Nature.com پر جانے کا شکریہ۔ براؤزر کا جو ورژن آپ استعمال کر رہے ہیں وہ محدود CSS سپورٹ رکھتا ہے۔ بہترین نتائج کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ اپنے براؤزر کا نیا ورژن استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔ اس دوران، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو اسٹائل یا جاوا اسکرپٹ کے بغیر دکھا رہے ہیں۔
Propionic ایسڈ (PPA) کا استعمال نیورو ڈیولپمنٹل عوارض جیسے کہ آٹزم اسپیکٹرم ڈس آرڈر میں مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کے کردار کا مطالعہ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ پی پی اے مائٹوکونڈریل بائیوجنسیس، میٹابولزم، اور ٹرن اوور میں خلل ڈالنے کے لیے جانا جاتا ہے۔ تاہم، مائٹوکونڈریل ڈائنامکس، فیوژن اور فیوژن پر پی پی اے کے اثرات ان میکانزم کی پیچیدہ وقتی نوعیت کی وجہ سے پریشانی کا شکار ہیں۔ یہاں، ہم یہ جانچنے کے لیے تکمیلی مقداری امیجنگ تکنیک کا استعمال کرتے ہیں کہ پی پی اے کس طرح نیوران نما SH-SY5Y خلیوں میں مائٹوکونڈریل الٹرا سٹرکچر، مورفولوجی، اور حرکیات کو متاثر کرتا ہے۔ پی پی اے (5 ایم ایم) کی وجہ سے مائٹوکونڈریل ایریا (پی <0.01)، فیریٹ قطر اور فریم (پی <0.05)، اور ایریا 2 (پی <0.01) میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ مائٹوکونڈریل ایونٹ لوکیٹر کے تجزیہ نے فیوژن اور فیوژن کے واقعات میں نمایاں اضافہ (p <0.05) دکھایا، اس طرح تناؤ کے حالات میں مائٹوکونڈریل نیٹ ورک کی سالمیت کو برقرار رکھا۔ اس کے علاوہ، cMYC (p <0.0001)، NRF1 (p <0.01)، TFAM (p <0.05)، STOML2 (p <0.0001) اور OPA1 (p <0.05) کے mRNA اظہار کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا۔ 01)۔ یہ کشیدگی کے حالات میں کام کو برقرار رکھنے کے لیے مائٹوکونڈریل مورفولوجی، بائیو جینیسس اور ڈائنامکس کی دوبارہ تشکیل کو واضح کرتا ہے۔ ہمارا ڈیٹا مائٹوکونڈریل ڈائنامکس پر پی پی اے کے اثرات کے بارے میں نئی ​​بصیرت فراہم کرتا ہے اور مائٹوکونڈریل تناؤ کے ردعمل میں شامل پیچیدہ ریگولیٹری میکانزم کا مطالعہ کرنے کے لیے امیجنگ تکنیک کی افادیت کو اجاگر کرتا ہے۔
مائٹوکونڈریا مختلف قسم کے سیلولر افعال میں انرجی کی پیداوار اور بائیو سنتھیسز میں اپنے مخصوص کردار سے ہٹ کر لازمی حصہ دار ہیں۔ مائٹوکونڈریل میٹابولزم کیلشیم سگنلنگ، میٹابولک اور ریڈوکس ہومیوسٹاسس، انفلامیٹری سگنلنگ، ایپی جینیٹک ترمیم، سیل کے پھیلاؤ، تفریق اور پروگرام شدہ سیل ڈیتھ1 کا کلیدی ریگولیٹر ہے۔ خاص طور پر، مائٹوکونڈریل میٹابولزم نیورونل ڈیولپمنٹ، بقا اور فنکشن کے لیے اہم ہے اور نیوروپیتھولوجی 2،3،4 کے مختلف مظاہر میں بڑے پیمانے پر ملوث ہے۔
پچھلی دہائی کے دوران، میٹابولک سٹیٹس نیوروجنسیس، تفریق، پختگی اور پلاسٹکٹی5,6 کے مرکزی ریگولیٹر کے طور پر ابھرا ہے۔ حال ہی میں، مائٹوکونڈریل مورفولوجی اور حرکیات مائٹوسس کے خاص طور پر اہم اجزاء بن گئے ہیں، یہ ایک متحرک عمل ہے جو خلیوں کے اندر صحت مند مائٹوکونڈریا کے تالاب کو برقرار رکھتا ہے۔ مائٹوکونڈریل ڈائنامکس کو پیچیدہ باہم منحصر راستوں سے منظم کیا جاتا ہے جس میں مائٹوکونڈریل بائیو جینیسس اور بائیو اینرجیٹکس سے لے کر مائٹوکونڈریل فیوژن، فیوژن، ٹرانسپورٹ اور کلیئرنس7,8 شامل ہیں۔ ان میں سے کسی بھی انٹیگریٹیو میکانزم میں خلل صحت مند مائٹوکونڈریل نیٹ ورکس کی دیکھ بھال کو متاثر کرتا ہے اور نیورو ڈیولپمنٹ 9,10 کے لیے گہرے فعال نتائج ہیں۔ درحقیقت، مائٹوکونڈریل ڈائنامکس کی بے ضابطگی بہت سے نفسیاتی، نیوروڈیجنریٹیو اور نیورو ڈیولپمنٹل عوارض میں دیکھی جاتی ہے، بشمول آٹزم اسپیکٹرم ڈس آرڈر (ASD)11,12۔
ASD ایک پیچیدہ جینیاتی اور ایپی جینیٹک فن تعمیر کے ساتھ ایک متفاوت نیورو ڈیولپمنٹل عارضہ ہے۔ ASD کی وراثت غیر متنازعہ ہے، لیکن بنیادی مالیکیولر ایٹولوجی کو اچھی طرح سے سمجھا نہیں جاتا ہے۔ پری کلینکل ماڈلز، کلینیکل اسٹڈیز، اور ملٹی اومکس مالیکیولر ڈیٹاسیٹس سے ڈیٹا اکٹھا کرنا ASD13,14 میں مائٹوکونڈریل dysfunction کے بڑھتے ہوئے ثبوت فراہم کرتا ہے۔ ہم نے پہلے اے ایس ڈی والے مریضوں کے ایک گروپ میں جینوم وسیع ڈی این اے میتھیلیشن اسکرین کی تھی اور مائٹوکونڈریل میٹابولک پاتھ ویز 15 کے ساتھ کلسٹرڈ مختلف میتھلیٹڈ جینوں کی نشاندہی کی تھی۔ ہم نے بعد میں مائٹوکونڈریل بائیوجنسیس اور ڈائنامکس کے سنٹرل ریگولیٹرز کے تفریق میتھیلیشن کی اطلاع دی، جس کا تعلق MtDNA کاپی نمبر میں اضافہ اور ASD16 میں پیشاب کی میٹابولک پروفائل میں تبدیلی سے تھا۔ ہمارا ڈیٹا بڑھتا ہوا ثبوت فراہم کرتا ہے کہ مائٹوکونڈریل ڈائنامکس اور ہومیوسٹاسس ASD کی پیتھوفیسولوجی میں مرکزی کردار ادا کرتے ہیں۔ لہٰذا، مائٹوکونڈریل ڈائنامکس، مورفولوجی، اور فنکشن کے درمیان تعلق کی میکانکی سمجھ کو بہتر بنانا ثانوی مائٹوکونڈریل dysfunction کی خصوصیت والی اعصابی بیماریوں میں جاری تحقیق کا ایک اہم ہدف ہے۔
سالماتی تکنیکوں کو اکثر مائٹوکونڈریل تناؤ کے ردعمل میں مخصوص جینوں کے کردار کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ تاہم، یہ نقطہ نظر مائٹوٹک کنٹرول میکانزم کی کثیر جہتی اور وقتی نوعیت کے ذریعہ محدود ہوسکتا ہے۔ مزید برآں، مائٹوکونڈریل جینز کا امتیازی اظہار فنکشنل تبدیلیوں کا بالواسطہ اشارہ ہے، خاص طور پر چونکہ عام طور پر صرف محدود تعداد میں جینز کا تجزیہ کیا جاتا ہے۔ لہذا، مائٹوکونڈریل فنکشن اور بائیو اینرجیٹکس کے مطالعہ کے لیے مزید براہ راست طریقے تجویز کیے گئے ہیں۔ مائٹوکونڈریل مورفولوجی کا مائٹوکونڈریل ڈائنامکس سے گہرا تعلق ہے۔ مائٹوکونڈریل شکل، کنیکٹوٹی، اور ساخت توانائی کی پیداوار اور مائٹوکونڈریل اور سیل کی بقا کے لیے اہم ہیں 5,18۔ مزید برآں، مائٹوسس کے مختلف اجزاء مائٹوکونڈریل مورفولوجی میں ہونے والی تبدیلیوں پر توجہ مرکوز کرتے ہیں، جو مائٹوکونڈریل dysfunction کے مفید اختتامی نقطہ کے طور پر کام کر سکتے ہیں اور بعد میں میکانکی مطالعات کے لیے بنیاد فراہم کرتے ہیں۔
مائٹوکونڈریل مورفولوجی کو ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM) کا استعمال کرتے ہوئے براہ راست دیکھا جا سکتا ہے، جس سے سیلولر الٹراسٹرکچر کا تفصیلی مطالعہ کیا جا سکتا ہے۔ TEM سیل کی آبادی 17,19,20 میں مکمل طور پر جین ٹرانسکرپشن، پروٹین ایکسپریشن یا مائٹوکونڈریل فنکشنل پیرامیٹرز پر انحصار کرنے کے بجائے، انفرادی مائٹوکونڈریا کی ریزولوشن پر مائٹوکونڈریل کرسٹی کی شکل، شکل اور ساخت کا براہ راست تصور کرتا ہے۔ اس کے علاوہ، TEM مائٹوکونڈریا اور دیگر آرگنیلز، جیسے اینڈوپلاسمک ریٹیکولم اور آٹوفاگوسومز کے درمیان تعاملات کے مطالعہ میں سہولت فراہم کرتا ہے، جو مائٹوکونڈریل فنکشن اور ہومیوسٹاسس 21,22 میں کلیدی کردار ادا کرتے ہیں۔ اس طرح، یہ TEM کو مخصوص راستوں یا جینوں پر توجہ مرکوز کرنے سے پہلے mitochondrial dysfunction کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک اچھا نقطہ آغاز بناتا ہے۔ چونکہ مائٹوکونڈریل فنکشن نیوروپیتھولوجی سے تیزی سے متعلقہ ہوتا جاتا ہے، اس لیے وٹرو نیورونل ماڈلز میں مائٹوکونڈریل مورفولوجی اور ڈائنامکس کا براہ راست اور مقداری مطالعہ کرنے کے قابل ہونے کی واضح ضرورت ہے۔
