موجودہ *موجودہ پتہ: کولون 50931، جرمنی، کولون ایکسیلنس کلسٹر ریسرچ آن سیلولر اسٹریس ریسپانس ان ایجنگ ریلٹ ڈیزیز (CECAD)۔
مائٹوکونڈریل بیماریوں کی نیوروڈیجنریشن کو ناقابل واپسی سمجھا جاتا ہے کیونکہ نیوران کی میٹابولک پلاسٹکٹی محدود ہے، لیکن جسم میں نیورونل میٹابولزم کی سیل خودمختاری پر مائٹوکونڈریل dysfunction کے اثر کو اچھی طرح سے سمجھا نہیں جاتا ہے۔ یہاں، ہم Purkinje نیوران کے سیل سے متعلق پروٹوم کو متعارف کراتے ہیں جس میں ترقی پسند OXPHOS کی کمی ہوتی ہے جس کی وجہ مائٹوکونڈریل فیوژن ڈائنامکس میں خلل پڑتا ہے۔ ہم نے پایا کہ مائٹوکونڈریل dysfunction نے پروٹومکس کے میدان میں ایک گہری تبدیلی کو جنم دیا، جو بالآخر سیل کی موت سے پہلے عین میٹابولک پروگراموں کی ترتیب وار ایکٹیویشن کا باعث بنا۔ غیر متوقع طور پر، ہم نے پائروویٹ کاربوکسیلیس (PCx) اور دیگر اینٹی ایجنگ انزائمز کی واضح شمولیت کا تعین کیا جو TCA سائیکل کے انٹرمیڈیٹس کو پورا کرتے ہیں۔ پی سی ایکس کی روک تھام نے آکسیڈیٹیو تناؤ اور نیوروڈیجنریشن کو بڑھا دیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ اوکس پی ایچ او ایس کی کمی والے نیوران میں ایتھروسکلروسیس کا حفاظتی اثر ہوتا ہے۔ ختمی طور پر انحطاط شدہ نیورونز میں مائٹوکونڈریل فیوژن کی بحالی ان میٹابولک خصوصیات کو مکمل طور پر تبدیل کر دیتی ہے، اس طرح خلیوں کی موت کو روکتا ہے۔ ہماری تلاشیں پہلے سے نامعلوم راستوں کی نشاندہی کرتی ہیں جو مائٹوکونڈریل dysfunction کو لچک فراہم کرتے ہیں اور یہ ظاہر کرتے ہیں کہ بیماری کے آخری مراحل میں بھی نیوروڈیجنریشن کو الٹ دیا جا سکتا ہے۔
نیورونل انرجی میٹابولزم کو برقرار رکھنے میں مائٹوکونڈریا کے مرکزی کردار پر انسانی مائٹوکونڈریل بیماریوں سے وابستہ وسیع اعصابی علامات پر زور دیا جاتا ہے۔ ان میں سے زیادہ تر بیماریاں جین کی تبدیلیوں کی وجہ سے ہوتی ہیں جو مائٹوکونڈریل جین ایکسپریشن (1، 2) یا مائٹوکونڈریل ڈائنامکس سے متعلق جین کی تباہی کو منظم کرتی ہیں، جو بالواسطہ طور پر مائٹوکونڈریل ڈی این اے (mtDNA) (3، 4) کے استحکام کو متاثر کرتی ہیں۔ جانوروں کے ماڈلز میں کام سے یہ ظاہر ہوا ہے کہ ارد گرد کے بافتوں میں مائٹوکونڈریل dysfunction کے جواب میں، قدامت پسند میٹابولک راستے (5-7) کو چالو کیا جا سکتا ہے، جو ان پیچیدہ بیماریوں کے روگجنن کے بارے میں گہرائی سے سمجھنے کے لیے اہم معلومات فراہم کرتا ہے۔ اس کے بالکل برعکس، دماغ کے مائٹوکونڈریل اڈینوسین ٹرائی فاسفیٹ (اے ٹی پی) کی پیداوار کی عام ناکامی کی وجہ سے ہونے والی مخصوص سیل اقسام کی میٹابولک تبدیلیوں کے بارے میں ہماری سمجھ بنیادی ہے (8)، علاج کے اہداف کی نشاندہی کرنے کی ضرورت پر زور دیتی ہے جو بیماری کو روکنے یا روکنے کے لیے استعمال کیے جاسکتے ہیں۔ نیوروڈیجنریشن کو روکیں (9)۔ معلومات کی کمی یہ حقیقت ہے کہ عصبی خلیات کو وسیع پیمانے پر ارد گرد کے ٹشوز کی سیل اقسام کے مقابلے میں بہت محدود میٹابولک لچک سمجھا جاتا ہے (10)۔ یہ دیکھتے ہوئے کہ یہ خلیے Synaptic ٹرانسمیشن کو فروغ دینے اور چوٹ اور بیماری کے حالات کا جواب دینے کے لیے نیوران کو میٹابولائٹس کی فراہمی کو مربوط کرنے میں مرکزی کردار ادا کرتے ہیں، دماغی بافتوں کی مشکل حالات کے مطابق سیل میٹابولزم کو ڈھالنے کی صلاحیت تقریباً glial خلیات (11-14) تک محدود ہے۔ اس کے علاوہ، دماغی بافتوں کی موروثی سیلولر ہیٹروجنیٹی بڑی حد تک میٹابولک تبدیلیوں کے مطالعہ میں رکاوٹ بنتی ہے جو مخصوص نیورونل سب گروپس میں ہوتی ہیں۔ نتیجے کے طور پر، نیورانوں میں مائٹوکونڈریل dysfunction کے عین مطابق سیلولر اور میٹابولک نتائج کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔
mitochondrial dysfunction کے میٹابولک نتائج کو سمجھنے کے لیے، ہم نے Purkinje neurons (PNs) کو نیوروڈیجنریشن کے مختلف مراحل میں الگ تھلگ کیا جو مائٹوکونڈریل بیرونی جھلی فیوژن (Mfn2) کی تباہی کی وجہ سے ہوتا ہے۔ اگرچہ انسانوں میں Mfn2 اتپریورتنوں کا تعلق موروثی موٹر سینسری نیوروپتی کی ایک شکل سے ہے جسے Charcot-Marie-Tooth type 2A (15) کہا جاتا ہے، لیکن چوہوں میں Mfn2 کی مشروط تباہی آکسیڈیشن فاسفوریلیشن (OXPHOS) طریقہ کی ایک اچھی طرح سے تسلیم شدہ شمولیت ہے۔ مختلف نیورونل ذیلی قسمیں (16-19) اور اس کے نتیجے میں نیوروڈیجینریٹیو فینوٹائپ ترقی پسند اعصابی علامات کے ساتھ ہوتے ہیں، جیسے تحریک کی خرابی (18، 19) یا سیریبلر ایٹیکسیا (16)۔ لیبل فری مقداری (LFQ) پروٹومکس، میٹابولومکس، امیجنگ، اور وائرولوجیکل طریقوں کے امتزاج کا استعمال کرتے ہوئے، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ ترقی پسند نیوروڈیجنریشن پائروویٹ کاربوکسیلیس (PCx) اور Vivo میں PNs کے arteriosclerosis میں ملوث دیگر عوامل کو مضبوطی سے اکساتی ہے۔ اس تلاش کی مطابقت کی تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے خاص طور پر Mfn2 کی کمی والے PNs میں PCx کے اظہار کو نیچے سے منظم کیا، اور پتہ چلا کہ اس آپریشن نے آکسیڈیٹیو تناؤ کو بڑھایا اور نیوروڈیجنریشن کو تیز کیا، اس طرح یہ ثابت ہوتا ہے کہ azoospermia سیل کی موت کو میٹابولک موافقت فراہم کرتا ہے۔ MFN2 کا شدید اظہار OXPHOS کی شدید کمی، mitochondrial DNA کے بڑے پیمانے پر استعمال، اور بظاہر ٹوٹے ہوئے mitochondrial نیٹ ورک کے ساتھ ٹرمینل انحطاط PN کو مکمل طور پر بچا سکتا ہے، جو مزید اس بات پر زور دیتا ہے کہ نیوروڈیجنریشن کی یہ شکل سیل کی موت سے پہلے بیماری کے جدید مرحلے میں بھی ٹھیک ہو سکتی ہے۔
Mfn2 ناک آؤٹ PNs میں مائٹوکونڈریا کا تصور کرنے کے لیے، ہم نے ماؤس سٹرین کا استعمال کیا جو کر پر منحصر مائٹوکونڈریا کو پیلے رنگ کے فلوروسینٹ پروٹین (YFP) (mtYFP) (20) Cre اظہار کو نشانہ بنانے کی اجازت دیتا ہے اور Vivo میں مائٹوکونڈریل مورفولوجی کو چیک کیا۔ ہم نے پایا کہ PNs میں Mfn2 جین کی تباہی مائٹوکونڈریل نیٹ ورک (فگر S1A) کی بتدریج تقسیم کا باعث بنے گی، اور ابتدائی تبدیلی 3 ہفتوں کی عمر میں پائی گئی۔ اس کے برعکس، PN سیل پرت کا کافی انحطاط، جیسا کہ Calbindin immunostaining کے نقصان سے ظاہر ہوتا ہے، 12 ہفتوں کی عمر تک شروع نہیں ہوا تھا (شکل 1، A اور B)۔ مائٹوکونڈریل مورفولوجی میں ابتدائی تبدیلیوں اور نیورونل موت کے مرئی آغاز کے درمیان وقت کی مماثلت نے ہمیں خلیے کی موت سے پہلے مائٹوکونڈریل dysfunction سے پیدا ہونے والی میٹابولک تبدیلیوں کی تحقیقات کرنے پر آمادہ کیا۔ ہم نے YFP (YFP+) - اظہار کرنے والے PN (Figure 1C) کو الگ تھلگ کرنے کے لیے فلوروسینس ایکٹیویٹڈ سیل چھانٹی (FACS) پر مبنی حکمت عملی تیار کی ہے، اور کنٹرول چوہوں میں (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre)، اس کے بعد SCTRL1 (SCTRLB) کہا جاتا ہے۔ YFP سگنل کی نسبتہ شدت کی بنیاد پر گیٹنگ کی حکمت عملی کی اصلاح ہمیں PNs کے YFP+ باڈی (YFPhigh) کو نان PNs ​​(YFPneg) (Figure S1B) یا پوٹیٹیو فلوروسینٹ ایکسون/ڈینڈریٹک ٹکڑوں (YFPlow؛ مائیکروسکوپ، مائیکروسکوپ کے ذریعے بائیں طرف سے تصدیق شدہ)، PNs کے YFP+ باڈی (YFPhigh) کو پاک کرنے کی اجازت دیتی ہے۔ S1D، دائیں)۔ درجہ بند آبادی کی شناخت کی تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے LFQ پروٹومکس اور پھر پرنسپل اجزاء کا تجزیہ کیا، اور پتہ چلا کہ YFPhigh اور YFPneg خلیات (فگر S1C) کے درمیان واضح علیحدگی ہے۔ YFPhigh خلیات نے معلوم PNs مارکر (یعنی Calb1, Pcp2, Grid2 اور Itpr3) (21, 22) کی خالص افزودگی ظاہر کی، لیکن پروٹین کی افزودگی عام طور پر نیوران یا دیگر خلیوں کی اقسام میں ظاہر نہیں کی گئی (شکل 1D))۔ آزاد تجربوں میں جمع کیے گئے درجہ بند YFPhigh خلیات میں نمونوں کے درمیان موازنہ نے ایک ارتباطی گتانک> 0.9 ظاہر کیا، جو حیاتیاتی نقلوں (شکل S1E) کے درمیان اچھی تولیدی صلاحیت کو ظاہر کرتا ہے۔ خلاصہ طور پر، ان اعداد و شمار نے ممکن PN کی شدید اور مخصوص تنہائی کے لیے ہمارے منصوبے کی توثیق کی۔ چونکہ L7-cre ڈرائیور سسٹم نے ڈیلیوری (23) کے بعد پہلے ہفتے میں موزیک کی بحالی کی حوصلہ افزائی کی ہے، لہذا ہم نے CTRL اور مشروط (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) سے چوہوں کو اکٹھا کرنا شروع کیا۔ دوبارہ ملاپ مکمل ہونے کے بعد، اسے 4 ہفتے کی عمر میں Mfn2cKO کہا جاتا ہے۔ اختتامی نقطہ کے طور پر، ہم نے 8 ہفتوں کی عمر کا انتخاب کیا جب PN پرت واضح مائٹوکونڈریل فریگمنٹیشن (شکل 1B اور شکل S1A) کے باوجود برقرار تھی۔ مجموعی طور پر، ہم نے کل 3013 پروٹینوں کی مقدار درست کی، جن میں سے تقریباً 22٪ مائٹوکونڈریل پروٹوم کی بنیاد پر مائٹوکونڈریا (شکل 1E) (شکل 1E) (24) پر مبنی مائٹو کارٹا 2.0 تشریحات پر مبنی تھے۔ ہفتہ 8 میں کیے گئے امتیازی جین کے اظہار کے تجزیے سے معلوم ہوا کہ تمام پروٹینوں میں سے صرف 10.5% میں اہم تبدیلیاں ہوئی ہیں (شکل 1F اور شکل S1F)، جن میں سے 195 پروٹین نیچے ریگولیٹ تھے اور 120 پروٹین اپ ریگولیٹ تھے (شکل 1F)۔ یہ بات قابل غور ہے کہ اس ڈیٹا سیٹ کا "جدید راستے کا تجزیہ" ظاہر کرتا ہے کہ امتیازی طور پر ظاہر کردہ جین بنیادی طور پر مخصوص میٹابولک راستوں کے ایک محدود سیٹ سے تعلق رکھتے ہیں (شکل 1G)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ اگرچہ OXPHOS اور کیلشیم سگنلنگ سے متعلق راستوں کی کمی سے فیوژن کی کمی والے PNs میں mitochondrial dysfunction کے شامل ہونے کی تصدیق ہوتی ہے، دوسری قسمیں جن میں بنیادی طور پر امینو ایسڈ میٹابولزم شامل ہوتا ہے نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا جاتا ہے، جو کہ PNs میں ہونے والے میٹابولزم کے مطابق ہوتا ہے۔ خرابی
(A) CTRL اور Mfn2cKO چوہوں کے سیریبلر سیکشنز کی نمائندہ کنفوکل تصاویر جو PNs (calbindin، گرے) کا ترقی پسند نقصان دکھاتی ہیں۔ DAPI کے ساتھ نیوکلی کا مقابلہ کیا گیا تھا۔ (B) (A) کی مقدار (تغیر کا یک طرفہ تجزیہ، ***P <0.001؛ n = تین چوہوں سے 4 سے 6 دائرے)۔ (C) تجرباتی ورک فلو۔ (D) Purkinje (اوپر) اور دیگر سیل اقسام (درمیانی) کے لیے مخصوص مارکر کی حرارتی نقشہ کی تقسیم۔ (E) وین ڈایاگرام جس میں درجہ بندی شدہ PN میں شناخت شدہ مائٹوکونڈریل پروٹینوں کی تعداد ظاہر ہوتی ہے۔ (ایف) Mfn2cKO نیوران میں 8 ہفتوں میں الگ الگ اظہار شدہ پروٹین کا آتش فشاں پلاٹ (اہم کٹ آف ویلیو 1.3)۔ (G) تخلیقی راستے کا تجزیہ Mfn2cKO PN میں پانچ اہم ترین اپ ریگولیشن (ریڈ) اور ڈاؤن ریگولیشن (نیلے) راستے دکھاتا ہے جن کی درجہ بندی 8 ہفتوں میں کی گئی ہے۔ ہر دریافت شدہ پروٹین کی اوسط اظہار کی سطح دکھائی گئی ہے۔ گرے اسکیل ہیٹ میپ: ایڈجسٹ شدہ P ویلیو۔ ns، اہم نہیں.
