنری میں سویابین کے مختلف کھیتوں سے کل چار الگ تھلگ جمع کیے گئے۔ PDA میڈیم پر، تمام الگ تھلگ کریمی سفید مائیسیلیم تیار کرتے ہیں جو جلد ہی کاٹنی سفید (شکل 1A) اور پھر سکلیروٹیم مرحلے پر خاکستری یا بھورے ہو جاتے ہیں۔ سکلیروٹیا عام طور پر گھنے، سیاہ، کروی یا بے ترتیب شکل کے ہوتے ہیں، 5.2 سے 7.7 ملی میٹر لمبا اور 3.4 سے 5.3 ملی میٹر قطر (شکل 1B)۔ اگرچہ چار الگ تھلگوں نے 25 ± 2 ° C (تصویر 1A) پر انکیوبیشن کے 10-12 دن کے بعد کلچر میڈیم کے کنارے پر سکلیروٹیا کا ایک معمولی نمونہ تیار کیا، لیکن فی پلیٹ سکلیروٹیا کی تعداد ان میں نمایاں طور پر مختلف تھی (P <0.001)، الگ تھلگ 3 کے ساتھ سب سے زیادہ سکلیروٹیا کی تعداد 3.3 ±32 ہے سکلیروٹیا فی پلیٹ؛ تصویر 1 سی)۔ اسی طرح، الگ تھلگ #3 نے PDB میں دیگر الگ تھلگوں کے مقابلے زیادہ آکسالک ایسڈ پیدا کیا (3.33 ± 0.49 μg.mL−1؛ تصویر 1D)۔ الگ تھلگ #3 نے phytopathogenic فنگس Sclerotinia sclerotiorum کی مخصوص مورفولوجیکل اور مائکروسکوپک خصوصیات کو ظاہر کیا۔ مثال کے طور پر، PDA پر، الگ تھلگ نمبر 3 کی کالونیوں میں تیزی سے اضافہ ہوا، وہ کریمی سفید (شکل 1A)، معکوس خاکستری یا ہلکا سالمن پیلا بھورا تھا، اور 9 سینٹی میٹر قطر کی پلیٹ کی سطح کو مکمل طور پر ڈھانپنے کے لیے 25 ± 2 ° C پر 6-7 دن درکار تھے۔ مندرجہ بالا مورفولوجیکل اور خوردبین خصوصیات کی بنیاد پر، الگ تھلگ #3 کی شناخت Sclerotinia sclerotiorum کے طور پر کی گئی۔
شکل 1. S. sclerotiorum کی خصوصیات اور روگجنک عام پھلوں کی فصلوں سے الگ تھلگ۔ (A) PDA میڈیم پر چار S. sclerotiorum isolates کی Mycelial Growth، (B) چار S. sclerotiorum isolates کے sclerotia، (C) سکلیروٹیا کی تعداد (فی پلیٹ)، (D) PDB میڈیم (μg.mL−1) پر آکسالک ایسڈ کا اخراج، اور (E) بیماری کی شدت میں چار S. گرین ہاؤس حالات میں پھلی کی کاشت گیزا 3۔ اقدار پانچ حیاتیاتی نقلوں (n = 5) کے اوسط ± SD کی نمائندگی کرتی ہیں۔ مختلف حروف علاج کے درمیان شماریاتی لحاظ سے اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (p <0.05)۔ (F–H) عام سفید سڑنا کی علامات بالترتیب اوپر کے تنوں اور سلیکوں پر ظاہر ہوئیں، 10 دن بعد ٹیکہ لگانے کے بعد الگ تھلگ #3 (dpi)۔ (I) S. sclerotiorum isolate #3 کے اندرونی ٹرانسکرائبڈ اسپیسر (ITS) کے علاقے کا ارتقائی تجزیہ زیادہ سے زیادہ امکان کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور نیشنل سینٹر فار بائیوٹیکنالوجی انفارمیشن (NCBI) ڈیٹا بیس (https://www.ncbi.nlm/nih.nih) سے حاصل کردہ 20 حوالہ الگ تھلگ/اسٹرینز کے ساتھ موازنہ کیا گیا تھا۔ کلسٹرنگ لائنوں کے اوپر کی تعداد خطے کی کوریج (%) کی نشاندہی کرتی ہے، اور کلسٹرنگ لائنوں کے نیچے کی تعداد شاخ کی لمبائی کی نشاندہی کرتی ہے۔