اس مضمون میں، ہم آٹزم اسپیکٹرم ڈس آرڈر میں مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کے نیورونل ماڈل میں مائٹوکونڈریل ڈائنامکس کا جائزہ لیتے ہیں۔ ہم نے پہلے ASD15 میں propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) کے تفریق میتھیلیشن کی اطلاع دی تھی، جو کہ mitochondrial propionyl-CoA carboxylase انزائم PCC کا ایک ذیلی یونٹ ہے۔ PCC کی بے ضابطگی propionyl مشتقات کے زہریلے جمع ہونے کا سبب بنتی ہے، بشمول propionic acid (PPA) 23,24,25۔ پی پی اے کو نیورونل میٹابولزم میں خلل ڈالنے اور Vivo میں رویے کو تبدیل کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے اور ASD26,27,28 میں شامل نیورو ڈیولپمنٹل میکانزم کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک قائم کردہ جانوروں کا ماڈل ہے۔ مزید برآں، پی پی اے کو وٹرو میں مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت، بائیوجنسیس اور سانس میں خلل ڈالنے کی اطلاع دی گئی ہے اور نیوران 29,30 میں مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کو ماڈل کرنے کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے۔ تاہم، مائٹوکونڈریل مورفولوجی اور حرکیات پر پی پی اے کی حوصلہ افزائی مائٹوکونڈریل dysfunction کے اثرات کو اچھی طرح سے سمجھا نہیں جاتا ہے۔
یہ مطالعہ SH-SY5Y خلیوں میں مائٹوکونڈریل مورفولوجی، حرکیات، اور فنکشن پر پی پی اے کے اثرات کو درست کرنے کے لیے تکمیلی امیجنگ تکنیک کا استعمال کرتا ہے۔ سب سے پہلے، ہم نے مائٹوکونڈریل مورفولوجی اور الٹراسٹرکچر17,31,32 میں تبدیلیوں کو دیکھنے کے لیے ایک TEM طریقہ تیار کیا۔ مائٹوکونڈریا 33 کی متحرک نوعیت کو دیکھتے ہوئے، ہم نے پی پی اے تناؤ کے تحت فیوژن اور فیوژن ایونٹس، مائٹوکونڈریل نمبر اور حجم کے درمیان توازن میں تبدیلیوں کی مقدار درست کرنے کے لیے مائٹوکونڈریل ایونٹ لوکلائزر (MEL) تجزیہ بھی استعمال کیا۔ آخر میں، ہم نے جانچ کی کہ آیا مائٹوکونڈریل مورفولوجی اور ڈائنامکس کا تعلق بایوجنسیس، فیوژن اور فیوژن میں شامل جینوں کے اظہار میں ہونے والی تبدیلیوں سے ہے۔ ایک ساتھ مل کر، ہمارا ڈیٹا مائٹوکونڈریل ڈائنامکس کو منظم کرنے والے میکانزم کی پیچیدگی کو واضح کرنے کے چیلنج کی وضاحت کرتا ہے۔ ہم SH-SY5Y خلیوں میں mitosis کے قابل پیمائش کنورجنٹ اینڈ پوائنٹ کے طور پر مائٹوکونڈریل مورفولوجی کا مطالعہ کرنے میں TEM کی افادیت کو اجاگر کرتے ہیں۔ مزید برآں، ہم اس بات پر روشنی ڈالتے ہیں کہ TEM ڈیٹا امیجنگ تکنیک کے ساتھ مل کر سب سے زیادہ معلومات فراہم کرتا ہے جو میٹابولک تناؤ کے جواب میں متحرک واقعات کو بھی گرفت میں لیتے ہیں۔ مالیکیولر ریگولیٹری میکانزم کی مزید خصوصیت جو نیورونل سیل مائٹوسس کو سپورٹ کرتی ہے اعصابی نظام اور نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کے مائٹوکونڈریل جزو میں اہم بصیرت فراہم کر سکتی ہے۔
مائٹوکونڈریل تناؤ کو دلانے کے لیے، SH-SY5Y خلیوں کا علاج PPA کے ساتھ 3 mM اور 5 mM سوڈیم پروپیونیٹ (NaP) کے ذریعے کیا گیا۔ TEM سے پہلے، نمونوں کو ہائی پریشر فریزنگ اور فریزنگ (تصویر 1a) کا استعمال کرتے ہوئے کرائیوجینک نمونے کی تیاری کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ ہم نے تین حیاتیاتی نقلوں میں مائٹوکونڈریل آبادی کے آٹھ مورفولوجیکل پیرامیٹرز کی پیمائش کرنے کے لئے ایک خودکار مائٹوکونڈریل امیج تجزیہ پائپ لائن تیار کی ہے۔ ہم نے پایا کہ پی پی اے کے علاج نے چار پیرامیٹرز کو نمایاں طور پر تبدیل کیا: رقبہ 2، رقبہ، دائرہ، اور فیریٹ قطر (تصویر 1b–e)۔ رقبہ 2 میں 3 mM اور 5 mM PPA علاج (p = 0.0183 اور p = 0.002، بالترتیب) (تصویر 1b) دونوں کے ساتھ نمایاں کمی واقع ہوئی ہے، جبکہ رقبہ (p = 0.003)، دائرہ (p = 0.0106) اور فیریٹ قطر سبھی میں نمایاں کمی واقع ہوئی ہے۔ کنٹرول گروپ (تصویر 1c–e) کے مقابلے 5 ایم ایم ٹریٹمنٹ گروپ میں نمایاں کمی (p = 0.0172) تھی۔ رقبہ اور فریم میں نمایاں کمی سے پتہ چلتا ہے کہ 5 ایم ایم پی پی اے کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں میں چھوٹا، زیادہ گول مائٹوکونڈریا ہوتا ہے، اور یہ مائٹوکونڈریا کنٹرول سیلز کے مقابلے میں کم لمبا ہوتا ہے۔ یہ فیریٹ قطر میں نمایاں کمی کے ساتھ بھی مطابقت رکھتا ہے، ایک آزاد پیرامیٹر جو ذرہ کناروں کے درمیان سب سے بڑے فاصلے میں کمی کی نشاندہی کرتا ہے۔ کرسٹی کے الٹرا سٹرکچر میں تبدیلیاں دیکھی گئیں: پی پی اے تناؤ (تصویر 1 اے، پینل بی) کے زیر اثر کرسٹی کم واضح ہو گئی۔ تاہم، تمام تصاویر واضح طور پر کرسٹی کے الٹراسٹرکچر کی عکاسی نہیں کرتی ہیں، اس لیے ان تبدیلیوں کا مقداری تجزیہ نہیں کیا گیا۔ یہ TEM ڈیٹا تین ممکنہ منظرناموں کی عکاسی کر سکتا ہے: (1) PPA فیوژن کو بڑھاتا ہے یا فیوژن کو روکتا ہے، جس سے موجودہ مائٹوکونڈریا سائز میں سکڑ جاتا ہے۔ (2) بڑھا ہوا بایوجنسیس نیا، چھوٹا مائٹوکونڈریا بناتا ہے یا (3) بیک وقت دونوں میکانزم کو اکساتا ہے۔ اگرچہ ان حالات کو ٹی ای ایم کے ذریعہ ممتاز نہیں کیا جاسکتا ہے، لیکن اہم مورفولوجیکل تبدیلیاں پی پی اے کے دباؤ کے تحت مائٹوکونڈریل ہومیوسٹاسس اور حرکیات میں تبدیلیوں کی نشاندہی کرتی ہیں۔ ہم نے بعد میں ان حرکیات اور ان میں موجود ممکنہ میکانزم کو مزید نمایاں کرنے کے لیے اضافی پیرامیٹرز کی کھوج کی۔
پروپیونک ایسڈ (پی پی اے) مائٹوکونڈریل مورفولوجی کو دوبارہ تیار کرتا ہے۔ (a) نمائندہ ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکروسکوپی (TEM) کی تصاویر جو دکھاتی ہیں کہ مائٹوکونڈریل سائز کم ہوتا ہے اور مائٹوکونڈریا PPA کے بڑھتے ہوئے علاج کے ساتھ چھوٹا اور زیادہ گول ہو جاتا ہے۔ بالترتیب 0 mM (غیر علاج شدہ)، 3 mM اور 5 mM۔ سرخ تیر مائٹوکونڈریا کی نشاندہی کرتے ہیں۔ (b–e) پی پی اے کے ساتھ 24 گھنٹے تک علاج کیے جانے والے SH-SY5Y خلیات TEM کے لیے تیار کیے گئے تھے اور نتائج کا تجزیہ فجی/ImageJ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ آٹھ میں سے چار پیرامیٹرز نے کنٹرول (غیر علاج شدہ، 0 ایم ایم پی پی اے) اور علاج شدہ (3 ایم ایم اور 5 ایم ایم پی پی اے) خلیوں کے درمیان اہم فرق ظاہر کیا۔ (b) علاقہ 2، (c) رقبہ، (d) دائرہ، (e) فیریٹ قطر۔ تغیرات کا یک طرفہ تجزیہ (کنٹرول بمقابلہ علاج) اور ڈنیٹ کے متعدد موازنہ ٹیسٹ کو اہم اختلافات کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا (p <0.05)۔ ڈیٹا پوائنٹس ہر انفرادی سیل کے لیے اوسط مائٹوکونڈریل قدر کی نمائندگی کرتے ہیں، اور ایرر بارز اوسط ± SEM کی نمائندگی کرتے ہیں۔ دکھایا گیا ڈیٹا n = 3 کی نمائندگی کرتا ہے، کم از کم 24 سیل فی نقل؛ کل 266 تصاویر کا تجزیہ کیا گیا۔ * اشارہ کرتا ہے p <0.05، ** اشارہ کرتا ہے p <0.01۔