پروٹومکس کے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ کمپلیکس I، III، اور IV کے پروٹین اظہار میں بتدریج کمی واقع ہوئی ہے۔ کمپلیکسز I، III، اور IV سبھی میں ضروری mtDNA- انکوڈ شدہ ذیلی یونٹس شامل تھے، جبکہ پیچیدہ II، جو صرف نیوکلیئر کوڈڈ تھا، بنیادی طور پر غیر متاثر ہوا تھا (شکل 2A اور شکل S2A)۔ . پروٹومکس کے نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، سیریبلر ٹشو سیکشنز کی امیونو ہسٹو کیمسٹری نے ظاہر کیا کہ MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) PN میں پیچیدہ IV کی ذیلی یونٹ کی سطح بتدریج کم ہوتی گئی (شکل 2B)۔ mtDNA-encoded subunit Mtatp8 کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا (Figure S2A)، جبکہ نیوکلیئر-انکوڈ شدہ ATP سنتھیس سبونائٹ کی مستحکم ریاست کی سطح میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی، جو کہ معلوم مستحکم ATP سنتھیس ذیلی اسمبلی F1 کمپلیکس کے مطابق ہے جب mtDNA اظہار مستحکم ہے۔ تشکیل یکساں ہے۔ مداخلت (7)۔ ترتیب شدہ Mfn2cKO PNs میں ریئل ٹائم پولیمریز چین ری ایکشن (qPCR) کے ذریعے mtDNA کی سطح کی تشخیص نے mtDNA کاپی نمبر میں بتدریج کمی کی تصدیق کی۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، 8 ہفتوں کی عمر میں، mtDNA کی سطح کا صرف 20٪ برقرار رکھا گیا تھا (شکل 2C)۔ ان نتائج سے ہم آہنگ، Mfn2cKO PNs کے کنفوکل مائکروسکوپی سٹیننگ کا استعمال DNA کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا، جس میں مائٹوکونڈریل نیوکلیوٹائڈس (شکل 2D) کی وقت پر منحصر کھپت کو دکھایا گیا تھا۔ ہم نے پایا کہ مائٹوکونڈریل پروٹین کے انحطاط اور تناؤ کے ردعمل میں شامل صرف کچھ امیدواروں کو اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا، بشمول Lonp1، Afg3l2 اور Clpx، اور OXPHOS کمپلیکس اسمبلی عوامل۔ اپوپٹوسس میں شامل پروٹین کی سطح میں کوئی خاص تبدیلی نہیں پائی گئی (فگر S2B)۔ اسی طرح، ہم نے پایا کہ کیلشیم کی نقل و حمل میں شامل مائٹوکونڈریا اور اینڈوپلاسمک ریٹیکولم چینلز میں صرف معمولی تبدیلیاں ہوتی ہیں (فگر S2C)۔ اس کے علاوہ، آٹوفجی سے متعلق پروٹین کی تشخیص میں کوئی خاص تبدیلیاں نہیں پائی گئیں، جو امیونو ہسٹو کیمسٹری اور الیکٹران مائیکروسکوپی (فگر S3) کے ذریعے ویوو میں مشاہدہ کیے گئے آٹوفاگوسوم کی مرئی شمولیت سے مطابقت رکھتی ہے۔ تاہم، PNs میں ترقی پسند OXPHOS dysfunction واضح الٹراسٹرکچرل mitochondrial تبدیلیوں کے ساتھ ہے۔ مائٹوکونڈریل کلسٹرز 5 اور 8 ہفتوں کی عمر کے Mfn2cKO PNs کے سیل باڈیز اور ڈینڈریٹک درختوں میں دیکھے جا سکتے ہیں، اور اندرونی جھلی کی ساخت میں گہری تبدیلیاں آئی ہیں (شکل S4، A اور B)۔ ان الٹراسٹرکچرل تبدیلیوں اور mtDNA میں نمایاں کمی کے ساتھ، tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) کے ساتھ شدید دماغی سیریبلر سلائسس کے تجزیہ سے معلوم ہوا کہ Mfn2cKO PNs میں مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت میں نمایاں کمی واقع ہوئی ہے (شکل S4)۔
(A) OXPHOS کمپلیکس کے اظہار کی سطح کا ٹائم کورس تجزیہ۔ صرف 8 ہفتوں میں P<0.05 والے پروٹین پر غور کریں (دو طرفہ ANOVA)۔ ڈاٹڈ لائن: CTRL کے مقابلے میں کوئی ایڈجسٹمنٹ نہیں۔ (B) بائیں: ایک سیریبلر سیکشن کی ایک مثال جس پر اینٹی MTCO1 اینٹی باڈی کا لیبل لگا ہوا ہے (اسکیل بار، 20 μm)۔ پورکنجے سیل باڈیز کے زیر قبضہ علاقہ پیلے رنگ سے ڈھکا ہوا ہے۔ دائیں: MTCO1 کی سطحوں کی مقدار (متغیر کا یک طرفہ تجزیہ؛ n = 7 سے 20 خلیوں کا تجزیہ تین چوہوں سے)۔ (C) ترتیب شدہ PN میں mtDNA کاپی نمبر کا qPCR تجزیہ (متغیر کا یک طرفہ تجزیہ؛ n = 3 سے 7 چوہوں)۔ (D) بائیں: ایک اینٹی ڈی این اے اینٹی باڈی (اسکیل بار، 20 μm) کے ساتھ لیبل والے سیریبلر سلائس کی ایک مثال۔ پورکنجے سیل باڈیز کے زیر قبضہ علاقہ پیلے رنگ سے ڈھکا ہوا ہے۔ دائیں: mtDNA گھاووں کی مقدار (متغیر کا یک طرفہ تجزیہ؛ تین چوہوں سے n = 5 سے 9 خلیات)۔ (E) ایکیوٹ سیریبلر سیکشن کی ایک مثال جس میں مکمل سیل پیچ کلیمپ ریکارڈنگ میں mitoYFP + Purkinje خلیات (تیر) دکھائے جاتے ہیں۔ (F) IV وکر کی مقدار۔ (G) CTRL اور Mfn2cKO Purkinje خلیوں میں موجودہ انجیکشن کو depolarizing کی نمائندہ ریکارڈنگ۔ ٹاپ ٹریس: پہلی نبض جس نے اے پی کو متحرک کیا۔ نیچے کا نشان: زیادہ سے زیادہ AP فریکوئنسی۔ (H) پوسٹ سینیپٹک اسپونٹینیوس ان پٹس (sPSPs) کی مقدار۔ نمائندہ ریکارڈنگ ٹریس اور اس کا زوم تناسب (I) میں دکھایا گیا ہے۔ تغیر کے یک طرفہ تجزیہ میں تین چوہوں کے n = 5 سے 20 خلیات کا تجزیہ کیا گیا۔ ڈیٹا کو وسط ± SEM کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ *P <0.05; **P <0.01; *** پی <0.001۔ (J) سوراخ شدہ پیچ کلیمپ موڈ کا استعمال کرتے ہوئے ریکارڈ شدہ بے ساختہ AP کے نمائندہ نشانات۔ ٹاپ ٹریس: زیادہ سے زیادہ AP فریکوئنسی۔ باٹم ٹریس: سنگل اے پی کا زوم۔ (K) (J) کے مطابق اوسط اور زیادہ سے زیادہ AP فریکوئنسی کی مقدار درست کریں۔ مان-وٹنی ٹیسٹ؛ n = 5 خلیوں کا چار چوہوں سے تجزیہ کیا گیا۔ ڈیٹا کو وسط ± SEM کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ اہم نہیں
8 ہفتے پرانے Mfn2cKO PN میں واضح OXPHOS نقصان کا پتہ چلا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ نیوران کا جسمانی فعل شدید غیر معمولی ہے۔ لہذا، ہم نے 4 سے 5 ہفتوں اور 7 سے 8 ہفتوں میں OXPHOS کی کمی والے نیوران کی غیر فعال برقی خصوصیات کا تجزیہ کیا شدید سیریبلر سلائسس (شکل 2E) میں پورے سیل پیچ کلیمپ کی ریکارڈنگ کر کے۔ غیر متوقع طور پر، اوسط آرام کرنے والی جھلی کی صلاحیت اور Mfn2cKO نیوران کی ان پٹ مزاحمت کنٹرول کی طرح تھی، اگرچہ خلیات کے درمیان ٹھیک ٹھیک اختلافات تھے (ٹیبل 1)۔ اسی طرح، 4 سے 5 ہفتوں کی عمر میں، موجودہ وولٹیج کے تعلق (IV منحنی خطوط) میں کوئی خاص تبدیلی نہیں پائی گئی (شکل 2F)۔ تاہم، کوئی بھی Mfn2cKO نیوران 7 سے 8 ہفتے پرانا IV طرز عمل (ہائپر پولرائزیشن سٹیپ) سے نہیں بچ سکا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ اس آخری مرحلے میں ہائپر پولرائزیشن کی صلاحیت کے لیے واضح حساسیت موجود ہے۔ اس کے برعکس، Mfn2cKO نیورونز میں، depolarizing کرنٹ جو بار بار ایکشن پوٹینشل (AP) کے خارج ہونے کا سبب بنتے ہیں اچھی طرح سے برداشت کیے جاتے ہیں، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ان کے مجموعی خارج ہونے والے پیٹرن 8 ہفتے پرانے کنٹرول نیوران (ٹیبل 1 اور شکل 2G) سے نمایاں طور پر مختلف نہیں ہیں۔ اسی طرح، اچانک پوسٹ سینیپٹک کرنٹ (sPSCs) کی فریکوئنسی اور طول و عرض کنٹرول گروپ کے مقابلے تھے، اور واقعات کی فریکوئنسی 4 ہفتوں سے 5 ہفتوں سے 7 ہفتوں سے 8 ہفتوں تک اسی طرح کے اضافے کے ساتھ بڑھ گئی (شکل 2، H اور I)۔ PNs میں Synaptic پختگی کی مدت (25)۔ اسی طرح کے نتائج سوراخ شدہ PNs پیچ کے بعد حاصل کیے گئے تھے۔ یہ ترتیب سیلولر ATP نقائص کے ممکنہ معاوضے کو روکتی ہے، جیسا کہ پورے سیل پیچ کلیمپ ریکارڈنگ میں ہو سکتا ہے۔ خاص طور پر، آرام کرنے والی جھلی کی صلاحیت اور Mfn2cKO نیوران کی اچانک فائرنگ کی فریکوئنسی متاثر نہیں ہوئی (شکل 2، J اور K)۔ خلاصہ طور پر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ واضح OXPHOS dysfunction والے PNs اعلی تعدد خارج ہونے والے مادہ کے نمونوں کا اچھی طرح سے مقابلہ کر سکتے ہیں، اس بات کا اشارہ ہے کہ معاوضے کا ایک طریقہ کار موجود ہے جو انہیں تقریباً معمول کے الیکٹرو فزیولوجیکل ردعمل کو برقرار رکھنے کی اجازت دیتا ہے۔