مزید برآں، روگجنکیت کی تصدیق کرنے کے لیے، چار حاصل کردہ S. sclerotiorum isolates استعمال کیے گئے جو گرین ہاؤس کے حالات میں حساس تجارتی بین کاشتکار گیزا 3 کو ٹیکہ لگانے کے لیے استعمال کیے گئے، جو کہ کوچ کی پوسٹولیٹس (تصویر 1E) کے مطابق ہے۔ اگرچہ حاصل کردہ تمام فنگل الگ تھلگ پیتھوجینک تھے اور سبز پھلیاں (cv. Giza 3) کو متاثر کر سکتے ہیں، جس کی وجہ سے زمین کے اوپر کے تمام حصوں (تصویر 1F) پر سفید سڑنا کی مخصوص علامات پیدا ہوتی ہیں، خاص طور پر تنوں (تصویر 1G) اور پھلیوں پر (تصویر 1H) 10 دن کے بعد ٹیکہ لگانے کے بعد (ڈی پی آئی) میں زیادہ تر انحصار ہوتا ہے۔ تجربات الگ تھلگ 3 میں سیم کے پودوں پر سب سے زیادہ بیماری کی شدت (%) تھی (24.0 ± 4.0، 58.0 ± 2.0، اور 76.7 ± 3.1 میں بالترتیب 7، 14، اور 21 دن بعد انفیکشن؛ شکل 1F)۔
سب سے زیادہ ناگوار S. sclerotiorum isolate #3 کی شناخت کی مزید تصدیق اندرونی نقل کردہ اسپیسر (ITS) کی ترتیب (تصویر 1I) کی بنیاد پر کی گئی۔ الگ تھلگ #3 اور 20 حوالہ جات / تناؤ کے درمیان فائیلوجنیٹک تجزیہ نے ان کے درمیان اعلی مماثلت (>99٪) ظاہر کی۔ یہ بات قابل غور ہے کہ S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) خشک مٹر کے بیجوں سے الگ تھلگ امریکی S. sclerotiorum issolate LPM36 سے بہت زیادہ مماثلت رکھتا ہے (GenBank الحاق نمبر MK896659.1؛ 540 bp) اور چینی S. sclerotiorum isolate (Yyklerotiorum Isolate LPM36) OR206374.1؛ 548 bp)، جو بنفشی (میتھیولا انکانا) تنے کے سڑنے کا سبب بنتا ہے، یہ سب ڈینڈروگرام کے اوپری حصے میں الگ الگ گروپ کیے گئے ہیں (شکل 1I)۔ نئی ترتیب کو NCBI ڈیٹا بیس میں جمع کر دیا گیا ہے اور اسے "Sclerotinia sclerotiorum – issolate YN-25" (GenBank الحاق نمبر PV202792) کا نام دیا گیا ہے۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ الگ تھلگ 3 سب سے زیادہ ناگوار تنہائی ہے۔ لہذا، اس الگ تھلگ کو بعد کے تمام تجربات میں مطالعہ کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔
مختلف ارتکاز (12.5, 25, 50, 75, 100 اور 125 mg/L) میں S. sclerotiorum issolate 3 کے خلاف diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) کی اینٹی بیکٹیریل سرگرمی کی تحقیقات وٹرو میں کی گئیں۔ یہ قابل ذکر ہے کہ L-ornithine نے ایک اینٹی بیکٹیریل اثر ڈالا اور S. sclerotiorum hyphae کے شعاعی نمو کو خوراک پر منحصر انداز میں روک دیا (شکل 2A, B)۔ جانچ کی گئی سب سے زیادہ ارتکاز (125 mg/L) پر، L-ornithine نے سب سے زیادہ مائسییل نمو کی روک تھام کی شرح (99.62 ± 0.27%؛ Figure 2B) ظاہر کی، جو تجارتی فنگسائڈ Rizolex-T (روکنے کی شرح 99.45 ± 0.39 سینٹی میٹر) کے برابر تھی۔ mg/L)، اسی طرح کی افادیت کی نشاندہی کرتا ہے۔
شکل 2. Sclerotinia sclerotiorum کے خلاف L-ornithine کی وٹرو اینٹی بیکٹیریل سرگرمی۔ (A) S. sclerotiorum کے خلاف L-ornithine کی مختلف ارتکاز کی اینٹی بیکٹیریل سرگرمی کا تجارتی فنگسائڈ Rizolex-T (10 mg/L) سے موازنہ۔ (B, C) L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 اور 125 mg/L) یا Rizolex-T (2, 4, 6, 8 اور 10 mg/L) کے مختلف ارتکاز کے ساتھ علاج کے بعد S. sclerotiorum mycelial گروتھ کی روک تھام کی شرح (%)۔ اقدار پانچ حیاتیاتی نقلوں (n = 5) کے اوسط ± SD کی نمائندگی کرتی ہیں۔ مختلف حروف علاج کے درمیان شماریاتی فرق کو ظاہر کرتے ہیں (p <0.05)۔ (D, E) بالترتیب L-ornithine اور کمرشل فنگسائڈ Rizolex-T کا پروبیٹ ماڈل ریگریشن تجزیہ۔ پروبٹ ماڈل ریگریشن لائن کو ایک ٹھوس نیلی لکیر کے طور پر دکھایا گیا ہے، اور اعتماد کا وقفہ (95%) ڈیشڈ ریڈ لائن کے طور پر دکھایا گیا ہے۔