مزید یہ بتانے کے لیے کہ مائٹوکونڈریل ڈائنامکس پی پی اے کو کیسے جواب دیتے ہیں، ہم نے مائٹوکونڈریا کو ٹیٹرامیتھائلروڈامین ایتھل ایسٹر (TMRE) سے داغ دیا اور 24 گھنٹے کے بعد 3 اور 5 ایم ایم پی پی اے پر مائٹوکونڈریا کو مقامی بنانے اور مقدار درست کرنے کے لیے ٹائم لیپس مائکروسکوپی اور MEL تجزیہ کا استعمال کیا۔ فیوژن اور فیوژن واقعات کا علاج۔ (تصویر 2a)۔ MEL تجزیہ کے بعد، مائٹوکونڈریا کا مزید تجزیہ کیا گیا تاکہ مائٹوکونڈریل ڈھانچے کی تعداد اور ان کے اوسط حجم کو درست کیا جا سکے۔ ہم نے فیوژن [5.6 ± 0.3 (p <0.05))] اور فیوژن [5.4 ± 0.5 (p <0.05)] اور 5 ± 0.05) اور فیوژن کے مقابلے 3 mM [4.9 ± 0.3 (p <0.05)] میں ہونے والے فیوژن واقعات کی تعداد میں ایک چھوٹا لیکن نمایاں اضافہ دیکھا۔ 0.05)] <0.05)] واقعات کو کنٹرول کے مقابلے میں 5 ایم ایم میں نمایاں طور پر بڑھایا گیا تھا (تصویر 3b)۔ مائٹوکونڈریا کی تعداد 3 [32.6 ± 2.1 (p <0.05)] اور 5 mM [34.1 ± 2.2 (p <0.05)] (تصویر 3c) دونوں پر نمایاں طور پر بڑھ گئی، جبکہ ہر مائٹوکونڈریل ڈھانچے کی اوسط حجم میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی (تصویر 3c)۔ 3d)۔ ایک ساتھ مل کر، اس سے پتہ چلتا ہے کہ مائٹوکونڈریل ڈائنامکس کی دوبارہ تشکیل ایک معاوضہ ردعمل کے طور پر کام کرتی ہے جو کامیابی کے ساتھ مائٹوکونڈریل نیٹ ورک کی سالمیت کو برقرار رکھتی ہے۔ 3 ایم ایم پی پی اے میں فیوژن واقعات کی تعداد میں اضافہ بتاتا ہے کہ مائٹوکونڈریل نمبر میں اضافہ جزوی طور پر مائٹوکونڈریل فیشن کی وجہ سے ہے، لیکن یہ دیکھتے ہوئے کہ اوسط مائٹوکونڈریل حجم بنیادی طور پر کوئی تبدیلی نہیں ہے، بائیو جینیسس کو اضافی معاوضہ کے ردعمل کے طور پر مسترد نہیں کیا جا سکتا۔ تاہم، یہ اعداد و شمار ٹی ای ایم کے مشاہدہ کردہ چھوٹے، گول مائٹوکونڈریل ڈھانچے کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں اور پی پی اے کے ذریعہ مائٹوکونڈریل حرکیات میں نمایاں تبدیلیوں کو بھی ظاہر کرتے ہیں۔
Propionic ایسڈ (PPA) نیٹ ورک کی سالمیت کو برقرار رکھنے کے لیے متحرک مائٹوکونڈریل ریموڈلنگ کی حوصلہ افزائی کرتا ہے۔ SH-SY5Y خلیوں کو کلچر کیا گیا، 24 گھنٹے تک 3 اور 5 mM PPA کے ساتھ علاج کیا گیا اور TMRE اور Hoechst 33342 کے ساتھ داغ دیا گیا جس کے بعد MEL تجزیہ کیا گیا۔ (a) نمائندہ ٹائم لیپس مائکروسکوپی امیجز جو ہر حالت کے لیے وقت 2 (t2) پر رنگ اور بائنرائزڈ زیادہ سے زیادہ شدت کے تخمینے کو ظاہر کرتی ہیں۔ ہر بائنری امیج میں اشارہ کردہ منتخب خطوں کو بڑھایا جاتا ہے اور تین مختلف ٹائم فریموں (t1-t3) پر 3D میں دکھایا جاتا ہے تاکہ وقت کے ساتھ ساتھ حرکیات کو واضح کیا جا سکے۔ فیوژن کے واقعات کو سبز رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے۔ فِشن ایونٹس کو سبز رنگ میں ہائی لائٹ کیا گیا ہے۔ سرخ رنگ میں دکھایا گیا۔ (b) فی شرط متحرک واقعات کی اوسط تعداد۔ (c) فی سیل مائٹوکونڈریل ڈھانچے کی اوسط تعداد۔ (d) فی سیل ہر مائٹوکونڈریل ڈھانچے کا اوسط حجم (µm3)۔ دکھایا گیا ڈیٹا n = 15 سیلز فی ٹریٹمنٹ گروپ کا نمائندہ ہے۔ دکھائی گئی خرابی والی سلاخوں کا مطلب ہے ± SEM، اسکیل بار = 10 μm، * p <0.05۔
پروپیونک ایسڈ (پی پی اے) مائٹوکونڈریل حرکیات سے وابستہ جینوں کے نقلی دبانے کا سبب بنتا ہے۔ SH-SY5Y خلیوں کا علاج 24 گھنٹے کے لیے 3 اور 5 mM PPA سے کیا گیا۔ متعلقہ جین کی مقدار کا تعین RT-qPCR کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور B2M پر معمول بنایا گیا تھا۔ Mitochondrial biogenesis genes (a) cMYC، (b) TFAM، (c) NRF1 اور (d) NFE2L2۔ مائٹوکونڈریل فیوژن اور فیوژن جینز (e) STOML2، (f) OPA1، (g) MFN1، (h) MFN2 اور (i) DRP1۔ اہم اختلافات (p <0.05) کو یک طرفہ انووا (کنٹرول بمقابلہ علاج) اور ڈنیٹ کے متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے جانچا گیا: * p <0.05 کی نشاندہی کرتا ہے، ** p <0.01 کی نشاندہی کرتا ہے، اور **** p <0.0001 کی نشاندہی کرتا ہے۔ سلاخیں اوسط اظہار ± SEM کی نمائندگی کرتی ہیں۔ دکھایا گیا ڈیٹا n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM)، n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2)، اور n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) حیاتیاتی نقلوں کی نمائندگی کرتا ہے۔
ٹی ای ایم اور ایم ای ایل کے تجزیوں کے ڈیٹا سے پتہ چلتا ہے کہ پی پی اے مائٹوکونڈریل مورفولوجی اور حرکیات کو تبدیل کرتا ہے۔ تاہم، یہ امیجنگ تکنیک ان عملوں کو چلانے والے بنیادی میکانزم کے بارے میں بصیرت فراہم نہیں کرتی ہیں۔ لہذا ہم نے پی پی اے کے علاج کے جواب میں مائٹوکونڈریل ڈائنامکس، بائیوجنسیس، اور مائٹوسس کے نو کلیدی ریگولیٹرز کے ایم آر این اے اظہار کی جانچ کی۔ ہم نے سیل مائیلوما آنکوجین (cMYC)، نیوکلیئر ریسپائریٹری فیکٹر (NRF1)، مائٹوکونڈریل ٹرانسکرپشن فیکٹر 1 (TFAM)، NFE2 جیسا ٹرانسکرپشن فیکٹر BZIP (NFE2L2)، گیسٹرن نما پروٹین 2 (STOML2)، آپٹک نرو ایٹروفی 1 (Mi1FM)، 1 (MI1MF) Mitofusin 2 (MFN2) اور dynamin سے متعلق پروٹین 1 (DRP1) 3 mM اور 5 mM PPA کے ساتھ علاج کے 24 گھنٹے بعد۔ ہم نے 3 mM (p = 0.0053، p = 0.0415 اور p <0.0001، بالترتیب) اور 5 mM (p = 0.0031، p = 0.0233، p <0.0001) PPA علاج کا مشاہدہ کیا۔ (تصویر 3a–c)۔ ایم آر این اے اظہار میں کمی خوراک پر منحصر تھی: سی ایم وائی سی، این آر ایف 1 اور ٹی ایف اے ایم کا اظہار بالترتیب 3 ایم ایم پر 5.7، 2.6 اور 1.9 گنا کم ہوا، اور 5 ایم ایم پر 11.2، 3 اور 2.2 گنا کم ہوا۔ اس کے برعکس، مرکزی ریڈوکس بایوجنسیس جین NFE2L2 کو PPA کے کسی بھی ارتکاز میں تبدیل نہیں کیا گیا تھا، حالانکہ اسی طرح کی خوراک پر منحصر کمی اظہار کا رجحان دیکھا گیا تھا (تصویر 3d)۔
ہم نے فِشن اور فیوژن کے ضابطے میں شامل کلاسیکی جینوں کے اظہار کا بھی جائزہ لیا۔ STOML2 کو فیوژن، mitophagy اور biogenesis میں ملوث سمجھا جاتا ہے، اور اس کے اظہار کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا (p <0.0001) 3 mM (2.4 گنا تبدیلی) اور 5 mM (2.8 گنا تبدیلی) PPA (تصویر 1)۔ 3d)۔ اسی طرح، OPA1 فیوژن جین اظہار میں 3 mM (1.6 گنا تبدیلی) اور 5 mM (1.9 گنا تبدیلی) PPA (p = 0.006 اور p = 0.0024، بالترتیب) (تصویر 3f) میں کمی واقع ہوئی۔ تاہم، ہمیں 24-h PPA تناؤ (تصویر 3g–i) کے تحت فیوژن جینز MFN1، MFN2 یا فیوژن جین DRP1 کے اظہار میں کوئی خاص فرق نہیں ملا۔ اس کے علاوہ، ہم نے پایا کہ چار فیوژن اور فیوژن پروٹینز (OPA1، MFN1، MFN2 اور DRP1) کی سطحیں انہی حالات میں تبدیل نہیں ہوئیں (تصویر 4a–d)۔ یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ یہ اعداد و شمار وقت میں ایک نقطہ کی عکاسی کرتے ہیں اور PPA تناؤ کے ابتدائی مراحل کے دوران پروٹین کے اظہار یا سرگرمی کی سطح میں تبدیلیوں کی عکاسی نہیں کرسکتے ہیں۔ تاہم، cMYC، NRF1، TFAM، STOML2، اور OPA1 کے اظہار میں نمایاں کمی مائٹوکونڈریل میٹابولزم، بایوجنسیس، اور حرکیات کے اہم ٹرانسکرپشنی dysregulation کی نشاندہی کرتی ہے۔ اس کے علاوہ، یہ اعداد و شمار امیجنگ تکنیک کی افادیت کو اجاگر کرتے ہیں تاکہ مائٹوکونڈریل فنکشن میں اختتامی حالت کی تبدیلیوں کا براہ راست مطالعہ کیا جا سکے۔