ڈیٹا کو اوسط ± SEM کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے (تغیر کا یک طرفہ تجزیہ، ہولم-سیڈک کا متعدد موازنہ ٹیسٹ؛ *P <0.05)۔ یونٹ نمبر بریکٹ سے ظاہر ہوتا ہے۔
ہم یہ جانچنے کے لیے نکلے کہ آیا پروٹومکس ڈیٹاسیٹ (فگر 1G) میں کسی بھی زمرے میں ایسے راستے شامل ہیں جو OXPHOS کی شدید کمی کا مقابلہ کر سکتے ہیں، اس طرح یہ بتاتے ہیں کہ کیوں متاثرہ PN تقریباً نارمل الیکٹرو فزیالوجی کو برقرار رکھ سکتا ہے (شکل 2، E سے K)۔ . پروٹومکس تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ برانچڈ چین امینو ایسڈز (BCAA) کے کیٹابولزم میں شامل انزائمز کو نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا (فگر 3A اور Figure S5A)، اور حتمی پروڈکٹ acetyl-CoA (CoA) یا succinyl CoA arteriosclerosis (Ateriosclerosis) میں tricarboxylates کی تکمیل کر سکتے ہیں۔ ہم نے پایا کہ BCAA transaminase 1 (BCAT1) اور BCAT2 دونوں کے مواد میں اضافہ ہوا ہے۔ وہ α-ketoglutarate (26) سے گلوٹامیٹ پیدا کرکے BCAA کیٹابولزم کے پہلے مرحلے کو متحرک کرتے ہیں۔ تمام ذیلی یونٹس جو برانچڈ چین کیٹو ایسڈ ڈیہائیڈروجنیز (BCKD) کمپلیکس بناتے ہیں ان کو اپ ریگولیٹ کیا جاتا ہے (کمپلیکس نتیجے میں BCAA کاربن کنکال کے بعد اور ناقابل واپسی ڈیکاربوکسیلیشن کو اتپریرک کرتا ہے) (شکل 3A اور شکل S5A)۔ تاہم، ترتیب شدہ PN میں خود BCAA میں کوئی واضح تبدیلیاں نہیں پائی گئیں، جو ان ضروری امینو ایسڈز کے سیلولر اپٹیک میں اضافے یا TCA سائیکل (Figure S5B) کی تکمیل کے لیے دیگر ذرائع (گلوکوز یا لیکٹک ایسڈ) کے استعمال کی وجہ سے ہو سکتی ہے۔ OXPHOS کی کمی والے PNs نے 8 ہفتوں کی عمر میں گلوٹامین کی سڑن اور ٹرانسمیشن کی سرگرمیوں میں بھی اضافہ کیا، جس کی عکاسی مائٹوکونڈریل انزائمز گلوٹامینیز (GLS) اور گلوٹامین پائروویٹ ٹرانسامینیز 2 (GPT2) (شکل 3، A اور C) کے اپ ریگولیشن سے کی جا سکتی ہے۔ یہ بات قابل غور ہے کہ GLS کا اپ ریگولیشن صرف spliced ​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) تک ہی محدود ہے (Mfn2cKO/CTRL کی تبدیلی تقریباً 4.5 گنا، P = 0.05 ہے)، اور کینسر کے ٹشوز میں اس کا مخصوص اپ ریگولیشن بائیو ٹیوکونڈریل کو سپورٹ کر سکتا ہے۔ (27)۔
(A) گرمی کا نقشہ 8 ہفتوں میں مخصوص راستے کے لیے پروٹین کی سطح میں گنا تبدیلی کو ظاہر کرتا ہے۔ (B) اینٹی پی سی ایکس اینٹی باڈی (اسکیل بار، 20 μm) کے ساتھ لیبل والے سیریبلر سلائس کی مثال۔ پیلے رنگ کا تیر پورکنجے سیل باڈی کی طرف اشارہ کرتا ہے۔ (C) ٹائم کورس پروٹین ایکسپریشن تجزیہ جس کی شناخت ایتھروسکلروسیس کے لیے ایک اہم امیدوار کے طور پر کی گئی ہے (متعدد ٹی ٹیسٹ، *FDR <5%؛ n = 3-5 چوہوں)۔ (D) اوپر: ایک اسکیمیٹک خاکہ جو [1-13C] پائروویٹ ٹریسر (یعنی PDH یا ٹرانس آرٹیریل روٹ کے ذریعے) میں موجود لیبل لگے کاربن میں داخل ہونے کے مختلف طریقے دکھاتا ہے۔ نیچے: وائلن چارٹ سنگل لیبل والے کاربن (M1) کا فیصد دکھاتا ہے جو اسپارٹک ایسڈ، سائٹرک ایسڈ اور مالیک ایسڈ میں تبدیل ہوتا ہے [1-13C] پائروویٹ (جوڑا ٹی-ٹیسٹ؛ ** P <0.01) کے ساتھ ایکیوٹ سیریبلر سلائسز پر لیبل لگانے کے بعد۔ (E) اشارہ شدہ راستے کا جامع وقت کی تاریخ کا تجزیہ۔ صرف 8 ہفتوں میں P <0.05 والے پروٹین پر غور کریں۔ ڈیشڈ لائن: کوئی ایڈجسٹمنٹ ویلیو نہیں (متغیر کا دو طرفہ تجزیہ؛ * P <0.05؛ *** P <0.001)۔ ڈیٹا کو وسط ± SEM کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔
ہمارے تجزیے میں، BCAA کیٹابولزم اہم اپ ریگولیشن راستوں میں سے ایک بن گیا ہے۔ یہ حقیقت سختی سے تجویز کرتی ہے کہ TCA سائیکل میں داخل ہونے والے وینٹیلیشن والیوم کو PN میں OXPHOS کی کمی میں تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ یہ نیورونل میٹابولک ری وائرنگ کی ایک بڑی شکل کی نمائندگی کر سکتا ہے، جس کا براہ راست اثر نیورونل فزیالوجی اور شدید OXPHOS dysfunction کی بحالی کے دوران بقا پر پڑ سکتا ہے۔ اس مفروضے سے مطابقت رکھتے ہوئے، ہم نے پایا کہ مرکزی اینٹی ایتھروسکلروٹک انزائم PCx اپ ریگولیٹڈ ہے (Mfn2cKO/CTRL تقریباً 1.5 بار تبدیل ہوتا ہے؛ شکل 3A)، جو پائروویٹ کے آکسالواسیٹیٹ (28) میں تبدیلی کو اتپریرک کرتا ہے، جس کے بارے میں خیال کیا جاتا ہے کہ دماغی اعضاء میں سختی ہے (29، 30)۔ پروٹومکس کے نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، کنفوکل مائکروسکوپی نے ظاہر کیا کہ OXPHOS کی کمی والے PNs میں PCx اظہار خاص طور پر اور نمایاں طور پر بڑھ گیا تھا، جبکہ PCx ری ایکٹیویٹی بنیادی طور پر کنٹرول کے ملحقہ برگمین گلیل سیلز تک محدود تھی (شکل 3B)۔ PCx کے مشاہدہ شدہ اپ گریجولیشن کو عملی طور پر جانچنے کے لیے، ہم نے [1-13C] پائروویٹ ٹریسر کے ساتھ شدید سیریبلر سلائسس کا علاج کیا۔ جب پائروویٹ کو pyruvate dehydrogenase (PDH) کے ذریعے آکسائڈائز کیا گیا تھا، تو اس کا آاسوٹوپ لیبل غائب ہو گیا تھا، لیکن TCA سائیکل انٹرمیڈیٹس میں شامل ہو جاتا ہے جب پائروویٹ عروقی رد عمل کے ذریعے میٹابولائز ہو جاتا ہے (شکل 3D)۔ اپنے پروٹومکس ڈیٹا کی حمایت میں، ہم نے Mfn2cKO سلائسز کے اسپارٹک ایسڈ میں اس ٹریسر سے مارکر کی ایک بڑی تعداد کا مشاہدہ کیا، جبکہ سائٹرک ایسڈ اور مالیک ایسڈ میں بھی اعتدال پسند رجحان تھا، اگرچہ اہم نہیں (شکل 3D)۔
مائٹوپارک چوہوں کے ڈوپامائن نیوران میں مائٹوکونڈریل dysfunction کے ساتھ ڈوپامائن نیوران خاص طور پر مائٹوکونڈریل ٹرانسکرپشن فیکٹر A جین (Tfam) (Figure S6B) کو تباہ کرتے ہیں، PCx ایکسپریشن بھی نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا (31)، اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ acetone acid arteria کے دوران ہونے والی بیماری کی وجہ سے مائٹوکونڈریل ٹرانسکرپشن فیکٹر ریگولیٹ ہوتا ہے۔ جسم میں نیورونل OXPHOS کی خرابی یہ بات قابل غور ہے کہ یہ پایا گیا ہے کہ منفرد انزائمز (32-34) جو نیوران میں ظاہر ہو سکتے ہیں جو کہ آرٹیروسکلروسیس سے منسلک ہو سکتے ہیں PNs میں نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ ہوتے ہیں جن میں OXPHOS کی کمی ہوتی ہے، جیسے propionyl-CoA carboxylase (PCC-A)، Malonyl-CoA کو propionyl-CoA carboxylase (پی سی سی-اے) میں تبدیل کرتا ہے۔ 3 (ME3)، جس کا بنیادی کردار میلے سے پائروویٹ کو بازیافت کرنا ہے (شکل 3، A اور C) (33، 35)۔ اس کے علاوہ، ہمیں Pdk3 انزائم میں نمایاں اضافہ ہوا، جو فاسفوریلیٹ کرتا ہے اور اس طرح PDH (36) کو غیر فعال کرتا ہے، جبکہ Pdp1 انزائم میں ایسی کوئی تبدیلی نہیں پائی گئی جو PDH یا PDH انزائم کمپلیکس کو خود فعال کرتی ہے (شکل 3A)۔ مستقل طور پر، Mern2cKO PNs میں، Ser293 میں PDH کمپلیکس کے pyruvate dehydrogenase E1 جزو کے α1 subunit α (PDHE1α) subunit کے فاسفوریلیشن (PDH کی انزائم سرگرمی کو روکنے کے لیے جانا جاتا ہے) کو بڑھایا گیا تھا (Sigure6C)۔ پیروویٹ کو عروقی رسائی نہیں ہے۔