اس کے علاوہ، پروبٹ ریگریشن تجزیہ کیا گیا اور متعلقہ پلاٹ ٹیبل 1 اور اعداد و شمار 2D، E میں دکھائے گئے ہیں۔ مختصراً، قابل قبول ڈھلوان قدر (y = 2.92x − 4.67) اور اس سے وابستہ اہم اعدادوشمار (Cox & Snell R2 = 0.3709، Nagelkerke R2 = 0.4998 اور p <0.0001; Figure 2D) L-ornithine کی کمرشل سرگرمی کے مقابلے میں اینٹی روٹ اسکائیل کی نشاندہی کرتا ہے۔ فنگسائڈ Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99، Cox & Snell R2 = 0.1242، Nagelkerke R2 = 0.1708 اور p <0.0001) (ٹیبل 1)۔
جدول 1. S. sclerotiorum کے خلاف L-ornithine اور کمرشل فنگسائڈ "Rizolex-T" کی نصف زیادہ سے زیادہ روک تھام کرنے والے ارتکاز (IC50) اور IC99 (mg/l) کی قدریں۔
مجموعی طور پر، L-ornithine (250 mg/L) نے علاج نہ کیے گئے S. sclerotiorum-infected plants (control; Figure 3A) کے مقابلے میں علاج شدہ عام پھلیوں کے پودوں پر سفید مولڈ کی نشوونما اور شدت کو نمایاں طور پر کم کیا۔ مختصراً، اگرچہ علاج نہ کیے جانے والے متاثرہ کنٹرول پلانٹس کی بیماری کی شدت میں بتدریج اضافہ ہوا (52.67 ± 1.53، 83.21 ± 2.61، اور 92.33 ± 3.06%)، L-ornithine نے پورے تجربے میں بیماری کی شدت (%) میں نمایاں طور پر کمی کی۔ 1.00، اور 26.36 ± 3.07) بالترتیب 7، 14، اور 21 دن بعد علاج (dpt) پر (شکل 3A)۔ اسی طرح، جب S. sclerotiorum-infected bean plants کا علاج 250 mg/L L-ornithine کے ساتھ کیا گیا تو بیماری کے بڑھنے کے منحنی خطوط (AUDPC) کے زیر علاج رقبہ غیر علاج شدہ کنٹرول میں 1274.33 ± 33.13 سے کم ہو کر 281.03 ± 7.95 ہو گیا، جو کہ 50mg/L کے مثبت کنٹرول سے کم تھا۔ فنگسائڈ (183.61 ± 7.71؛ تصویر 3B)۔ دوسرے تجربے میں بھی یہی رجحان دیکھا گیا۔
تصویر 3. گرین ہاؤس حالات میں Sclerotinia sclerotiorum کی وجہ سے عام بین کی سفید سڑ کی نشوونما پر L-ornithine کے خارجی استعمال کا اثر۔ (A) 250 mg/L L-ornithine کے ساتھ علاج کے بعد عام بین کے سفید سانچے کی بیماری کے بڑھنے کا وکر۔ (B) L-ornithine کے ساتھ علاج کے بعد عام پھلیوں کے سفید مولڈ کا بیماری کے بڑھنے کے منحنی خطوط (AUDPC) کے نیچے کا علاقہ۔ اقدار پانچ حیاتیاتی نقلوں (n = 5) کے اوسط ± SD کی نمائندگی کرتی ہیں۔ مختلف حروف علاج کے درمیان شماریاتی لحاظ سے اہم فرق کو ظاہر کرتے ہیں (p <0.05)۔
250 mg/L L-ornithine کے خارجی استعمال سے 42 دنوں کے بعد پودے کی اونچائی (تصویر 4A)، فی پودے کی شاخوں کی تعداد (تصویر 4B) اور فی پودے کے پتوں کی تعداد (تصویر 4C) میں بتدریج اضافہ ہوا۔ جبکہ تجارتی فنگسائڈ Rizolex-T (50 mg/L) کا مطالعہ کیے گئے تمام غذائیت کے پیرامیٹرز پر سب سے زیادہ اثر پڑا، 250 mg/L L-ornithine کے خارجی استعمال نے علاج نہ کیے جانے والے کنٹرولز (تصویر 4A–C) کے مقابلے میں دوسرا سب سے بڑا اثر ڈالا۔ دوسری طرف، L-ornithine کے علاج کا فوٹو سنتھیٹک روغن کلوروفل اے (تصویر 4D) اور کلوروفل بی (تصویر 4E) کے مواد پر کوئی خاص اثر نہیں پڑا، لیکن منفی کنٹرول کے مقابلے میں کل کیروٹینائیڈ مواد (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) میں قدرے اضافہ ہوا مثبت کنٹرول (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt؛ تصویر 4F)۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ L-ornithine علاج شدہ پھلوں کے لیے فائٹوٹوکسک نہیں ہے اور ان کی نشوونما کو بھی متحرک کر سکتا ہے۔