پروپیونک ایسڈ (پی پی اے) کے علاج کے بعد فیوژن اور فیوژن فیکٹر پروٹین کی سطح میں کوئی تبدیلی نہیں آئی۔ SH-SY5Y خلیوں کا علاج 24 گھنٹے کے لیے 3 اور 5 mM PPA سے کیا گیا۔ مغربی بلاٹ تجزیہ کے ذریعہ پروٹین کی سطح کی مقدار درست کی گئی تھی، اور اظہار کی سطح کو کل پروٹین میں معمول بنایا گیا تھا۔ اوسط پروٹین کا اظہار اور ہدف اور کل پروٹین کے نمائندہ مغربی دھبے دکھائے گئے ہیں۔ a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1۔ بارز اوسط ± SEM کی نمائندگی کرتے ہیں، اور دکھایا گیا ڈیٹا n = 3 حیاتیاتی نقلوں کا نمائندہ ہے۔ متعدد موازنہ (p <0.05) تغیرات اور ڈنیٹ کے ٹیسٹ کے یک طرفہ تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے کئے گئے۔ اصل جیل اور دھبہ کو شکل S1 میں دکھایا گیا ہے۔
Mitochondrial dysfunction کا تعلق کثیر نظام کی بیماریوں سے ہے جس میں میٹابولک، قلبی اور پٹھوں کی بیماریوں سے لے کر اعصابی بیماریوں تک 1,10 شامل ہیں۔ بہت سے نیوروڈیجینریٹیو اور نیوروڈیجینریٹو بیماریاں مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن سے وابستہ ہیں، جو دماغ کی پوری زندگی میں ان آرگنیلز کی اہمیت کو اجاگر کرتی ہیں۔ ان بیماریوں میں پارکنسنز کی بیماری، الزائمر کی بیماری اور ASD3,4,18 شامل ہیں۔ تاہم، ان بیماریوں کا مطالعہ کرنے کے لیے دماغی بافتوں تک رسائی مشکل ہے، خاص طور پر میکانکی سطح پر، سیلولر ماڈل سسٹم کو ایک ضروری متبادل بنانا۔ اس مطالعہ میں، ہم PPA سے علاج شدہ SH-SY5Y خلیات کا استعمال کرتے ہوئے ایک سیلولر ماڈل سسٹم کا استعمال کرتے ہیں تاکہ اعصابی امراض، خاص طور پر آٹزم اسپیکٹرم عوارض میں مشاہدہ کیے جانے والے مائٹوکونڈریل dysfunction کو دوبارہ بیان کیا جا سکے۔ نیوران میں مائٹوکونڈریل ڈائنامکس کا مطالعہ کرنے کے لیے اس پی پی اے ماڈل کا استعمال ASD کی ایٹولوجی کے بارے میں بصیرت فراہم کر سکتا ہے۔
ہم نے مائٹوکونڈریل مورفولوجی میں تبدیلیوں کو دیکھنے کے لئے ٹی ای ایم کے استعمال کے امکان کو تلاش کیا۔ یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ TEM کو اس کی تاثیر کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے صحیح طریقے سے استعمال کیا جانا چاہیے۔ کریو نمونوں کی تیاری بیک وقت سیلولر اجزاء کو ٹھیک کرکے اور نمونوں کی تشکیل کو کم کرکے نیورونل ڈھانچے کے بہتر تحفظ کی اجازت دیتی ہے۔ اس سے مطابقت رکھتے ہوئے، ہم نے مشاہدہ کیا کہ نیوران نما SH-SY5Y خلیات میں برقرار ذیلی خلیاتی آرگنیلز اور لمبا مائٹوکونڈریا (تصویر 1a) تھا۔ یہ نیورونل سیل ماڈلز میں مائٹوکونڈریل مورفولوجی کا مطالعہ کرنے کے لیے کرائیوجینک تیاری کی تکنیک کی افادیت کو اجاگر کرتا ہے۔ اگرچہ مقداری پیمائشیں TEM ڈیٹا کے معروضی تجزیہ کے لیے اہم ہیں، لیکن ابھی تک اس بات پر کوئی اتفاق رائے نہیں ہے کہ مائٹوکونڈریل مورفولوجیکل تبدیلیوں کی تصدیق کے لیے کن مخصوص پیرامیٹرز کی پیمائش کی جانی چاہیے۔ بہت سارے مطالعات کی بنیاد پر جنہوں نے مائٹوکونڈریل مورفولوجی 17,31,32 کو مقداری طور پر جانچا ہے، ہم نے ایک خودکار مائٹوکونڈریل امیج تجزیہ پائپ لائن تیار کی ہے جو آٹھ مورفولوجیکل پیرامیٹرز کی پیمائش کرتی ہے، یعنی: رقبہ، رقبہ2، پہلو تناسب، دائرہ، دائرہ، ڈگری، فیریٹ۔ اور گول پن.
ان میں، پی پی اے نے نمایاں طور پر رقبہ 2، رقبہ، دائرہ، اور فیریٹ قطر (تصویر 1b–e) کو کم کر دیا۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ مائٹوکونڈریا چھوٹا اور زیادہ گول ہو گیا ہے، جو پچھلے مطالعات سے مطابقت رکھتا ہے جس میں PPA30 کی حوصلہ افزائی کے مائٹوکونڈریل تناؤ کے 72 گھنٹے بعد مائٹوکونڈریل ایریا میں کمی واقع ہوئی ہے۔ یہ مورفولوجیکل خصوصیات مائٹوکونڈریل فِشن کی نشاندہی کر سکتی ہیں، مائٹوکونڈریل نیٹ ورک سے خراب اجزاء کو الگ کرنے کے لیے ایک ضروری عمل تاکہ مائٹو فیگی35,36,37 کے ذریعے ان کے انحطاط کو فروغ دیا جا سکے۔ دوسری طرف، اوسط مائٹوکونڈریل سائز میں کمی بڑھتے ہوئے بائیو جینیسس سے منسلک ہو سکتی ہے، جس کے نتیجے میں چھوٹے نوزائیدہ مائٹوکونڈریا کی تشکیل ہوتی ہے۔ بڑھتی ہوئی فِشن یا بایوجنسیس مائٹوکونڈریل تناؤ کے خلاف مائٹوسس کو برقرار رکھنے کے لیے ایک معاوضہ ردعمل کی نمائندگی کرتی ہے۔ تاہم، مائٹوکونڈریل ترقی میں کمی، خراب فیوژن، یا دیگر حالات کو خارج نہیں کیا جا سکتا۔
اگرچہ TEM کے ذریعہ تخلیق کردہ اعلی ریزولیوشن امیجز انفرادی مائٹوکونڈریا کی سطح پر مورفولوجیکل خصوصیات کے تعین کی اجازت دیتی ہیں، یہ طریقہ وقت میں ایک ہی نقطہ پر دو جہتی سنیپ شاٹس تیار کرتا ہے۔ میٹابولک تناؤ کے متحرک ردعمل کا مطالعہ کرنے کے لیے، ہم نے TMRE کے ساتھ مائٹوکونڈریا کو داغ دیا اور MEL تجزیہ کے ساتھ ٹائم لیپس مائکروسکوپی کا استعمال کیا، جس سے 33,38 وقت کے ساتھ مائٹوکونڈریل نیٹ ورک میں تبدیلیوں کے ہائی تھرو پٹ تھری ڈی ویژولائزیشن کی اجازت ملتی ہے۔ ہم نے پی پی اے تناؤ (تصویر 2) کے تحت مائٹوکونڈریل حرکیات میں لطیف لیکن اہم تبدیلیوں کا مشاہدہ کیا۔ 3 ایم ایم پر، فیوژن واقعات کی تعداد میں نمایاں اضافہ ہوا، جبکہ فیوژن کے واقعات وہی رہے جیسے کنٹرول میں تھے۔ فیوژن اور فیوژن دونوں واقعات کی تعداد میں اضافہ 5 ایم ایم پی پی اے پر دیکھا گیا، لیکن یہ تبدیلیاں تقریباً متناسب تھیں، جو تجویز کرتی ہیں کہ فیوژن اور فیوژن کائینیٹکس زیادہ ارتکاز پر توازن تک پہنچ جاتے ہیں (تصویر 2b)۔ اوسط مائٹوکونڈریل حجم 3 اور 5 ایم ایم پی پی اے دونوں پر کوئی تبدیلی نہیں کی گئی، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ مائٹوکونڈریل نیٹ ورک کی سالمیت محفوظ تھی (تصویر 2 ڈی)۔ یہ متحرک مائٹوکونڈریل نیٹ ورکس کی ہلکے میٹابولک تناؤ کا جواب دینے کی صلاحیت کی عکاسی کرتا ہے تاکہ نیٹ ورک کے ٹکڑے ہونے کے بغیر ہومیوسٹاسس کو مؤثر طریقے سے برقرار رکھا جاسکے۔ 3 ایم ایم پی پی اے پر، فِشن میں اضافہ ایک نئے توازن کی طرف منتقلی کو فروغ دینے کے لیے کافی ہے، لیکن پی پی اے کی زیادہ تعداد کی وجہ سے پیدا ہونے والے تناؤ کے جواب میں زیادہ گہرا حرکیاتی دوبارہ تشکیل کی ضرورت ہے۔