آخر میں، ہم نے پایا کہ سیرین اور گلائسین بائیو سنتھیسس کا سپر پاتھ وے، متعلقہ مائٹوکونڈریل فولیٹ (1C) سائیکل اور پرولین بائیو سنتھیسس (فگر 1G اور فگر S5C) سبھی نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ ہیں، رپورٹس کے مطابق، ایکٹیویشن کے عمل کے دوران۔ اردگرد کے ٹشوز مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن (5-7) کے ساتھ متحرک ہوتے ہیں۔ ان پروٹومکس ڈیٹا کی حمایت کرنے والے کنفوکال تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ OXPHOS کے ساتھ PN میں، 8 ہفتے پرانے چوہوں کے سیریبلر سلائسس کو سیرین ہائیڈروکسیمیتھل ٹرانسفریز 2 (SHMT2) کا نشانہ بنایا گیا، جو مائٹوکونڈریل فولیٹ سائیکل کا ایک اہم انزائم ہے۔ اہم مدافعتی ردعمل (شکل S5D)۔ 13 CU-glucose-incubated acute cerebellar slices میں، میٹابولک ٹریسنگ کے تجربات نے سیرین اور پرولین بائیو سنتھیسس کے اپ ریگولیشن کی مزید تصدیق کی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ کاربن آئسوفارمز کا سیرین اور پرولین میں اضافہ ہوا ہے (شکل S5E)۔ چونکہ GLS اور GPT2 کے ذریعے فروغ پانے والے رد عمل گلوٹامائن سے گلوٹامیٹ کی ترکیب اور گلوٹامیٹ اور α-ketoglutarate کے درمیان ٹرانسمیشن کے لیے ذمہ دار ہیں، اس لیے ان کی اپ گریجشن سے پتہ چلتا ہے کہ OXPHOS کی کمی والے نیورونز میں گلوٹامیٹ کی مانگ میں اضافہ ہوتا ہے، اس کا مقصد پرو لائن (S5) کے بڑھے ہوئے بائیو سنتھیسس کو برقرار رکھنا ہو سکتا ہے۔ ان تبدیلیوں کے برعکس، PN-مخصوص Mfn2cKO چوہوں کے سیریبلر آسٹروائٹس کے پروٹومک تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ یہ راستے (تمام اینٹی پیرو آکسیڈیز سمیت) اظہار میں نمایاں طور پر تبدیل نہیں ہوئے، اس طرح یہ ظاہر ہوتا ہے کہ یہ میٹابولک ری ڈائریکشن انحطاط پذیر PN، DF سے منتخب ہے۔
خلاصہ طور پر، ان تجزیوں سے PNs میں مخصوص میٹابولک راستوں کی عارضی ایکٹیویشن کے نمایاں طور پر مختلف نمونوں کا انکشاف ہوا۔ اگرچہ غیر معمولی نیورونل مائٹوکونڈریل فنکشن ابتدائی ایٹروسکلروسیس اور 1C کی دوبارہ تشکیل (فگر 3E اور Figure S5C) کا باعث بن سکتا ہے، اور یہاں تک کہ I اور IV کمپلیکس کے اظہار میں بھی متوقع تبدیلیاں، سیرین ڈی نوو ترکیب میں تبدیلیاں صرف آخری مراحل میں ہی ظاہر ہوتی ہیں۔ OXPHOS dysfunction (شکل 3E اور شکل S5C)۔ یہ نتائج ایک ترتیب وار عمل کی وضاحت کرتے ہیں جس میں تناؤ سے متاثرہ مائٹوکونڈریل (1C سائیکل) اور سائٹوپلاسمک (سیرین بائیو سنتھیسس) TCA سائیکل میں ایتھروسکلروسیس میں اضافے کے ساتھ ہم آہنگی کے ساتھ ردعمل کرتے ہیں تاکہ نیورونل میٹابولزم کو نئی شکل دی جاسکے۔
8 ہفتے پرانے OXPHOS کی کمی والے PNs اعلی تعدد اتیجیت کی سرگرمی کو برقرار رکھ سکتے ہیں اور مائٹوکونڈریل dysfunction کی تلافی کے لیے اہم میٹابولک ربط سے گزر سکتے ہیں۔ یہ دریافت ایک دلچسپ امکان پیدا کرتی ہے کہ اس وقت بھی، یہ خلیات نیوروڈیجنریشن میں تاخیر یا روک تھام کے لیے علاج کی مداخلت بھی حاصل کر سکتے ہیں۔ دیر ہم نے اس امکان کو دو آزاد مداخلتوں کے ذریعے حل کیا۔ پہلے طریقہ میں، ہم نے Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) ویکٹر کو ڈیزائن کیا تاکہ MFN2 کو منتخب طور پر Vivo میں OXPHOS کی کمی والے PNs میں ظاہر کیا جا سکے (فگر S7A)۔ AAV انکوڈنگ MFN2 اور فلوروسینٹ رپورٹر جین mCherry (Mfn2-AAV) کی وٹرو میں پرائمری نیوران کلچرز میں تصدیق کی گئی تھی، جس کی وجہ سے MFN2 کا اظہار Cre-independent انداز میں ہوا اور مائٹوکونڈریل مورفولوجی کو بچایا گیا، اس طرح Mfn2curure، BKOIGO7، اور FN2 میں نیوروموٹیشن کو روکا گیا۔ اگلا، ہم نے 8 ہفتے پرانے Mfn2-AAV کو دقیانوسی طور پر Mfn2cKO اور کنٹرول چوہوں کے سیریبلر کورٹیکس تک پہنچانے کے لیے Vivo تجربات کیے، اور 12 ہفتے پرانے چوہوں (شکل 4A) کا تجزیہ کیا۔ علاج شدہ Mfn2cKO چوہے مر گئے (شکل 1، A اور B) (16)۔ Vivo میں وائرل نقل و حمل کے نتیجے میں کچھ سیریبلر حلقوں میں PN کا انتخابی اظہار ہوتا ہے (شکل S7، G اور H)۔ صرف mCherry (Ctrl-AAV) کا اظہار کرنے والے کنٹرول AAV کے انجیکشن کا Mfn2cKO جانوروں میں نیوروڈیجنریشن کی ڈگری پر کوئی خاص اثر نہیں ہوا۔ اس کے برعکس، Mfn2-AAV کے ساتھ منتقل کردہ Mfn2cKOs کے تجزیہ نے PN سیل پرت (شکل 4، B اور C) کا ایک اہم حفاظتی اثر دکھایا۔ خاص طور پر، نیورون کی کثافت کنٹرول جانوروں (شکل 4، B اور C، اور شکل S7، H اور I) سے تقریباً الگ نہیں ہوتی۔ MFN1 کا اظہار لیکن MFN2 نہیں اعصابی موت کو بچانے میں یکساں طور پر موثر ہے (شکل 4C اور شکل S7, C اور F)، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ ایکٹوپک MFN1 کا اظہار مؤثر طریقے سے MFN2 کی کمی کو پورا کر سکتا ہے۔ واحد PN سطح پر مزید تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ Mfn2-AAV نے بڑے پیمانے پر مائٹوکونڈریا کے الٹرا سٹرکچر کو بچایا، mtDNA کی سطح کو معمول پر لایا، اور اینٹی انجیوجینیسیس مارکر PCx (شکل 4، C سے E) کے اعلی اظہار کو الٹ دیا۔ آرام کی حالت میں بچائے گئے Mfn2cKO چوہوں کے بصری معائنہ سے معلوم ہوا کہ ان کی کرنسی اور موٹر علامات (حرکت S1 سے S3) میں بہتری آئی ہے۔ آخر میں، یہ تجربات ظاہر کرتے ہیں کہ OXPHOS میں شدید کمی والے PNs میں MFN2 کو دوبارہ متعارف کرانے میں تاخیر mtDNA کی کھپت کو ریورس کرنے اور atherosclerosis کو دلانے کے لیے کافی ہے، اس طرح Vivo میں axon degeneration اور neuronal موت کو روکتا ہے۔
(A) ایک اسکیم AAV انکوڈنگ MFN2 کو انجیکشن لگانے کے تجرباتی شیڈول کو دکھاتی ہے جب اشارہ شدہ میٹابولک پاتھ وے چالو ہوتا ہے۔ (B) Mfn2cKO چوہوں میں 12 ہفتوں پرانے سیریبلر سلائسس کی نمائندہ کنفوکل امیجز 8 ہفتوں میں منتقل ہوئیں اور اینٹی کیلبینڈین اینٹی باڈی کا لیبل لگا ہوا ہے۔ دائیں: محور ریشوں کا پیمانہ۔ ایکسن زوم کا پیمانہ 450 اور 75 μm ہے۔ (C) بائیں: AAV ٹرانسڈکشن لوپ (AAV+) میں Purkinje سیل کی کثافت کی مقدار (متغیر کا یک طرفہ تجزیہ؛ n = 3 چوہوں)۔ دائیں: ایم ٹی ڈی این اے فوکس تجزیہ منتقلی PN میں ہفتہ 12 میں (غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ؛ n = تین چوہوں سے 6 خلیات)۔ * پی <0.05; ** پی <0.01۔ (D) Mfn2cKO سیریبلر سیکشنز کے PNs کے نمائندہ ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکرو گراف اشارہ شدہ وائرل ویکٹر کے ساتھ منتقل ہوئے۔ گلابی ماسک ڈینڈرائٹس کے زیر قبضہ علاقے کی عکاسی کرتا ہے، اور پیلے رنگ کے نقطوں والا مربع دائیں جانب فراہم کردہ زوم کو ظاہر کرتا ہے۔ n مرکزے کی نمائندگی کرتا ہے۔ اسکیل بار، 1μm۔ (E) 12 ہفتوں میں منتقل ہونے والے PN میں PCx داغدار ہونے کی ایک مثال دکھاتا ہے۔ اسکیل بار، 20μm۔ OE، زیادہ اظہار؛ ایف سی، فولڈ تبدیلی۔
آخر میں، ہم نے PNs میں پیرو آکسیڈیس سے حوصلہ افزائی سیل کی بقا کی اہمیت کی تحقیقات کی جنہوں نے OXPHOS dysfunction کا تجربہ کیا ہے۔ ہم نے خاص طور پر ماؤس PCx mRNA (AAV-shPCx) کو نشانہ بناتے ہوئے mCherry انکوڈنگ AAV-shRNA (شارٹ ہیئرپین RNA) تیار کیا، اور Mfn2cKO چوہوں کے سیریبیلم میں وائرس یا اس کے سکیمبلڈ کنٹرول (AAV-scr) کو انجکشن لگایا۔ انجیکشن عمر کے چوتھے ہفتے (شکل 5A) میں اس مدت کے دوران موثر PCx دستک ڈاؤن کو حاصل کرنے کے لئے انجام دیا گیا تھا جب PCx اظہار میں اضافہ ہوا تھا (شکل 3C) اور PN سیل کی پرت اب بھی برقرار تھی (شکل 1A)۔ یہ بات قابل غور ہے کہ PCx (Figure S8A) کو دستک دینے سے PN کی موت میں نمایاں تیزی آتی ہے، جو کہ متاثرہ انگوٹھی تک محدود ہے (شکل 5، B اور C)۔ پی سی ایکس اپ ریگولیشن کے ذریعے پیدا ہونے والے میٹابولک اثرات کے طریقہ کار کو سمجھنے کے لیے، ہم نے پی این ایس کی ریڈوکس سٹیٹس کا مطالعہ کیا جب PCx دستک ڈاؤن اور AAV- ثالثی آپٹیکل بائیو سینسر Grx1-roGFP2 کا بیک وقت اظہار کیا گیا (فگر S8، B سے D) تاکہ پیو آکس 3 کی ممکنہ تبدیلی کا اندازہ لگایا جا سکے۔ پھر، ہم نے 7 ہفتے پرانے Mfn2cKO کے شدید دماغی ٹکڑوں میں دو فوٹون فلوروسینس لائف ٹائم امیجنگ مائیکروسکوپی (FLIM) کی یا FLIM حالات کی تصدیق کے بعد cytoplasmic redox کی حیثیت میں ممکنہ تبدیلیوں کا پتہ لگانے کے لیے littermates کو کنٹرول کیا (شکل S8، E سے G)۔ تجزیہ نے ایک واحد Mfn2cKO PNs کی آکسیکرن حالت میں نمایاں اضافہ دکھایا جس میں PCx اظہار کی کمی ہے، جو کنٹرول نیوران یا Mfn2cKO PNs سے مختلف ہے جو صرف سکیمبلڈ shRNA (شکل 5، D اور E) کا اظہار کرتے ہیں۔ جب پی سی ایکس ایکسپریشن کو ڈاون ریگولیٹ کیا گیا تو، انتہائی آکسیڈائزڈ حالت دکھانے والے Mfn2cKO PNs کی فیصد میں تین گنا سے زیادہ اضافہ ہوا (شکل 5E)، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ PCx اپ ریگولیشن نے انحطاط پذیر نیوران کی ریڈوکس صلاحیت کو برقرار رکھا ہے۔