تصویر 4. گرین ہاؤس کے حالات میں Sclerotinia sclerotiorum سے متاثر پھلیوں کے پتوں کی نشوونما کی خصوصیات اور فوتوسنتھیٹک روغن پر exogenous L-ornithine کے استعمال کا اثر۔ (A) پودے کی اونچائی (سینٹی میٹر)، (B) فی پودا شاخوں کی تعداد، (C) فی پودے کے پتوں کی تعداد، (D) کلوروفل ایک مواد (mg-1 fr wt)، (E) کلوروفل b مواد (mg-1 fr wt)، (F) کل کیروٹینائڈ مواد (mg-1 fr wt)۔ اقدار پانچ حیاتیاتی نقلوں (n = 5) کی اوسط ± SD ہیں۔ مختلف حروف علاج کے درمیان شماریاتی لحاظ سے اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (p <0.05)۔
ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں کی ہسٹو کیمیکل لوکلائزیشن میں (ROS؛ ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ [H2O2] کے طور پر ظاہر کیا گیا ہے) اور آزاد ریڈیکلز (جس کا اظہار سپر آکسائیڈ anions [O2•−] کے طور پر کیا گیا ہے) نے انکشاف کیا کہ L-ornithine (250 mg/L) کے خارجی استعمال نے H.520 ±53 کے جمع ہونے کو نمایاں طور پر کم کیا۔ nmol.g−1 FW؛ Fig. 5A) اور O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW؛ تصویر 5B) دونوں غیر علاج شدہ پودوں کے جمع ہونے کے مقابلے (173.31 ± 12.06 اور 149.35 ± 149.35 علاج شدہ پلانٹ، 149.35) تجارتی فنگسائڈ Rizolex-T کے 50 mg/L کے ساتھ (170.12 ± 9.50 اور 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt، بالترتیب) 72 گھنٹے پر۔ H2O2 اور O2•− کی اعلی سطح hpt کے تحت جمع ہوتی ہے (تصویر 5A، B)۔ اسی طرح، TCA پر مبنی malondialdehyde (MDA) پرکھ سے پتہ چلتا ہے کہ S. sclerotiorum-infected bean plants نے MDA کی اعلی سطح (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) اپنے پتوں میں جمع کی ہے (تصویر 5C)۔ تاہم، L-ornithine کے خارجی استعمال نے لپڈ پیرو آکسیڈیشن کو نمایاں طور پر کم کیا جیسا کہ علاج شدہ پودوں (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) میں MDA مواد میں کمی سے ظاہر ہوتا ہے۔
تصویر 5. گرین ہاؤس حالات میں انفیکشن کے 72 گھنٹے بعد ایس سکلیروٹیرم سے متاثرہ بین کے پتوں میں آکسیڈیٹیو تناؤ اور غیر انزیمیٹک اینٹی آکسیڈینٹ دفاعی میکانزم کے بڑے مارکروں پر خارجی L-ornithine کے استعمال کا اثر۔ (A) ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (H2O2؛ nmol g−1 FW) 72 hpt پر، (B) سپر آکسائیڈ anion (O2•−؛ nmol g−1 FW) 72 hpt پر، (C) میلونڈیالڈہائڈ (MDA؛ nmol g−1 FW) 72 hpt پر، (D) کل جی اے فینیل (D) G−1FW، 72 hpt پر 72 hpt، (E) کل گھلنشیل flavonoids (mg RE g−1 FW) 72 hpt پر، (F) کل مفت امینو ایسڈ (mg−1 FW) 72 hpt پر، اور (G) پرولین مواد (mg−1 FW) 72 hpt پر۔ اقدار 5 حیاتیاتی نقلوں (n = 5) کے اوسط ± معیاری انحراف (مطلب ± SD) کی نمائندگی کرتی ہیں۔ مختلف حروف علاج کے درمیان شماریاتی لحاظ سے اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (p <0.05)۔