مائٹوکونڈریا کی تعداد دونوں پی پی اے تناؤ کے ارتکاز میں بڑھی، لیکن اوسط مائٹوکونڈریل حجم نمایاں طور پر تبدیل نہیں ہوا (تصویر 2 سی)۔ اس کی وجہ بائیو جینیسیس میں اضافہ یا تقسیم میں اضافہ ہو سکتا ہے۔ تاہم، اوسط مائٹوکونڈریل حجم میں نمایاں کمی کی غیر موجودگی میں، یہ زیادہ امکان ہے کہ بایو سنتھیسز بڑھ جائے۔ تاہم، شکل 2 میں موجود اعداد و شمار دو معاوضہ میکانزم کے وجود کی حمایت کرتے ہیں: فیوژن واقعات کی تعداد میں اضافہ، مائٹوکونڈریل فِشن کے اپ گریجولیشن کے مطابق، اور واقعات کی تعداد میں اضافہ، مائٹوکونڈریل بائیو جینیسس کے مطابق۔ بالآخر، ہلکے تناؤ کے لیے متحرک معاوضہ بیک وقت عمل پر مشتمل ہو سکتا ہے جس میں فیوژن، فیوژن، بائیو جینیسس اور مائٹوفجی شامل ہیں۔ اگرچہ پچھلے مصنفین نے دکھایا ہے کہ پی پی اے مائٹوسس 30،39 اور مائٹوفجی 29 کو بڑھاتا ہے، ہم پی پی اے کے جواب میں مائٹوکونڈریل فِشن اور فیوژن ڈائنامکس کو دوبارہ بنانے کے ثبوت فراہم کرتے ہیں۔ یہ اعداد و شمار TEM کی طرف سے مشاہدہ کی گئی مورفولوجیکل تبدیلیوں کی تصدیق کرتے ہیں اور پی پی اے کی حوصلہ افزائی مائٹوکونڈریل dysfunction سے وابستہ میکانزم کے بارے میں مزید بصیرت فراہم کرتے ہیں۔
چونکہ نہ تو TEM اور نہ ہی MEL تجزیہ نے مشاہدہ شدہ مورفولوجیکل تبدیلیوں کے تحت جین ریگولیٹری میکانزم کا براہ راست ثبوت فراہم کیا، ہم نے مائٹوکونڈریل میٹابولزم، بائیو جینیسس اور حرکیات میں شامل جینوں کے آر این اے اظہار کی جانچ کی۔ سی ایم وائی سی پروٹو آنکوجین ایک ٹرانسکرپشن عنصر ہے جو مائٹوکونڈریا، گلائکولائسز، امینو ایسڈ اور فیٹی ایسڈ میٹابولزم کے ضابطے میں شامل ہے۔ اس کے علاوہ، cMYC تقریباً 600 مائٹوکونڈریل جینز کے اظہار کو منظم کرنے کے لیے جانا جاتا ہے جو مائٹوکونڈریل ٹرانسکرپشن، ترجمہ، اور پیچیدہ اسمبلی میں شامل ہیں، بشمول NRF1 اور TFAM41۔ NRF1 اور TFAM مائٹوسس کے دو مرکزی ریگولیٹرز ہیں، جو mtDNA نقل کو چالو کرنے کے لیے PGC-1α کے بہاو پر کام کرتے ہیں۔ یہ راستہ CAMP اور AMPK سگنلنگ کے ذریعے چالو ہوتا ہے اور توانائی کے اخراجات اور میٹابولک تناؤ کے لیے حساس ہے۔ ہم نے NFE2L2 کی بھی جانچ کی، جو مائٹوکونڈریل بائیوجنسیس کا ایک ریڈوکس ریگولیٹر ہے، اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا PPA کے اثرات آکسیڈیٹیو تناؤ کے ذریعے ثالثی کر سکتے ہیں۔
اگرچہ NFE2L2 اظہار میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی، ہمیں 3 mM اور 5 mM PPA (تصویر 3a–c) کے ساتھ علاج کے 24 گھنٹے کے بعد cMYC، NRF1 اور TFAM کے اظہار میں خوراک پر منحصر کمی دیکھی گئی۔ سی ایم وائی سی اظہار کی تنزلی کو پہلے مائٹوکونڈریل تناؤ 42 کے ردعمل کے طور پر رپورٹ کیا گیا ہے، اور اس کے برعکس، سی ایم وائی سی اظہار کی کمی مائٹوکونڈریل میٹابولزم، نیٹ ورک کنیکٹیویٹی، اور جھلی پولرائزیشن کو دوبارہ تشکیل دے کر مائٹوکونڈریل dysfunction کا سبب بن سکتی ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ سی ایم وائی سی مائٹوکونڈریل فیوژن اور فیوژن 42,43 کے ضابطے میں بھی شامل ہے اور سیل ڈویژن44 کے دوران DRP1 فاسفوریلیشن اور مائٹوکونڈریل لوکلائزیشن کو بڑھانے کے ساتھ ساتھ نیورونل اسٹیم سیلز45 میں ثالثی مائٹوکونڈریل مورفولوجیکل ریموڈیلنگ کے لیے جانا جاتا ہے۔ درحقیقت، cMYC کی کمی والے فائبرو بلاسٹس مائٹوکونڈریل سائز میں کمی کو ظاہر کرتے ہیں، جو PPA43 تناؤ کی وجہ سے ہونے والی تبدیلیوں کے مطابق ہے۔ یہ اعداد و شمار سی ایم وائی سی اور مائٹوکونڈریل ڈائنامکس کے درمیان ایک دلچسپ لیکن ابھی تک غیر واضح تعلق کی وضاحت کرتے ہیں، جو پی پی اے کے تناؤ کی حوصلہ افزائی سے دوبارہ تشکیل دینے کے مستقبل کے مطالعے کے لیے ایک دلچسپ ہدف فراہم کرتے ہیں۔
NRF1 اور TFAM کی کمی ایک اہم ٹرانسکرپشن ایکٹیویٹر کے طور پر cMYC کے کردار کے مطابق ہے۔ یہ اعداد و شمار انسانی بڑی آنت کے کینسر کے خلیوں میں پچھلے مطالعات سے بھی مطابقت رکھتے ہیں جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ PPA نے NRF1 mRNA اظہار کو 22 گھنٹے میں کم کیا، جو ATP کی کمی اور ROS46 میں اضافہ سے وابستہ تھا۔ ان مصنفین نے یہ بھی بتایا کہ TFAM اظہار 8.5 گھنٹے میں بڑھ گیا لیکن 22 گھنٹے میں بنیادی سطح پر واپس آگیا۔ اس کے برعکس، Kim et al. (2019) نے ظاہر کیا کہ SH-SY5Y خلیوں میں 4 H PPA تناؤ کے بعد TFAM mRNA اظہار میں نمایاں کمی واقع ہوئی ہے۔ تاہم، 72 گھنٹوں کے بعد، TFAM پروٹین ایکسپریشن میں نمایاں اضافہ ہوا اور mtDNA کاپی نمبر میں نمایاں اضافہ ہوا۔ اس طرح، مائٹوکونڈریل بایوجنسیس جینز کی تعداد میں کمی جس کا ہم نے 24 گھنٹوں کے بعد مشاہدہ کیا، اس امکان کو خارج نہیں کرتا کہ مائٹوکونڈریا کی تعداد میں اضافہ پہلے وقت کے پوائنٹس پر بائیو جینیسس کو چالو کرنے سے وابستہ ہے۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ پی پی اے 4 گھنٹے 30 منٹ پر SH-SY5Y خلیوں میں PGC-1α mRNA اور پروٹین کو نمایاں طور پر اپ گریڈ کرتا ہے، جبکہ پروپیونک ایسڈ 12 گھنٹے 39 منٹ پر PGC-1α کے ذریعے بچھڑے کے ہیپاٹوسائٹس میں مائٹوکونڈریل بائیو جینیسس کو بڑھاتا ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ، PGC-1α نہ صرف NRF1 اور TFAM کا براہ راست ٹرانسکرپشن ریگولیٹر ہے، بلکہ فیوژن اور فیوژن47 کو ریگولیٹ کرکے MFN2 اور DRP1 کی سرگرمی کو ریگولیٹ کرنے کے لیے بھی دکھایا گیا ہے۔ ایک ساتھ مل کر، یہ پی پی اے کے ذریعہ مائٹوکونڈریل معاوضہ کے ردعمل کو منظم کرنے والے میکانزم کے قریبی جوڑے کو نمایاں کرتا ہے۔ مزید یہ کہ ، ہمارا ڈیٹا پی پی اے تناؤ کے تحت بائیوجنسیس اور میٹابولزم کے ٹرانسکرپشن ریگولیشن کی نمایاں بے ضابطگی کی عکاسی کرتا ہے۔
STOML2، OPA1، MFN1، MFN2 اور DRP1 جین مائٹوکونڈریل فیوژن، فیوژن اور ڈائنامکس 37,48,49 کے مرکزی ریگولیٹرز میں سے ہیں۔ مائٹوکونڈریل ڈائنامکس میں بہت سے دوسرے جین شامل ہیں، تاہم، STOML2، OPA1 اور MFN2 کو پہلے ASD cohorts، 16 میں متفرق طور پر میتھلیٹ پایا گیا ہے اور کئی آزاد مطالعات نے مائٹوکونڈریل تناؤ 50,51 کے جواب میں ان ٹرانسکرپشن عوامل میں تبدیلی کی اطلاع دی ہے۔ 52. OPA1 اور STOML2 دونوں کا اظہار نمایاں طور پر 3 mM اور 5 mM PPA علاج سے کم ہوا (تصویر 3e، f)۔ OPA1 MFN1 اور 2 کے ساتھ براہ راست تعامل کے ذریعے مائٹوکونڈریل فیوژن کے کلاسیکی ریگولیٹرز میں سے ایک ہے اور کرسٹی ریموڈلنگ اور مائٹوکونڈریل مورفولوجی53 میں ایک کردار ادا کرتا ہے۔ مائٹوکونڈریل ڈائنامکس میں STOML2 کا قطعی کردار ابھی تک واضح نہیں ہے، لیکن شواہد بتاتے ہیں کہ یہ مائٹوکونڈریل فیوژن، بائیو جینیسس اور مائٹوفگی میں کردار ادا کرتا ہے۔