(A) ایک اسکیم AAV انکوڈنگ shPCx انجیکشن لگانے کے تجرباتی شیڈول کو دکھاتی ہے جب اشارہ شدہ میٹابولک پاتھ وے چالو ہوتا ہے۔ (B) Mfn2cKO چوہوں میں 8 ہفتہ پرانے سیریبلر سیکشنز کی نمائندہ کنفوکل تصاویر کو 4 ہفتوں میں اینٹی کیلسینورین اینٹی باڈی کے ساتھ منتقل کیا گیا اور لیبل لگایا گیا۔ اسکیل بار، 450μm۔ (C) AAV- transduced loops میں Purkinje cell density کی مقدار (متغیر کا یک طرفہ تجزیہ؛ n = 3 سے 4 چوہوں)۔ ڈیٹا کو وسط ± SEM کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ *** پی <0.001۔ (D) نمائندہ FLIM تصویر مخصوص تجرباتی حالات کے تحت گلوٹاتھیون ریڈوکس سینسر Grx1-roGFP2 کا اظہار کرنے والے 7 ہفتہ پرانے PN کی اوسط عمر کو ظاہر کرتی ہے۔ LUT (لک اپ ٹیبل) تناسب: بقا کے وقت کا وقفہ (پکوسیکنڈز میں)۔ اسکیل بار، 25μm۔ (E) ہسٹوگرام (D) سے Grx1-roGFP2 لائف ٹائم اقدار کی تقسیم کو ظاہر کرتا ہے (n = 158 سے 368 خلیات ہر حالت میں دو چوہوں میں)۔ ہر ہسٹوگرام کے اوپر پائی چارٹ: نمایاں طور پر لمبے (سرخ، آکسائڈائزڈ) یا چھوٹے (نیلے، کم) عمر کی قدروں والے خلیوں کی تعداد دکھاتا ہے، جو CTRL-AAV-scr میں اوسط عمر کی قدر کے 1 SD سے زیادہ ہے۔ (ایف) مجوزہ ماڈل نیورونل پی سی ایکس کی اپ گریجشن کے حفاظتی اثر کو ظاہر کرتا ہے۔
مجموعی طور پر، جو ڈیٹا ہم یہاں فراہم کرتے ہیں اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ MFN2 کا دوبارہ اظہار OXPHOS کی شدید کمی، شدید mtDNA کی کمی، اور انتہائی غیر معمولی اسٹا جیسی مورفولوجی کے ساتھ ایڈوانسڈ PN کو مکمل طور پر بچا سکتا ہے، اس طرح جدید بیماریوں میں بھی مسلسل ترقی فراہم کرتا ہے۔ نیوروڈیجنریشن سیل کی موت سے پہلے مرحلے کا الٹ جانے والا ثبوت فراہم کرتا ہے۔ میٹابولک لچک کی اس ڈگری پر نیوران کی ایتھروسکلروسیس (ٹی سی اے سائیکل کی ری وائرنگ) کو دلانے کی صلاحیت پر مزید زور دیا جاتا ہے، جو OXPHOS کی کمی والے PNs میں PCx اظہار کو روکتا ہے اور سیل کی موت کو بڑھاتا ہے، اس طرح ایک حفاظتی کردار ادا کرتا ہے (شکل 5F)۔
اس مطالعے میں، ہم نے شواہد فراہم کیے کہ OXPHOS dysfunction کے لیے PNs کا ردعمل میٹابولک پروگراموں کے ذریعے فعال ہونے والے تفریق ایکٹیویشن پاتھ وے کے ذریعے آہستہ آہستہ TCA سائیکل ایتھروسکلروسیس میں تبدیل ہونا ہے۔ ہم نے بہت سے تکمیلی طریقوں کے ساتھ پروٹومک تجزیہ کی تصدیق کی اور انکشاف کیا کہ جب شدید مائٹوکونڈریل dysfunction کی طرف سے چیلنج کیا جاتا ہے تو، نیوران میٹابولک لچک کی پہلے سے نامعلوم شکل رکھتے ہیں۔ ہماری حیرت کی بات یہ ہے کہ ری وائرنگ کا پورا عمل ضروری طور پر ٹرمینل میٹابولک حالت کو نشان زد نہیں کرتا جو نیوروڈیجنریشن کے ساتھ بتدریج اور ناقابل واپسی ہے، لیکن ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ یہ خلیے کی موت سے پہلے کے مرحلے میں بھی ایک مینٹیننس نیورون تشکیل دے سکتا ہے فنکشنل کمپنسیشن میکانزم۔ یہ دریافت اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ نیوران جسم میں کافی حد تک میٹابولک پلاسٹکٹی رکھتے ہیں۔ یہ حقیقت ثابت کرتی ہے کہ MFN2 کا بعد میں دوبارہ تعارف کلیدی میٹابولک مارکروں کے اظہار کو ریورس کر سکتا ہے اور PN کے انحطاط کو روک سکتا ہے۔ اس کے برعکس، یہ atherosclerosis کو روکتا ہے اور اعصاب کو تیز کرتا ہے۔ غیر جنس پرست
ہماری تحقیق میں سب سے زیادہ دلچسپ نتائج میں سے ایک یہ ہے کہ OXPHOS کی کمی والے PNs TCA سائیکل میٹابولزم کو ریگولیٹ کرنے والے انزائمز کو تبدیل کر سکتے ہیں جو خاص طور پر arteriosclerosis کو متحرک کرتے ہیں۔ میٹابولک ری آرنجمنٹ کینسر کے خلیات کی ایک عام خصوصیت ہے، جن میں سے کچھ ٹی سی اے سائیکل انٹرمیڈیٹس کو کم کرنے والے مساوی پیدا کرنے کے لیے گلوٹامین پر انحصار کرتے ہیں، جو سانس کی زنجیر کو چلاتے ہیں اور لپڈ اور نیوکلیوٹائڈ بائیو سنتھیس کے پیشرو کی پیداوار کو برقرار رکھتے ہیں (39، 40)۔ ایک حالیہ مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ OXPHOS کی خرابی کا سامنا کرنے والے پردیی ٹشوز میں، گلوٹامین/گلوٹامیٹ میٹابولزم کا دوبارہ رابطہ بھی ایک نمایاں خصوصیت ہے (5, 41)، جہاں TCA سائیکل میں گلوٹامین کے داخلے کی سمت کا انحصار OXPHOS کی شدت کی وجہ سے ہوتا ہے۔ )۔ تاہم، جسم میں نیورونل میٹابولک پلاسٹکٹی کی مماثلت اور بیماری کے تناظر میں اس کی ممکنہ مطابقت کے بارے میں واضح ثبوت کی کمی ہے۔ ایک حالیہ ان وٹرو مطالعہ میں، بنیادی کارٹیکل نیوران کو نیورو ٹرانسمیشن کے لیے گلوٹامیٹ پولز کو متحرک کرتے ہوئے دکھایا گیا، اس طرح میٹابولک تناؤ کے حالات (42) میں آکسیڈیٹیو میٹابولزم اور ایتھروسکلروسیس کو فروغ ملتا ہے۔ یہ بات قابل غور ہے کہ TCA سائیکل انزائم succinate dehydrogenase کی فارماسولوجیکل روک کے تحت، پیروویٹ کاربوکسیلیشن کو کلچرڈ سیریبلر گرینول نیورون (34) میں آکسالواسیٹیٹ کی ترکیب کو برقرار رکھنے کے لیے خیال کیا جاتا ہے۔ تاہم، دماغی بافتوں سے ان میکانزم کی جسمانی مطابقت (جہاں ایتھروسکلروسیس کو بنیادی طور پر ایسٹروسائٹس تک محدود سمجھا جاتا ہے) کی اب بھی اہم جسمانی اہمیت ہے (43)۔ اس صورت میں، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ جسم میں OXPHOS سے نقصان پہنچانے والے PNs کو BCAA انحطاط اور پائروویٹ کاربوکسیلیشن میں تبدیل کیا جا سکتا ہے، جو TCA پول انٹرمیڈیٹس کی تکمیل کے دو اہم ذرائع ہیں۔ اگرچہ نیورونل انرجی میٹابولزم میں بی سی اے اے کیٹابولزم کی اہم شراکت تجویز کی گئی ہے، نیورو ٹرانسمیشن (44) کے لیے گلوٹامیٹ اور جی اے بی اے کے کردار کے علاوہ، ویوو میں ان میکانزم کا ابھی تک کوئی ثبوت نہیں ہے۔ لہذا، یہ قیاس کرنا آسان ہے کہ غیر فعال PNs خود بخود ایتھروسکلروسیس کو بڑھا کر انضمام کے عمل سے چلنے والے TCA انٹرمیڈیٹس کے استعمال کی تلافی کر سکتے ہیں۔ خاص طور پر، Aspartic ایسڈ کی بڑھتی ہوئی مانگ کو برقرار رکھنے کے لیے PCx کی اپ گریجشن کی ضرورت پڑ سکتی ہے، جو کہ mitochondrial dysfunction (45) والے خلیوں کو پھیلانے میں تجویز کیا جاتا ہے۔ تاہم، ہمارے میٹابولومکس تجزیہ نے Mfn2cKO PNs (Figure S6A) میں aspartic ایسڈ کی مستحکم ریاست کی سطح میں کوئی خاص تبدیلی ظاہر نہیں کی، جو ممکنہ طور پر پھیلنے والے خلیوں اور پوسٹ mitotic نیوران کے درمیان aspartic ایسڈ کے مختلف میٹابولک استعمال کی عکاسی کرتا ہے۔ اگرچہ ویوو میں غیر فعال نیورانوں میں پی سی ایکس اپ گریجولیشن کا صحیح طریقہ کار ابھی باقی ہے، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ یہ قبل از وقت ردعمل نیوران کی ریڈوکس حالت کو برقرار رکھنے میں اہم کردار ادا کرتا ہے، جس کا مظاہرہ سیریبلر سلائسس پر FLIM تجربات میں کیا گیا تھا۔ خاص طور پر، PNs کو PCx کو ریگولیٹ کرنے سے روکنا زیادہ آکسائڈائزڈ حالت کا باعث بن سکتا ہے اور سیل کی موت کو تیز کر سکتا ہے۔ BCAA کے انحطاط کو چالو کرنا اور پائروویٹ کا کاربو آکسیلیشن مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن (7) کے پردیی ٹشوز کو نمایاں کرنے کے طریقے نہیں ہیں۔ لہذا، وہ OXPHOS کی کمی والے نیوران کی ترجیحی خصوصیت لگتے ہیں، چاہے وہ واحد خصوصیت نہ ہو، جو نیوروڈیجنریشن کے لیے اہم ہے۔ .