STOML2 mitochondrial respiratory coupling کو برقرار رکھنے اور respiratory chain complexes54,55 کی تشکیل میں ملوث ہے اور کینسر کے خلیوں کی میٹابولک خصوصیات کو گہرا طور پر تبدیل کرتا دکھایا گیا ہے۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ STOML2 BAN اور cardiolipin 55, 57, 58 کے ساتھ تعامل کے ذریعے مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت اور بایوجنسیس کو فروغ دیتا ہے۔ خاص طور پر، STOML2 کو MFN2 کے ساتھ براہ راست تعامل کرنے اور اسے مستحکم کرنے کی اطلاع دی گئی ہے اور OPA1 کی تنزلی53,61,62 کے ذمہ دار پروٹیز کو روک کر طویل OPA1 isoforms کو مستحکم کرنے میں بھی اہم کردار ادا کرتا ہے۔ پی پی اے کے رد عمل میں مشاہدہ کردہ STOML2 اظہار میں کمی ان فیوژن پروٹینوں کو ubiquitin- اور پروٹیزوم پر منحصر راستوں کے ذریعے انحطاط کا زیادہ حساس بنا سکتی ہے۔ اگرچہ PPA کے متحرک ردعمل میں STOML2 اور OPA1 کا قطعی کردار واضح نہیں ہے، لیکن ان فیوژن جینز کے اظہار میں کمی (شکل 3) فیوژن اور فیوژن کے درمیان توازن میں خلل ڈال سکتی ہے اور مائٹوکونڈریل سائز میں کمی کا باعث بن سکتی ہے (شکل 3)۔ 1)۔
دوسری طرف، OPA1 پروٹین کا اظہار 24 گھنٹے کے بعد بھی تبدیل نہیں ہوا، جبکہ MFN1، MFN2 یا DRP1 کے mRNA اور پروٹین کی سطح PPA علاج کے بعد نمایاں طور پر تبدیل نہیں ہوئی (تصویر 3g-i، تصویر 4)۔ یہ اس بات کی نشاندہی کرسکتا ہے کہ مائٹوکونڈریل فیوژن اور فیوژن میں شامل ان عوامل کے ضابطے میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی ہے۔ تاہم، یہ بات قابل غور ہے کہ ان چاروں جینوں میں سے ہر ایک کو پوسٹ ٹرانسکرپشنل ترمیم (PTMs) کے ذریعے بھی کنٹرول کیا جاتا ہے جو پروٹین کی سرگرمی کو کنٹرول کرتے ہیں۔ OPA1 میں آٹھ متبادل الگ الگ قسمیں ہیں جو کہ پروٹولیٹک طور پر مائٹوکونڈریا میں کلیو کی جاتی ہیں تاکہ دو الگ الگ آئسفارمز 63 پیدا ہو سکیں۔ طویل اور مختصر isoforms کے درمیان توازن بالآخر مائٹوکونڈریل فیوژن اور مائٹوکونڈریل نیٹ ورک 64 کی دیکھ بھال میں OPA1 کے کردار کا تعین کرتا ہے۔ DRP1 کی سرگرمی کیلشیم/calmodulin پر منحصر پروٹین kinase II (CaMKII) فاسفوریلیشن کے ذریعے ریگولیٹ ہوتی ہے، جبکہ DRP1 انحطاط کو ہر جگہ اور SUMOylation65 کے ذریعے منظم کیا جاتا ہے۔ آخر میں، DRP1 اور MFN1/2 دونوں GTPases ہیں، لہذا سرگرمی مائٹوکونڈریا 66 میں GTP کی پیداوار کی شرح سے متاثر ہو سکتی ہے۔ لہذا، اگرچہ ان پروٹینوں کا اظہار مستقل رہتا ہے، یہ غیر تبدیل شدہ پروٹین کی سرگرمی یا لوکلائزیشن 67,68 کی عکاسی نہیں کرسکتا ہے۔ درحقیقت، موجودہ PTM پروٹین کے ذخیرے اکثر شدید تناؤ کے ردعمل میں ثالثی کے لیے ذمہ دار دفاع کی پہلی لائن کے طور پر کام کرتے ہیں۔ ہمارے ماڈل میں اعتدال پسند میٹابولک تناؤ کی موجودگی میں، یہ امکان ہے کہ پی ٹی ایم ایم آر این اے یا پروٹین کی سطح پر ان جینز کی اضافی ایکٹیویشن کی ضرورت کے بغیر مائٹوکونڈریل سالمیت کو کافی حد تک بحال کرنے کے لیے فیوژن اور فِشن پروٹین کی بڑھتی ہوئی سرگرمی کو فروغ دیتا ہے۔
ایک ساتھ مل کر، مندرجہ بالا اعداد و شمار مائٹوکونڈریل مورفولوجی کے پیچیدہ اور وقت پر منحصر ضابطے اور ان میکانزم کو واضح کرنے کے چیلنجوں کو اجاگر کرتے ہیں۔ جین کے اظہار کا مطالعہ کرنے کے لیے، پہلے راستے میں مخصوص ہدف والے جینوں کی شناخت کرنا ضروری ہے۔ تاہم، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ ایک ہی راستے میں جین ایک ہی کشیدگی کا ایک ہی طریقے سے جواب نہیں دیتے ہیں. درحقیقت، پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ ایک ہی راستے میں مختلف جین مختلف وقتی ردعمل پروفائلز 30,46 کی نمائش کر سکتے ہیں۔ اس کے علاوہ، نقل کے بعد کے پیچیدہ میکانزم موجود ہیں جو نقل اور جین کے فعل کے درمیان تعلق میں خلل ڈالتے ہیں۔ پروٹومک اسٹڈیز PTMs اور پروٹین فنکشن کے اثرات کے بارے میں بصیرت فراہم کر سکتے ہیں، لیکن وہ چیلنجز بھی پیش کرتے ہیں جن میں کم تھرو پٹ طریقے، زیادہ سگنل ٹو شور کا تناسب، اور خراب ریزولوشن شامل ہیں۔
اس تناظر میں، ٹی ای ایم اور ایم ای ایل کا استعمال کرتے ہوئے مائٹوکونڈریل مورفولوجی کا مطالعہ کرنے سے مائٹوکونڈریل ڈائنامکس اور فنکشن کے درمیان تعلق اور یہ بیماری کو کیسے متاثر کرتا ہے کے بارے میں بنیادی سوالات کو حل کرنے کی بڑی صلاحیت ہے۔ سب سے اہم بات یہ ہے کہ، TEM مائٹوکونڈریل dysfunction اور dynamics51 کے متضاد اختتامی نقطہ کے طور پر مائٹوکونڈریل مورفولوجی کی پیمائش کے لیے براہ راست طریقہ فراہم کرتا ہے۔ MEL تین جہتی سیلولر ماحول میں فیوژن اور فیوژن کے واقعات کو دیکھنے کے لیے ایک براہ راست طریقہ بھی فراہم کرتا ہے، جس سے جین کے اظہار میں تبدیلیوں کی عدم موجودگی میں بھی متحرک مائٹوکونڈریل ریموڈلنگ کی مقدار درست کی جا سکتی ہے۔ یہاں ہم ثانوی مائٹوکونڈریل بیماریوں میں مائٹوکونڈریل امیجنگ تکنیک کی افادیت کو اجاگر کرتے ہیں۔ یہ بیماریاں عام طور پر دائمی ہلکے میٹابولک تناؤ کی خصوصیت رکھتی ہیں جس کی خصوصیت مائٹوکونڈریل نیٹ ورکس کی ٹھیک ٹھیک دوبارہ تشکیل دینے کی بجائے شدید مائٹوکونڈریل نقصان سے ہوتی ہے۔ تاہم، دائمی تناؤ کے تحت مائٹوسس کو برقرار رکھنے کے لیے درکار مائٹوکونڈریل معاوضے کے گہرے فعال نتائج ہوتے ہیں۔ نیورو سائنس کے تناظر میں، ان معاوضہ کے طریقہ کار کی بہتر تفہیم مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن سے وابستہ پیلیوٹروپک نیوروپیتھولوجی کے بارے میں اہم معلومات فراہم کر سکتی ہے۔
بالآخر، ہمارا ڈیٹا جین کے اظہار، پروٹین میں ترمیم، اور نیورونل مائٹوکونڈریل حرکیات کو کنٹرول کرنے والی پروٹین کی سرگرمی کے درمیان پیچیدہ تعاملات کے عملی نتائج کو سمجھنے کے لیے امیجنگ تکنیک کی افادیت کو اجاگر کرتا ہے۔ اے ایس ڈی کے مائٹوکونڈریل جزو کی بصیرت حاصل کرنے کے لئے ہم نے نیورونل سیل ماڈل میں مائٹوکونڈریل dysfunction کے ماڈل کے لئے PPA کا استعمال کیا۔ پی پی اے کے ساتھ علاج کیے گئے SH-SY5Y خلیوں نے مائٹوکونڈریل مورفولوجی میں تبدیلیاں ظاہر کیں: مائٹوکونڈریا چھوٹا اور گول ہو گیا، اور TEM کے مشاہدہ پر کرسٹے کی اچھی طرح سے تعریف نہیں کی گئی۔ MEL تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ ہلکے میٹابولک تناؤ کے جواب میں مائٹوکونڈریل نیٹ ورک کو برقرار رکھنے کے لیے یہ تبدیلیاں فیوژن اور فیوژن کے واقعات میں اضافے کے ساتھ ساتھ ہوتی ہیں۔ مزید یہ کہ پی پی اے مائٹوکونڈریل میٹابولزم اور ہومیوسٹاسس کے ٹرانسکرپشن ریگولیشن میں نمایاں طور پر خلل ڈالتا ہے۔ ہم نے cMYC، NRF1، TFAM، STOML2، اور OPA1 کی شناخت پی پی اے کے تناؤ سے متاثر ہونے والے کلیدی مائٹوکونڈریل ریگولیٹرز کے طور پر کی ہے اور مائٹوکونڈریل مورفولوجی اور فنکشن میں پی پی اے کی حوصلہ افزائی کی تبدیلیوں میں ثالثی کا کردار ادا کر سکتے ہیں۔ جین کے اظہار اور پروٹین کی سرگرمی، لوکلائزیشن، اور ترجمہ کے بعد کی تبدیلیوں میں پی پی اے کی حوصلہ افزائی وقتی تبدیلیوں کو بہتر طور پر نمایاں کرنے کے لیے مستقبل کے مطالعے کی ضرورت ہے۔ ہمارا ڈیٹا مائٹوکونڈریل تناؤ کے ردعمل میں ثالثی کرنے والے ریگولیٹری میکانزم کی پیچیدگی اور باہمی انحصار کو اجاگر کرتا ہے اور مزید ٹارگٹ میکانسٹک اسٹڈیز کے لیے TEM اور دیگر امیجنگ تکنیک کی افادیت کو ظاہر کرتا ہے۔
SH-SY5Y سیل لائن (ECACC, 94030304-1VL) سگما-الڈرچ سے خریدی گئی تھی۔ SH-SY5Y خلیات Dulbecco کے ترمیم شدہ Eagle's medium/F-12 نیوٹرینٹ مکسچر (DMEM/F-12) اور L-glutamine (SC09411, ScienCell) میں 25 cm2 فلاسکس میں اگائے گئے تھے جن کی تکمیل 20% fetal bovsine (060BS) ThermoFisher Scientific) اور 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML، سگما-Aldrich) 37 °C پر، 5% CO2۔ خلیوں کو 0.05٪ ٹرپسن-ای ڈی ٹی اے (15400054، تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے 80٪ سنگم پر ذیلی ثقافت کیا گیا تھا، 300 جی پر سینٹرفیوج کیا گیا تھا اور تقریبا 7 × 105 سیلز/ملی کی کثافت پر چڑھایا گیا تھا۔ تمام تجربات 19-22 کے حصئوں کے درمیان غیر متفاوت SH-SY5Y خلیوں پر کیے گئے تھے۔ PPA کا انتظام NaP کے طور پر کیا جاتا ہے۔ NaP پاؤڈر (CAS نمبر 137-40-6، کیمیائی فارمولا C3H5NaO2، P5436-100G، سگما-Aldrich) کو گرم ملی کیو پانی میں 1 M کے ارتکاز میں حل کریں اور 4 °C پر محفوظ کریں۔ علاج کے دن، اس محلول کو 1 ایم پی پی اے سے 3 ایم ایم اور 5 ایم ایم پی پی اے کے ساتھ سیرم فری میڈیم (ڈی ایم ای ایم/ ایف-12 ایل گلوٹامین کے ساتھ) میں پتلا کریں۔ تمام تجربات کے علاج کی تعداد میں کوئی پی پی اے (0 ایم ایم، کنٹرول)، 3 ایم ایم، اور 5 ایم ایم پی پی اے نہیں تھا۔ تجربات کم از کم تین حیاتیاتی نقلوں میں کیے گئے۔
SH-SY5Y خلیوں کو 25 cm5 فلاسکس میں 5.5 × 105 خلیات / ملی لیٹر کی شرح سے سیڈ کیا گیا اور 24 گھنٹے تک بڑھایا گیا۔ پی پی اے کا علاج انکیوبیشن کے 24 گھنٹے سے پہلے فلاسک میں شامل کیا گیا تھا۔ عام ممالیہ ٹشو سب کلچر پروٹوکول (اوپر بیان کیا گیا ہے) کے بعد سیل چھریاں جمع کریں۔ سیل گولی کو 100 µl 2.5% glutaraldehyde، 1× PBS میں دوبارہ بھیجیں اور پروسیسنگ تک 4 °C پر اسٹور کریں۔ SH-SY5Y خلیوں کو مختصر طور پر خلیات کو گولی مارنے اور 2.5٪ گلوٹرالڈہائڈ، 1 × PBS حل کو ہٹانے کے لئے سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔ تلچھٹ کو 4٪ ایگروز جیل میں آست پانی میں تیار کریں (ایگروز اور تلچھٹ کے حجم کا تناسب 1:1 ہے)۔ ایگروز کے ٹکڑوں کو فلیٹ پلیٹوں پر گرڈ پر رکھا گیا تھا اور ہائی پریشر منجمد ہونے سے پہلے 1-ہیکساڈیسین کے ساتھ لیپت کیا گیا تھا۔ نمونے 100% خشک ایسیٹون میں -90 ° C پر 24 گھنٹے کے لیے منجمد کر دیے گئے تھے۔ اس کے بعد درجہ حرارت کو -80 ° C تک بڑھایا گیا اور 1% اوسمیم ٹیٹرو آکسائیڈ اور 0.1% گلوٹرالڈہائیڈ کا محلول شامل کیا گیا۔ نمونے -80 ° C پر 24 گھنٹے کے لیے محفوظ کیے گئے تھے۔ اس کے بعد، درجہ حرارت کو بتدریج کئی دنوں میں کمرے کے درجہ حرارت تک بڑھایا گیا: 24 گھنٹے کے لیے – 80 ° C سے – 50 ° C تک، 24 گھنٹے کے لئے – 30 ° C تک، 24 گھنٹے کے لئے – 10 ° C تک اور آخر میں کمرے کے درجہ حرارت تک۔ درجہ حرارت
کرائیوجینک تیاری کے بعد، نمونوں کو رال سے رنگین کیا گیا اور الٹراتھائن سیکشنز (∼100 nm) کو Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems) کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا۔ حصوں کو 2٪ یورینیل ایسیٹیٹ اور لیڈ سائٹریٹ سے داغ دیا گیا تھا۔ FEI Tecnai 20 ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکروسکوپ (ThermoFisher (سابقہ ​​FEI)، Eindhoven، The Netherlands) کا استعمال کرتے ہوئے نمونے دیکھے گئے جو 200 kV (Lab6 ٹرانسمیٹر) اور ایک Gatan CCD کیمرے (Gatan، UK) سے لیس ہے جو Tridiem انرجی فلٹر سے لیس ہے۔
ہر تکنیکی نقل میں، کل 266 امیجز کے لیے کم از کم 24 سنگل سیل امیجز حاصل کیے گئے تھے۔ تمام امیجز کا تجزیہ ریجن آف انٹرسٹ (ROI) میکرو اور Mitochondria میکرو کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ مائٹوکونڈریل میکرو شائع شدہ طریقوں 17,31,32 پر مبنی ہے اور Fiji/ImageJ69 میں TEM تصاویر کی نیم خودکار بیچ پروسیسنگ کی اجازت دیتا ہے۔ مختصراً: رولنگ بال بیک گراؤنڈ گھٹاؤ (60 پکسل رداس) اور ایک FFT بینڈ پاس فلٹر (بالترتیب 60 اور 8 پکسل اوپری اور نچلی حدوں کا استعمال کرتے ہوئے) اور 5% کی واقفیت رواداری کے ساتھ عمودی لائن دبانے کا استعمال کرتے ہوئے تصویر کو الٹا اور الٹا جاتا ہے۔ پروسیس شدہ تصویر کو زیادہ سے زیادہ اینٹروپی الگورتھم کا استعمال کرتے ہوئے خود بخود حد بندی کی جاتی ہے اور ایک بائنری ماسک تیار کیا جاتا ہے۔ خام TEM امیجز میں دستی طور پر منتخب کردہ ROIs کے ساتھ وابستہ امیج ریجنز نکالے گئے، مائٹوکونڈریا کی خصوصیت اور پلازما میمبرین اور دیگر ہائی کنٹراسٹ والے علاقوں کو چھوڑ کر۔ ہر ایک نکالے گئے ROI کے لیے، 600 پکسلز سے بڑے بائنری پارٹیکلز کا تجزیہ کیا گیا، اور فجی/ImageJ کے بلٹ ان پیمائشی فنکشنز کا استعمال کرتے ہوئے پارٹیکل ایریا، پریمیٹر، بڑے اور چھوٹے محور، فیریٹ قطر، گول پن، اور سرکلرٹی کی پیمائش کی گئی۔ Merrill, Flippo, and Strack (2017) کے بعد، رقبہ 2، پارٹیکل اسپیکٹ ریشو (بڑا سے معمولی محور کا تناسب)، اور شکل کا عنصر (FF) ان ڈیٹا سے شمار کیا گیا، جہاں FF = perimeter 2/4pi x رقبہ۔ پیرامیٹرک فارمولے کی تعریف Merrill, Flippo, and Strack (2017) میں مل سکتی ہے۔ ذکر کردہ میکرو GitHub پر دستیاب ہیں (ڈیٹا دستیابی کا بیان دیکھیں)۔ اوسطاً، تقریباً 5,600 ذرات کا تجزیہ فی پی پی اے علاج کیا گیا، کل تقریباً 17,000 ذرات کے لیے (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔
SH-SH5Y خلیات کو 8-چیمبر کلچر ڈشز (تھرمو فشر، #155411) میں راتوں رات چپکنے کی اجازت دینے کے لیے رکھا گیا تھا اور پھر TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) اور Hoechst 33342 1:200 (Sigma, H4200) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ رنگنے 10 منٹ کے ماحول میں 405 nm اور 561 nm لیزرز کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر حاصل کی گئیں، اور خام تصاویر کو 10 امیج مائیکرو گرافس پر مشتمل زیڈ اسٹیک کے طور پر حاصل کیا گیا جس میں 12 بعد کے ٹائم پوائنٹس پر تصویری فریموں کے درمیان 0.2 μm کے az سٹیپ کے ساتھ۔ کارل زیس LSM780 ELYRA PS.1 سپر ریزولوشن پلیٹ فارم (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 لینس کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر جمع کی گئیں۔ امیج جے میں پہلے سے بیان کردہ پائپ لائن اور امیج جے پلگ ان کا استعمال کرتے ہوئے فیوژن اور فیوژن ایونٹس، مائٹوکونڈریل ڈھانچے کی اوسط تعداد، اور فی سیل33 اوسط مائٹوکونڈریل حجم کی پیمائش کے لیے امیجز کا تجزیہ کیا گیا۔ MEL میکرو GitHub پر دستیاب ہیں (ڈیٹا دستیابی کا بیان دیکھیں)۔