سیریبلر بیماری ایک متضاد قسم کی نیوروڈیجینریٹو بیماری ہے جو عام طور پر ایٹیکسیا کے طور پر ظاہر ہوتی ہے اور اکثر PNs کو نقصان پہنچاتی ہے (46)۔ نیوران کی یہ آبادی خاص طور پر مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کا شکار ہے کیونکہ چوہوں میں ان کا منتخب انحطاط بہت سے موٹر علامات کو دوبارہ پیدا کرنے کے لیے کافی ہے جو انسانی اسپنوسیریبلر ایٹیکسیا (16، 47، 48) کی خصوصیت رکھتے ہیں۔ رپورٹس کے مطابق، ایک اتپریورتی جین کے ساتھ ایک ٹرانسجینک ماؤس ماڈل انسانی spinocerebellar ataxia سے منسلک ہے اور اس میں mitochondrial dysfunction (49, 50) ہے، PNPH میں OXPHOS کی کمی کے نتائج کا مطالعہ کرنے کی اہمیت پر زور دیتا ہے۔ لہذا، اس منفرد نیوران آبادی کو مؤثر طریقے سے الگ تھلگ کرنے اور اس کا مطالعہ کرنا خاص طور پر موزوں ہے۔ تاہم، یہ دیکھتے ہوئے کہ PNs دباؤ کے لیے بہت حساس ہوتے ہیں اور پوری سیریبلر سیل کی آبادی کے کم تناسب کا سبب بنتے ہیں، بہت سے اومکس پر مبنی مطالعات کے لیے، پورے خلیات کے طور پر ان کی منتخب علیحدگی اب بھی ایک چیلنجنگ پہلو ہے۔ اگرچہ دیگر خلیات کی اقسام (خاص طور پر بالغ ٹشوز) کی آلودگی کی مکمل کمی کو حاصل کرنا تقریباً ناممکن ہے، لیکن ہم نے FACS کے ساتھ ایک مؤثر علیحدگی کے قدم کو ملایا تاکہ بہاو پروٹومکس تجزیہ کے لیے کافی تعداد میں قابل عمل نیوران حاصل کیے جا سکیں، اور ہمارے پاس کافی زیادہ پروٹین کوریج (تقریباً 3000 پروٹین) موجود ہے (موجودہ بیلیم 5 سیٹ کے ساتھ)۔ پورے خلیات کی عملداری کو برقرار رکھتے ہوئے، جو طریقہ ہم یہاں فراہم کرتے ہیں وہ ہمیں نہ صرف مائٹوکونڈریا میں میٹابولک راستوں میں ہونے والی تبدیلیوں کو چیک کرنے کی اجازت دیتا ہے، بلکہ اس کے سائٹوپلاسمک ہم منصبوں میں ہونے والی تبدیلیوں کو بھی چیک کرنے کی اجازت دیتا ہے، جو سیل کی قسم کو افزودہ کرنے کے لیے مائٹوکونڈریل میمبرین ٹیگز کے استعمال کی تکمیل کرتا ہے۔ ہم جو طریقہ بیان کرتے ہیں اس کا تعلق نہ صرف Purkinje خلیات کے مطالعہ سے ہے، بلکہ اسے آسانی سے کسی بھی قسم کے خلیے پر لاگو کیا جا سکتا ہے تاکہ بیمار دماغوں میں میٹابولک تبدیلیوں کو حل کیا جا سکے، بشمول مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کے دیگر ماڈلز۔
آخر میں، ہم نے اس میٹابولک ری آرنجمنٹ کے عمل کے دوران ایک علاج ونڈو کی نشاندہی کی ہے جو سیلولر تناؤ کی اہم علامات کو مکمل طور پر ریورس کر سکتی ہے اور نیورونل انحطاط کو روک سکتی ہے۔ لہذا، یہاں بیان کردہ ری وائرنگ کے عملی مضمرات کو سمجھنا مائٹوکونڈریل dysfunction کے دوران اعصابی عملداری کو برقرار رکھنے کے ممکنہ علاج کے بارے میں بنیادی بصیرت فراہم کرسکتا ہے۔ مستقبل کی تحقیق جس کا مقصد دماغی خلیوں کی دیگر اقسام میں توانائی کے تحول میں ہونے والی تبدیلیوں کو الگ کرنا ہے، اس اصول کے دیگر اعصابی امراض پر لاگو ہونے کو مکمل طور پر ظاہر کرنے کے لیے ضروری ہے۔
MitoPark چوہوں کو پہلے بیان کیا گیا ہے (31)۔ LoxP flanking Mfn2 جین والے C57BL/6N چوہوں کو پہلے بیان کیا گیا ہے (18) اور L7-Cre چوہوں (23) کے ساتھ عبور کیا گیا ہے۔ نتیجے میں دوہری ہیٹروزائگس اولاد کو پھر ہوموزائگس Mfn2loxP/Mfn2loxP چوہوں کے ساتھ عبور کیا گیا تاکہ Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP؛ L7-cre) کے لیے پورکنجے کے لیے مخصوص جین ناک آؤٹ تیار کیا جا سکے۔ ملن کے ذیلی سیٹ میں، Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ایلیل (اسٹاپ-mtYFP) کو اضافی کراسنگ (20) کے ذریعے متعارف کرایا گیا تھا۔ تمام جانوروں کے طریقہ کار کو یورپی، قومی اور ادارہ جاتی رہنما خطوط کے مطابق انجام دیا گیا تھا اور اس کی منظوری امویلٹ اور وربراچرچٹز، نارتھ رائن ویسٹ فیلیا، جرمنی کے لینڈسمٹفر نیچر نے دی تھی۔ جانوروں کا کام بھی یورپی فیڈریشن آف لیبارٹری اینیمل سائنسز ایسوسی ایشن کی رہنمائی پر عمل کرتا ہے۔
حاملہ عورت کے سروائیکل کی نقل مکانی کو بے ہوشی کرنے کے بعد، ماؤس ایمبریو کو الگ تھلگ کر دیا جاتا ہے (E13)۔ پرانتستا کو ہینکس کے بیلنسڈ سالٹ سلوشن (HBSS) میں 10 ایم ایم ہیپس کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا اور ڈلبیکو کے موڈیفائیڈ ایگلز میڈیم پر منتقل کیا گیا تھا جس میں پاپین (20 U/ml) اور سسٹین (1μg/ml) تھا۔ DMEM میں ٹشو کو انکیوبیٹ کریں) اور اسے انزیمیٹک ہاضمہ کے ذریعے الگ کریں۔ ml) 37°C پر 20 منٹ کے لیے، اور پھر میکانکی طور پر DMEM میں مل کر 10% فیٹل بوائن سیرم کے ساتھ ملایا جاتا ہے۔ سیلز کو شیشے کے کور سلپس پر 2×106 فی 6 سینٹی میٹر کلچر ڈش کی کثافت پر یا امیجنگ تجزیہ کے لیے 0.5×105 سیل/سینٹی میٹر 2 کی کثافت پر پولی لیسین کے ساتھ لیپت کیا گیا تھا۔ 4 گھنٹے کے بعد، میڈیم کو نیوروباسل سیرم فری میڈیم سے تبدیل کیا گیا جس میں 1% B27 سپلیمنٹ اور 0.5 mM GlutaMax شامل ہے۔ اس کے بعد پورے تجربے کے دوران نیورانز کو 37 ° C اور 5% CO2 پر برقرار رکھا گیا اور ہفتے میں ایک بار کھلایا گیا۔ وٹرو میں دوبارہ ملاپ کو دلانے کے لیے، وٹرو میں دوسرے دن نیوران کے علاج کے لیے درج ذیل AAV9 وائرس ویکٹر کا 3μl (24-well کلچر ڈش) یا 0.5μl (24-well پلیٹ) استعمال کیا گیا: AAV9.CMV.PI.eGFP۔ WPRE.bGH (Addgene، کیٹلاگ نمبر 105530-AAV9) اور AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene، کیٹلاگ نمبر 105545-AAV9)۔
ماؤس Mfn1 اور Mfn2 تکمیلی DNA (بالترتیب ایڈجین پلاسمڈ #23212 اور #23213 سے حاصل کیا گیا) کو C-ٹرمینس پر V5 ترتیب (GKPIPNPLLGLDST) کے ساتھ نشان زد کیا گیا ہے، اور T2A sequence کے ذریعے فریم میں mCherry کے ساتھ ملایا گیا ہے۔ Grx1-roGFP2 Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) کی طرف سے ایک تحفہ ہے۔ روایتی کلوننگ طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے tdTomato کیسٹ کی جگہ لے کر، pAAV-CAG-FLEX-tdTomato بیک بون (Addgene حوالہ نمبر 28306) میں pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-VCA-، pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-VCA-، کیسٹ کو تبدیل کر دیا گیا۔ FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 اور pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ویکٹر۔ اسی طرح کی حکمت عملی پی اے اے وی-سی اے جی-فلیکس-ایم چیری کو کنٹرول ویکٹر بنانے کے لیے استعمال کی گئی تھی۔ AAV-shPCx کنسٹرکٹ کو پیدا کرنے کے لیے، ایک پلازمڈ AAV ویکٹر (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) کی ضرورت ہے، جس میں shRNA کو نشانہ بنانے والے ماؤس PCx کو انکوڈنگ کرنے والا DNA ترتیب ہوتا ہے۔ (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAAG 3′) U6 پروموٹر کے کنٹرول میں، mCherry کا استعمال CMV پروموٹر کے کنٹرول میں کیا جاتا ہے۔ معاون AAV ویکٹر کی پیداوار مینوفیکچرر کی ہدایات (سیل بائولابس) کے مطابق کی گئی تھی۔ مختصراً، mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)، mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) لے جانے والے ٹرانسفر پلازمڈ کا استعمال کریں (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) یا Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) کوڈنگ جین، نیز کیلشیم فاسفیٹ طریقہ استعمال کرتے ہوئے AAV1 کیپسڈ پروٹین اور لوازماتی پروٹین پیکیجنگ پلازمیڈ پلاسمڈ کوڈنگ۔ خام وائرس سپرناٹینٹ کو خشک برف/ایتھانول غسل میں منجمد پگھلنے کے چکروں اور فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) میں لائزڈ سیلز کے ذریعے حاصل کیا گیا تھا۔ AAV ویکٹر کو منقطع iodixanol gradient ultracentrifugation (24 گھنٹے 32,000 rpm اور 4°C) کے ذریعے پاک کیا گیا تھا اور Amicon الٹرا 15 سینٹرفیوگل فلٹر کا استعمال کرتے ہوئے مرتکز کیا گیا تھا۔ AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 جینوم کاپی (GC)/ml] کا جینوم ٹائٹر، AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml)، AAV1-CAG-FLEX جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا پی سی آر ٹائم کی پیمائش (5) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) اور AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml)۔
پرائمری نیورانز کو آئس کولڈ 1x PBS میں کھرچ دیا گیا، پیلیٹ کیا گیا، اور پھر 0.5% Triton X-100 / 0.5% سوڈیم ڈوکسائیکولیٹ/PBS lysis بفر جس میں فاسفیٹیز اور پروٹیز انحیبیٹر (Roche) پر مشتمل ہے میں ہم آہنگ کیا گیا۔ پروٹین کی مقدار کا تعین bicinchonic acid پرکھ (تھرمو فشر سائنٹیفک) کے ذریعے کیا گیا۔ اس کے بعد پروٹینوں کو SDS-polyacrylamide جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے الگ کیا گیا، اور پھر پولی وینیلائیڈین فلورائیڈ جھلی (GE Healthcare) پر داغ دیا گیا۔ غیر مخصوص جگہوں کو بلاک کریں اور TBST میں 5% دودھ میں بنیادی اینٹی باڈی (تفصیلات کے لیے ٹیبل S1 دیکھیں) کے ساتھ انکیوبیٹ کریں (Tris-buffered saline with Tween)، دھونے کے مراحل اور TBST انکیوبیٹ میں سیکنڈری اینٹی باڈی۔ پرائمری اینٹی باڈی کے ساتھ رات بھر +4°C پر انکیوبیٹ کریں۔ دھونے کے بعد، کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے سیکنڈری اینٹی باڈی لگائیں۔ اس کے بعد، اسی دھبے کو اینٹی β-ایکٹین اینٹی باڈی کے ساتھ لگا کر، اسی لوڈنگ کی تصدیق ہوئی۔ chemiluminescence میں تبدیل کرکے اور chemiluminescence (GE Healthcare) کو بڑھا کر پتہ لگانا۔
شیشے کی کور سلپس پر پہلے سیڈ کیے گئے نیورونز کو 4% پیرافارمیلڈہائڈ (PFA)/PBS کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے مقرر کیا گیا تھا۔ کور سلپس کو پہلے کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے 0.1% Triton X-100/PBS کے ساتھ داخل کیا جاتا ہے، اور پھر بلاکنگ بفر [3% بووائن سیرم البومین (BSA)/PBS] میں۔ دوسرے دن، کور سلپس کو بلاک کرنے والے بفر سے دھویا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے مناسب فلوروفور کنجوگیٹڈ سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ آخر میں، نمونوں کو PBS میں 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) کے ساتھ اچھی طرح دھویا گیا اور پھر ایکوا پولی/ماؤنٹ کے ساتھ مائکروسکوپ سلائیڈ پر فکس کیا گیا۔