SH-SY5Y خلیوں کو علاج سے پہلے 24 گھنٹے تک 0.3 × 106 خلیات/mL کی کثافت پر چھ کنویں پلیٹوں میں اگایا گیا تھا۔ RNA کو Quick-RNA™ Miniprep پروٹوکول (ZR R1055, Zymo Research) کا استعمال کرتے ہوئے معمولی ترمیم کے ساتھ نکالا گیا تھا: ہٹانے سے پہلے ہر کنویں میں 300 μl RNA lysis بفر شامل کریں اور ہر نمونے کو 30 μl DNase/RNase elution کے ساتھ حتمی مرحلے کے طور پر لیز کریں۔ - مفت پانی. NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer کا استعمال کرتے ہوئے تمام نمونوں کی مقدار اور معیار کی جانچ کی گئی۔ سیل لائسیٹس سے کل پروٹین 200 μl RIPA lysis بفر کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا تھا، اور بریڈ فورڈ پروٹین assay70 کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی مقدار کو درست کیا گیا تھا۔
سی ڈی این اے کی ترکیب Tetro™ cDNA سنتھیسس کٹ (BIO-65043، Meridian Bioscience) کا استعمال کرتے ہوئے کچھ ترمیم کے ساتھ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق کی گئی۔ cDNA کل RNA کے 0.7 سے 1 μg کا استعمال کرتے ہوئے 20-μl رد عمل میں ترکیب کیا گیا تھا۔ پرائمر کا انتخاب پہلے سے شائع شدہ پیپرز 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (ٹیبل S1) سے کیا گیا تھا اور ساتھ والی تحقیقات کو انٹیگریٹڈ ڈی این اے ٹیکنالوجیز کے پرائمر کویسٹ ٹول کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیا گیا تھا۔ دلچسپی کے تمام جینوں کو جوہری B2M جین میں معمول بنایا گیا تھا۔ STOML2، NRF1، NFE2L2، TFAM، cMYC اور OPA1 کے جین کا اظہار RT-qPCR سے ماپا گیا۔ ماسٹر مکس میں LUNA Taq پولیمریز (M3003L، New England Biolabs)، 10 μM فارورڈ اور ریورس پرائمر، cDNA، اور PCR- گریڈ کا پانی شامل ہے تاکہ ہر رد عمل کے لیے حتمی حجم 10 μL حاصل کیا جا سکے۔ تقسیم اور فیوژن جین (DRP1، MFN1/2) کا اظہار TaqMan ملٹی پلیکس اسسیس کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق معمولی ترمیم کے ساتھ استعمال کیا گیا۔ ملٹی پلیکس RT-qPCR ماسٹر مکس میں 1X LUNA Taq پولیمریز، 10 μM فارورڈ اور ریورس پرائمر، 10 μM تحقیقات، cDNA، اور PCR-گریڈ واٹر شامل ہیں، جس کے نتیجے میں ہر ردعمل کے لیے حتمی حجم 20 μL ہوتا ہے۔ RT-qPCR کو Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG — سیریل نمبر: R0618110) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ سائیکلنگ کے حالات ٹیبل S1 میں دکھائے گئے ہیں۔ تمام سی ڈی این اے نمونوں کو سہ رخی میں بڑھا دیا گیا تھا اور دس گنا کم کرنے کی ایک سیریز کا استعمال کرتے ہوئے ایک معیاری وکر تیار کیا گیا تھا۔ اعداد و شمار کی تولیدی صلاحیت 30,72 کو یقینی بنانے کے لیے سائیکل تھریشولڈ معیاری انحراف (Ct) > 0.5 والے سہ رخی نمونوں میں آؤٹ لیرز کو تجزیہ سے ہٹا دیا گیا۔ متعلقہ جین اظہار کا حساب 2-ΔΔCt79 طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔
پروٹین کے نمونے (60 μg) کو 2:1 کے تناسب سے لیملی لوڈنگ بفر کے ساتھ ملایا گیا اور 12٪ بے رنگ پروٹین جیل (Bio-Rad #1610184) پر چلایا گیا۔ ٹرانس بلاٹ ٹربو سسٹم (#170-4155، بائیو ریڈ) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کو پی وی ڈی ایف (پولی وینیلائیڈین فلورائیڈ) جھلی (#170-84156، بائیو ریڈ) میں منتقل کیا گیا۔ جھلی کو 48 گھنٹوں کے لیے مناسب پرائمری اینٹی باڈیز (OPA1, MFN1, MFN2, اور DRP1) (1:1000 پتلا) کے ساتھ مسدود کیا گیا اور اس کے بعد 1 گھنٹے کے لیے سیکنڈری اینٹی باڈیز (1:10,000) کے ساتھ انکیوبیشن کی گئی۔ اس کے بعد کلیریٹی ویسٹرن ای سی ایل سبسٹریٹ (#170-5061، بائیو ریڈ) کا استعمال کرتے ہوئے جھلیوں کی تصویر کشی کی گئی اور بائیو ریڈ کیمی ڈوک ایم پی سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے ریکارڈ کیا گیا۔ امیج لیب ورژن 6.1 مغربی بلٹ تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ اصل جیل اور دھبہ کو شکل S1 میں دکھایا گیا ہے۔ اینٹی باڈی کی معلومات ٹیبل S2 میں فراہم کی گئی ہیں۔
ڈیٹا سیٹ کم از کم تین آزاد نمونوں کے اوسط (SEM) کی اوسط اور معیاری غلطی کے طور پر پیش کیے جاتے ہیں۔ Gaussian ڈسٹری بیوشن اور مساوی معیاری انحراف اور تجزیوں کو آگے بڑھانے سے پہلے Shapiro-Wilks ٹیسٹ (جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا گیا ہو) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا سیٹس کی جانچ کی گئی۔ Fisher's MEL LSD (p <0.05)، یک طرفہ انووا (علاج بمقابلہ کنٹرول کا مطلب)، اور اہمیت کا تعین کرنے کے لیے Dunnett کے متعدد موازنہ ٹیسٹ (p <0.05) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا سیٹ کا تجزیہ کرنے کے علاوہ۔ اہم p اقدار کو گراف میں *p <0.05، **p <0.01، ***p <0.001، ****p <0.0001 کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ تمام شماریاتی تجزیے اور گراف گراف پیڈ پرزم 9.4.0 کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے اور تیار کیے گئے۔
TEM تصویری تجزیہ کے لیے Fiji/ImageJ میکرو GitHub پر عوامی طور پر دستیاب ہیں: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro۔ Mitochondrial Event Locator (MEL) میکرو GitHub پر عوامی طور پر دستیاب ہے: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin۔
میلیانا اے، دیوی این ایم اور وجیا اے مائٹوکونڈریا: میٹابولزم، ہومیوسٹاسس، تناؤ، عمر رسیدگی اور ایپی جینیٹکس کے ماسٹر ریگولیٹرز۔ انڈونیشین۔ بائیو میڈیکل سائنس۔ J. 13، 221–241 (2021)۔
بین شاچر، ڈی. شیزوفرینیا میں کثیر جہتی مائٹوکونڈریل dysfunction، پیچیدہ I ایک ممکنہ پیتھولوجیکل ہدف کے طور پر۔ شقاق دماغی۔ وسائل 187، 3–10 (2017)۔
بوس، اے اور بیل، پارکنسنز کی بیماری میں ایم ایف مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن۔ J. نیورو کیمسٹری۔ 139، 216–231 (2016)۔
شرما VK، سنگھ TG اور مہتا V. اسٹریسڈ مائٹوکونڈریا: الزائمر کی بیماری میں حملے کے اہداف۔ مائٹوکونڈریا 59، 48–57 (2021)۔
بیلینگور پی، ڈوارٹے جے ایم این، شوک پی ایف اور فریرا جی کے مائٹوکونڈریا اور دماغ: بایو اینرجیٹکس اور مزید۔ نیوروٹوکسنز۔ وسائل 36، 219–238 (2019)۔
رنگاراجو، وی وغیرہ۔ پلیوٹروپک مائٹوکونڈریا: نیورونل ڈویلپمنٹ اور بیماری پر مائٹوکونڈریا کا اثر۔ J. نیورو سائنس۔ 39، 8200–8208 (2019)۔
Cardaño-Ramos، C. اور Morais، VA Mitochondrial biogenesis in neurons: کیسے اور کہاں۔ بین الاقوامیت جے موہر سائنس 22، 13059 (2021)۔
یو، آر، لینڈہل، یو، نیسٹر، ایم اور ژاؤ، جے ریگولیشن آف میمالین مائٹوکونڈریل ڈائنامکس: مواقع اور چیلنجز۔ سامنے endocrine (لوزان) 11، 374 (2020)۔
کھچو، ایم اور سلیک، آر ایس مائٹوکونڈریل ڈائنامکس ان دی ریگولیشن آف نیوروجنسیس: نشوونما سے بالغ دماغ تک۔ ترقی متحرک 247، 47–53 (2018)۔