چوہوں (مرد اور مادہ) کو کیٹامین (130 ملی گرام/کلوگرام) اور زائلازین (10 ملی گرام/کلوگرام) کے انٹراپیریٹونیئل انجیکشن کے ذریعے بے ہوشی کی گئی اور کارپروفین ینالجیسک (5 ملی گرام/کلوگرام) کے ساتھ ذیلی طور پر دیا گیا، اور ایک دقیانوسی آلہ میں رکھا گیا۔ کھوپڑی کو بے نقاب کریں اور سیریبلر پرانتستا کے اس حصے کو پتلا کرنے کے لیے ڈینٹل ڈرل کا استعمال کریں جو مس بون سے مطابقت رکھتا ہے (لیمبڈا سے: ٹیل 1.8، لیٹرل 1، lobules IV اور V کے مطابق)۔ کھوپڑی میں احتیاط سے ایک چھوٹا سا سوراخ بنانے کے لیے خمیدہ سرنج کی سوئی کا استعمال کریں تاکہ نیچے کی ویسکولیچر میں خلل نہ پڑے۔ پھر پتلی کھینچی ہوئی شیشے کی کیپلیری کو آہستہ آہستہ مائیکرو ہول میں داخل کیا جاتا ہے (ڈورا میٹر کے وینٹرل سائیڈ پر -1.3 سے -1 تک) اور 200 سے 300 این ایل اے اے وی کو مائیکرو انجیکٹر (ناریشیج) میں دستی سرنجوں (ناریشیج) کے ساتھ ونڈو 1 سے 1 منٹ کے کم دباؤ پر کئی بار لگایا جاتا ہے۔ انفیوژن کے بعد، کیپلیری کو مزید 10 منٹ کے لیے رکھیں تاکہ وائرس مکمل طور پر پھیل جائے۔ کیپلیریاں نکالنے کے بعد، زخم کی سوزش کو کم کرنے اور جانور کو صحت یاب ہونے دینے کے لیے جلد کو احتیاط سے سیون کیا جاتا ہے۔ آپریشن کے بعد کئی دنوں تک ان جانوروں کو ینالجیسک (کاسپوفین) کے ساتھ علاج کیا گیا، اس دوران ان کی جسمانی حالت کا بغور جائزہ لیا گیا اور پھر انہیں مقررہ وقت پر موت کے گھاٹ اتار دیا گیا۔ تمام طریقہ کار یورپی، قومی اور ادارہ جاتی رہنما خطوط کے مطابق کیے گئے تھے اور ان کی منظوری Umwelt اور Verbraucherschutz، North Rhine-Westphalia، Germany کے LandesamtfürNatur نے دی تھی۔
جانوروں کو کیٹامین (100 mg/kg) اور xylazine (10 mg/kg) سے بے ہوشی کی گئی، اور دل کو پہلے 0.1 M PBS کے ساتھ، اور پھر PBS میں 4% PFA کے ساتھ پرفیوز کیا گیا۔ ٹشو کو الگ کر کے 4% PFA/PBS میں راتوں رات 4 ° C پر طے کیا گیا۔ ایک ہلنے والا چاقو (Leica Microsystems GmbH، ویانا، آسٹریا) PBS میں فکسڈ دماغ سے sagittal حصے (50 μm موٹا) تیار کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا گیا ہو، کمرے کے درجہ حرارت اور ہلچل پر اوپر (13) بیان کیے گئے فری فلوٹنگ حصوں کا داغ لگانا انجام دیا گیا۔ مختصراً، سب سے پہلے، حاصل شدہ ٹکڑوں کو 0.5% Triton X-100/PBS کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لیے پارمیبلائز کیا گیا۔ کچھ ایپیٹوپس (Pcx اور Shmt2) کے لیے، tris-EDTA بفر میں 80°C (PH 9) کے ذریعے سلائسز کو 25 منٹ کے لیے اس قدم کے بجائے گرم کریں۔ اس کے بعد، حصوں کو پرائمری اینٹی باڈی (ٹیبل S1 دیکھیں) کے ساتھ بلاکنگ بفر (3٪ BSA/PBS) میں رات بھر ہلچل کے ساتھ 4 ° C پر لگایا گیا تھا۔ اگلے دن، حصوں کو بلاک کرنے والے بفر سے دھویا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے مناسب فلوروفور کنجوگیٹڈ سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ آخر میں، حصوں کو PBS میں اچھی طرح سے دھویا گیا، DAPI کے ساتھ کاؤنٹر سٹینڈ کیا گیا، اور پھر ایکوا پولی ماؤنٹ کے ساتھ مائکروسکوپ سلائیڈ پر ٹھیک کیا گیا۔
ایک لیزر اسکیننگ کنفوکل مائیکروسکوپ (TCS SP8-X یا TCS ڈیجیٹل لائٹ شیٹ، Leica Microsystems) ایک سفید لائٹ لیزر سے لیس اور 405 ڈایڈڈ الٹرا وائلٹ لیزر نمونے کی تصویر کشی کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ فلوروفور کو پرجوش کرکے اور ہائبرڈ ڈیٹیکٹر (HyDs) کے ساتھ سگنل اکٹھا کرکے، LAS-X سافٹ ویئر کو ترتیب وار انداز میں Nyquist نمونے لینے کے مطابق اسٹیک شدہ تصاویر کو اکٹھا کرنے کے لیے استعمال کیا گیا: غیر مقداری پینلز کے لیے، یہ انتہائی متحرک سگنلز ہیں (مثال کے طور پر، سومٹک سیلز اور ڈینڈریٹس کا پتہ لگانے کے لیے PYD کی تعداد میں) برائٹ آر موڈ)۔ پس منظر کو کم کرنے کے لیے 0.3 سے 6 این ایس تک گیٹنگ لگائی جاتی ہے۔
ترتیب شدہ خلیوں کی ریئل ٹائم امیجنگ۔ Neurobasal-A میڈیم میں چھانٹنے کے بعد جس میں 1% B27 سپلیمنٹ اور 0.5 mM GlutaMax ہوتا ہے، سیلز کو فوری طور پر پولی-l-lysine-coated گلاس سلائیڈوں پر سیڈ کیا جاتا ہے (μ-Slide8 Well, Ibidi، کیٹلاگ نمبر 80826)، اور پھر اسے 37 °C تک سیلز کو 37 °C پر رکھیں اور سیلز کو 37 °C سے %5 تک رہنے دیں۔ ریئل ٹائم امیجنگ لائیکا SP8 لیزر اسکیننگ کنفوکل مائکروسکوپ پر کی گئی تھی جو سفید لیزر، HyD، 63×[1.4 عددی یپرچر (NA)] آئل آبجیکٹیو لینس اور ہیٹنگ اسٹیج سے لیس تھی۔
ماؤس کو کاربن ڈائی آکسائیڈ کے ساتھ جلدی سے بے ہوشی کی گئی اور سر کاٹ دیا گیا، دماغ کو جلد سے کھوپڑی سے ہٹا دیا گیا، اور 200μm موٹی (13C لیبلنگ کے تجربے کے لیے) یا 275μm موٹی (دو فوٹون تجربات کے لیے) سیجٹل سیکشن میں کاٹ دیا گیا جو درج ذیل مواد سے بھرا ہوا ہے، آئس کریم (HM-650، جرمن فلڈ، ایف ایم، 650) ہے مندرجہ ذیل مادوں کے ساتھ: 125 ایم ایم آئس کولڈ، کاربن سیچوریٹڈ (95% O2 اور 5% CO2) کم Ca2 + مصنوعی سیریبرو اسپائنل فلوئیڈ (ACSF) NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڈیم فاسفیٹ بفر، 25MC250، NaC250mco mM CaCl2 اور 3.5 mM MgCl2 (310 سے 330 mmol کا آسموٹک دباؤ)۔ حاصل شدہ دماغ کے ٹکڑوں کو ایک پری انکیوبیشن چیمبر میں منتقل کریں جس میں زیادہ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڈیم فاسفیٹ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-gluco m.2 M.C. MgCl2) میڈیم) پی ایچ 7.4 اور 310 سے 320 ملی میٹر)۔
امیجنگ کے عمل کے دوران، سلائسز کو ایک وقف شدہ امیجنگ روم میں منتقل کیا گیا، اور تجربہ مسلسل ACSF پرفیوژن کے تحت 32 ° سے 33 ° C کے مستقل درجہ حرارت پر کیا گیا۔ ایک ملٹی فوٹون لیزر اسکیننگ مائیکروسکوپ (TCS SP8 MP-OPO، Leica Microsystems) جس میں Leica 25x آبجیکٹیو لینس (NA 0.95، water)، Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II، Coherent) کو سلائس امیجنگ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ FLIM ماڈیول (PicoHarp300، PicoQuant)۔
Grx1-roGFP2 کا FLIM۔ PNs کی سائٹوپلاسمک ریڈوکس حالت میں تبدیلیوں کو دو فوٹون FLIM کے ذریعے ساگیٹل دماغ کے ٹکڑوں میں ماپا گیا، جہاں Grx1-roGFP2 بائیوسینسر نے PNs کو نشانہ بنایا۔ PN پرت میں، حصول کے میدان کو سلائس کی سطح سے تقریباً 50 سے 80 μm نیچے منتخب کیا جاتا ہے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ ایک قابل عمل PN موجود ہے (یعنی ڈینڈرائٹس کے ساتھ موتیوں کے ڈھانچے کی کمی یا نیورونل مورفولوجیکل تبدیلیاں) اور ڈبل مثبت roGFP2 سینسر اور AAV انکوڈنگ shRNA PCx یا اس کا کنٹرول machexs-controle 2x ڈیجیٹل زوم کے ساتھ سنگل اسٹیک امیجز جمع کریں [حوصلہ افزائی طول موج: 890 این ایم؛ 512 nm 512 پکسلز]۔ پتہ لگانا: اندرونی HyD، fluorescein isothiocyanate (FITC) فلٹر گروپ] اور 2 سے 3 منٹ کے اندر تصویر کی اوسط کا استعمال اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کیا جاتا ہے کہ وکر فٹنگ کے لیے کافی فوٹون (مجموعی طور پر 1000 فوٹونز) اکٹھے کیے گئے ہیں۔ Grx1-roGFP2 تحقیقات کی حساسیت اور FLIM حالات کی توثیق roGFP2 کی عمر کی قیمت کی نگرانی کے ذریعے کی گئی تھی جب پرفیوژن ACSF میں exogenous 10 mM H2O2 شامل کیا گیا تھا (زیادہ سے زیادہ آکسیڈیشن، جس کے نتیجے میں عمر میں اضافہ ہوتا ہے)، اور پھر 2 ملی میٹر (2 ملی میٹر) کا اضافہ کیا گیا تھا۔ عمر میں کمی) (شکل S8، D سے G)۔ حاصل شدہ نتائج کا تجزیہ کرنے کے لیے FLIMfit 5.1.1 سافٹ ویئر کا استعمال کریں، پوری تصویر کے واحد کفایتی کشی وکر کو ناپے ہوئے IRF (انسٹرومینٹ ریسپانس فنکشن) میں فٹ کریں، اور χ2 تقریباً 1 ہے۔ ایک PN کی زندگی کا حساب لگانے کے لیے، عصبی جسم کے ارد گرد ماسک کو دستی طور پر استعمال کیا گیا تھا، اور اوسطاً ہر وقت کے لیے mask کا استعمال کیا گیا تھا۔
مائٹوکونڈریل ممکنہ تجزیہ۔ ایکیوٹ سیکشن کو 100 nM TMRM کے ساتھ 30 منٹ کے لیے براہ راست perfused ACSF میں شامل کرنے کے بعد، PNs کی مائٹوکونڈریل ممکنہ تبدیلیوں کو دو فوٹون مائکروسکوپ سے ماپا گیا۔ TMRM امیجنگ 920 nm پر تحقیقات کو پرجوش کرکے اور اندرونی HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) کا استعمال کرتے ہوئے سگنل جمع کرنے کے لیے کی گئی تھی۔ ایک ہی اتیجیت طول موج کا استعمال کرتے ہوئے لیکن mtYFP کی تصویر بنانے کے لیے ایک مختلف اندرونی HyD (FITC :525/50) استعمال کرکے۔ سنگل سیل کی سطح پر مائٹوکونڈریل صلاحیت کا جائزہ لینے کے لیے امیج جے کے امیج کیلکولیٹر پلگ ان کا استعمال کریں۔ مختصراً، پلگ ان مساوات: سگنل = منٹ (mtYFP, TMRM) کا استعمال مائٹوکونڈریل خطے کی شناخت کے لیے کیا جاتا ہے جو متعلقہ چینل کے سنگل اسٹیک کنفوکل امیج میں پورکنجے صومالی میں TMRM سگنل دکھاتا ہے۔ اس کے بعد نتیجے میں آنے والے ماسک میں پکسل ایریا کی مقدار درست کی جاتی ہے، اور پھر مائٹوکونڈریل پوٹینشل کو ظاہر کرنے والے مائٹوکونڈریل فریکشن کو حاصل کرنے کے لیے mtYFP چینل کے متعلقہ تھریشولڈ سنگل اسٹیک امیج پر نارمل کیا جاتا ہے۔
تصویر کو Huygens Pro (سائنٹیفک والیوم امیجنگ) سافٹ ویئر کے ساتھ ڈی کنولوٹ کیا گیا تھا۔ ٹائلوں کی اسکین شدہ تصویروں کے لیے، LAS-X سافٹ ویئر کے ذریعے فراہم کردہ خودکار سلائی الگورتھم کا استعمال کرتے ہوئے ایک ٹائل کا مانٹیج بنایا گیا ہے۔ امیج کیلیبریشن کے بعد، امیج کو مزید پروسیس کرنے کے لیے امیج جے اور ایڈوب فوٹوشاپ کا استعمال کریں اور چمک اور کنٹراسٹ کو یکساں طور پر ایڈجسٹ کریں۔ گرافک تیاری کے لیے ایڈوب السٹریٹر کا استعمال کریں۔
mtDNA فوکس تجزیہ۔ کنفوکل مائکروسکوپ کے ذریعہ ڈی این اے کے خلاف اینٹی باڈیز کے لیبل والے سیریبلر حصوں پر ایم ٹی ڈی این اے گھاووں کی تعداد کی مقدار طے کی گئی۔ ہر ٹارگٹ ایریا سیل باڈی اور ہر سیل کے نیوکلئس کے لیے بنایا گیا تھا، اور ملٹی میجر پلگ ان (ImageJ سافٹ ویئر) کا استعمال کرتے ہوئے متعلقہ علاقے کا حساب لگایا گیا تھا۔ سائٹوپلاسمک ایریا حاصل کرنے کے لیے جوہری علاقے کو سیل باڈی ایریا سے گھٹائیں۔ آخر میں، اینالیز پارٹیکلز پلگ ان (امیج جے سافٹ ویئر) کا استعمال خود بخود سائٹوپلاسمک ڈی این اے پوائنٹس کی مقدار درست کرنے کے لیے کیا گیا جو کہ تھریشولڈ امیج پر ایم ٹی ڈی این اے کی نشاندہی کرتا ہے، اور حاصل کردہ نتائج کو CTRL چوہوں کی PN اوسط پر معمول بنایا گیا۔ نتائج کو فی سیل نیوکلیوسائیڈز کی اوسط تعداد کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔
پروٹین کے اظہار کا تجزیہ۔ واحد سیل کی سطح پر PN میں پروٹین کے اظہار کا اندازہ کرنے کے لیے ImageJ کے امیج کیلکولیٹر پلگ ان کا استعمال کریں۔ مختصراً، متعلقہ چینل کی سنگل لیئر کنفوکل امیج میں، مساوات کے ذریعے: سگنل = منٹ (mtYFP، اینٹی باڈی)، مائٹوکونڈریل علاقہ جو پورکینا میں کسی مخصوص اینٹی باڈی کے لیے مدافعتی صلاحیت کو ظاہر کرتا ہے۔ پھر نتیجے میں آنے والے ماسک میں پکسل ایریا کی مقدار درست کی جاتی ہے، اور پھر دکھائے گئے پروٹین کے مائٹوکونڈریل فریکشن کو حاصل کرنے کے لیے mtYFP چینل کے متعلقہ تھریشولڈ سنگل اسٹیک امیج پر نارمل کیا جاتا ہے۔
پورکنجے سیل کثافت کا تجزیہ۔ امیج جے کے سیل کاؤنٹر پلگ ان کا استعمال پورکنجے کی کثافت کا اندازہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا جس کی گنتی شدہ سیلوں کے زیر قبضہ سیریبلر رنگ کی لمبائی سے شمار کیے جانے والے پورکنجے خلیوں کی تعداد کو تقسیم کیا گیا تھا۔
نمونے کی تیاری اور جمع کرنا۔ کنٹرول گروپ اور Mfn2cKO چوہوں کے دماغوں کو 0.1 M فاسفیٹ بفر (PB) میں 2% PFA/2.5% glutaraldehyde میں طے کیا گیا تھا، اور پھر coronal حصوں کو ciliates (Leica Mikrosystem GmbH، ویانا، آسٹریا) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ 1% os tetraoxide اور 1.5% پوٹاشیم فیروکیانائیڈ میں کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے۔ حصوں کو آست پانی سے تین بار دھویا گیا، اور پھر 20 منٹ تک 70٪ ایتھنول کے ساتھ 1٪ یورینیل ایسیٹیٹ کے ساتھ داغ دیا گیا۔ اس کے بعد حصوں کو درجہ بندی شدہ الکحل میں پانی کی کمی کی گئی اور سلکان لیپت شیشے کی سلائیڈوں کے درمیان Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (الیکٹران مائیکروسکوپی سائنسز، کیٹلاگ نمبر 14040) میں سرایت کر دی گئی، اور آخر میں 60 ° C پر 48 گھنٹوں کے لیے اوون میں پولیمرائز کر دیا گیا۔ سیریبلر کارٹیکس ایریا کا انتخاب کیا گیا تھا اور لائیکا الٹرا کٹ (لائیکا میکروسیسٹیم جی ایم بی ایچ، ویانا، آسٹریا) پر 50 این ایم الٹراتھین حصے کاٹے گئے تھے اور پولی اسٹیرین فلم کے ساتھ 2×1 ملی میٹر کاپر سلٹ گرڈ پر اٹھایا گیا تھا۔ حصوں کو 10 منٹ کے لیے H2O میں 4% uranyl acetate کے محلول سے داغ دیا گیا، کئی بار H2O سے دھویا گیا، پھر 10 منٹ کے لیے H2O میں رینالڈز لیڈ سائٹریٹ کے ساتھ، اور پھر H2O سے کئی بار دھویا گیا۔ TVIPS (Tietz ویڈیو اور امیج پروسیسنگ سسٹم) TemCam-F416 ڈیجیٹل کیمرہ (TVIPS GmbH, Gauting, USA) کا استعمال کرتے ہوئے ایک ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) کے ساتھ مائیکروگرافس لیے گئے تھے۔ جرمنی)۔
AAV سے متاثرہ چوہوں کے لیے، دماغ کو الگ کر کے 1 ملی میٹر موٹی سیگیٹل سیکشن میں کاٹا گیا تھا، اور AAV سے متاثرہ انگوٹھی (یعنی mCherry ایکسپریسنگ) کی شناخت کے لیے فلوروسینس مائیکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے سیریبیلم کا معائنہ کیا گیا تھا۔ صرف ایسے تجربات جن میں AAV انجیکشن کے نتیجے میں Purkinje سیل کی تہہ (یعنی تقریباً پوری تہہ) کی کم از کم دو لگاتار سیریبلر رِنگز میں بہت زیادہ نقل و حمل کی کارکردگی ہوتی ہے۔ AAV- transduced لوپ کو راتوں رات پوسٹ فکسیشن (0.1 M کوکویٹ بفر میں 4% PFA اور 2.5% glutaraldehyde) کے لیے مائیکرو ڈسیکٹ کیا گیا اور مزید کارروائی کی گئی۔ EPON ایمبیڈنگ کے لیے، فکسڈ ٹشو کو 0.1 M سوڈیم کوکویٹ بفر (Aplichem) سے دھویا گیا، اور 0.1 M سوڈیم کوکویٹ بفر (Aplichem) میں 2% OsO4 (os، Science Services؛ Caco) کے ساتھ 4 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا، پھر 2 گھنٹے تک دھویا گیا۔ 0.1 M کوکامائیڈ بفر کے ساتھ 3 بار دہرائیں۔ اس کے بعد، ایتھنول کی چڑھتی ہوئی سیریز کا استعمال ہر ایتھنول محلول کو 4 ° C پر 15 منٹ تک ٹشو کو پانی کی کمی کے لیے انکیوبیٹ کرنے کے لیے کیا گیا۔ ٹشو کو پروپیلین آکسائیڈ میں منتقل کیا گیا اور EPON (Sigma-Aldrich) میں 4 ° C پر راتوں رات انکیوبیٹ کیا گیا۔ ٹشو کو تازہ EPON میں کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے رکھیں، اور پھر اسے 72 گھنٹے کے لیے 62 ° C پر ایمبیڈ کریں۔ الٹرا مائیکروٹوم (Leica Microsystems, UC6) اور ایک ڈائمنڈ نائف (Diatome, Biel, Switzerland) کا استعمال کریں تاکہ 70 nm الٹراتھین حصوں کو کاٹیں، اور 1.5% uranyl acetate سے 37°C پر 15 منٹ تک داغ دیں، اور لیڈ سائٹریٹ کے محلول سے 4 منٹ تک داغ دیں۔ الیکٹران مائکروگراف JEM-2100 پلس ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکروسکوپ (JEOL) کا استعمال کرتے ہوئے لیا گیا تھا جو کیمرہ OneView 4K 16-bit (Gatan) اور DigitalMicrograph سافٹ ویئر (Gatan) سے لیس تھا۔ تجزیہ کے لیے، الیکٹران مائیکرو گراف 5000× یا 10,000× ڈیجیٹل زوم کے ساتھ حاصل کیے گئے تھے۔
مائٹوکونڈریا کا مورفولوجیکل تجزیہ۔ تمام تجزیوں کے لیے، امیج جے سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے ڈیجیٹل امیجز میں انفرادی مائٹوکونڈریا کی شکل دستی طور پر بیان کی گئی تھی۔ مختلف مورفولوجیکل پیرامیٹرز کا تجزیہ کیا جاتا ہے۔ مائٹوکونڈریل کثافت کو ہر خلیے کے کل مائٹوکونڈریل ایریا کو سائٹوپلازم ایریا (سائٹوپلازم ایریا = سیل ایریا-سیل نیوکلئس ایریا) × 100 سے تقسیم کر کے حاصل کردہ فیصد کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ مائٹوکونڈریا کی گول پن کا حساب فارمولہ [4π∙/ameter](aremeter) سے کیا جاتا ہے۔ مائٹوکونڈریا کی اسٹا مورفولوجی کا تجزیہ کیا گیا اور ان کی اہم شکلوں کے مطابق دو قسموں ("نلی نما" اور "چھالے") میں تقسیم کیا گیا۔
آٹوفاگوزوم/لائسوسوم نمبر اور کثافت کا تجزیہ۔ ڈیجیٹل امیج میں ہر آٹوفاگوسم/لائسوسوم کی شکل کو دستی طور پر خاکہ بنانے کے لیے امیج جے سافٹ ویئر کا استعمال کریں۔ آٹوفاگوزوم/لائسوسوم ایریا کو فی صد کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے جس کا حساب ہر سیل کے کل آٹوفاگوزوم/لائسوسوم ڈھانچے کے رقبے کو سائٹوپلازم ایریا (سائٹوپلازم ایریا= سیل ایریا-نیوکلئس ایریا) × 100 سے کیا جاتا ہے۔ آٹوفاگوزوم/لائسوزوم کی کثافت کا حساب کل تعداد کو فی سیل آٹوفاگوزوم/لائسوسوم ڈھانچے کی تعداد سے تقسیم کر کے لگایا جاتا ہے (سائٹوپلاسمک ایریا کے لحاظ سے) (سائٹوپلاسمک ایریا = سیل ایریا-نیوکلیئر ایریا)۔
شدید سیکشننگ اور نمونے کی تیاری کے لیے لیبلنگ۔ ایسے تجربات کے لیے جن کے لیے گلوکوز لیبلنگ کی ضرورت ہوتی ہے، دماغ کے شدید ٹکڑوں کو پری انکیوبیشن چیمبر میں منتقل کریں، جس میں سیر شدہ کاربن (95% O2 اور 5% CO2)، ہائی Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڈیم mH3، phos، 1.25 ایم ایم سوڈیم، 50 ایم پی ایچ) 25.0 mM d-گلوکوز، 1.0 mM CaCl 2 اور 2.0 mM MgCl 2، pH 7.4 اور 310 سے 320 mOsm میں ایڈجسٹ کیا گیا، جس میں گلوکوز 13 C 6- گلوکوز متبادل (Eurisotop، کیٹلاگ نمبر 19 CL)۔ ایسے تجربات کے لیے جن کے لیے پائروویٹ لیبلنگ کی ضرورت ہوتی ہے، دماغ کے شدید ٹکڑوں کو اعلیٰ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڈیم فاسفیٹ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM، d-gluM20M Ca20m اور Add. MgCl2، pH 7.4 اور 310 سے 320mOsm میں ایڈجسٹ کریں، اور 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop، کیٹلاگ نمبر CLM-1082) شامل کریں۔ حصوں کو 37 ° C پر 90 منٹ تک سینکیں۔ تجربے کے اختتام پر، حصوں کو 75 ایم ایم امونیم کاربونیٹ پر مشتمل ایک آبی محلول (pH 7.4) سے جلدی سے دھویا گیا، اور پھر 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): میتھانول: پانی میں ہم آہنگ کیا گیا۔ حصوں کو برف پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کرنے کے بعد، نمونوں کو 21,000 گرام پر 10 منٹ کے لیے 4 ° C پر سینٹرفیوج کیا گیا، اور واضح سپرنٹینٹینٹ کو اسپیڈ ویک کنسنٹریٹر میں خشک کیا گیا۔ نتیجے میں خشک میٹابولائٹ گولی کو تجزیہ تک -80 ° C پر ذخیرہ کیا گیا تھا۔
مائع کرومیٹوگرافی - 13 سی لیبل والے امینو ایسڈز کا ماس سپیکٹرومیٹری تجزیہ۔ مائع کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹومیٹری (LC-MS) کے تجزیہ کے لیے، میٹابولائٹ گولی کو 75μl LC-MS گریڈ کے پانی (ہنی ویل) میں دوبارہ معطل کر دیا گیا تھا۔ 4°C پر 5 منٹ کے لیے 21,000 g پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، واضح شدہ سپرنٹنٹ کا 20 μl امینو ایسڈ فلوکس تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا، جب کہ بقیہ نچوڑ فوری طور پر anion تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا (نیچے ملاحظہ کریں)۔ امینو ایسڈ کا تجزیہ پہلے بیان کردہ بینزول کلورائڈ ڈیریویٹائزیشن پروٹوکول (55، 56) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ پہلے مرحلے میں، 10μl کا 100 mM سوڈیم کاربونیٹ (Sigma-Aldrich) 20μl میٹابولائٹ ایکسٹریکٹ میں شامل کیا گیا، اور پھر LC گریڈ ACN میں 10μl 2% بینزوئیل کلورائیڈ (سگما-الڈرچ) شامل کیا گیا۔ نمونے کو مختصر طور پر گھمایا گیا اور پھر 20 ° C پر 5 منٹ کے لیے 21,000 g پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ مخروطی شیشے کے داخل (200 μl والیوم) کے ساتھ صاف شدہ سپرنٹنٹ کو 2 ملی لیٹر آٹو سیمپلر شیشی میں منتقل کریں۔ Q-Exactive (QE) -HF (الٹرا ہائی فیلڈ آربٹریپ) ہائی ریزولوشن پریزیشن ماس سپیکٹرومیٹر (تھرمو فشر سائنٹیفک) سے منسلک ایکویٹی iClass الٹرا ہائی پرفارمنس ایل سی سسٹم (واٹرس) کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں کا تجزیہ کیا گیا۔ تجزیہ کے لیے، اخذ کردہ نمونے کے 2μl کو 1.8μm ذرات پر مشتمل 100×1.0 ملی میٹر اعلیٰ طاقت والے سلیکا T3 کالم (پانی) میں لگایا گیا تھا۔ بہاؤ کی شرح 100μl/منٹ ہے، اور بفر سسٹم بفر A (10 mM امونیم فارمیٹ اور پانی میں 0.15% فارمک ایسڈ) اور بفر B (ACN) پر مشتمل ہے۔ میلان درج ذیل ہے: 0%B 0 منٹ پر؛ 0%B 0 سے 0.1 منٹ پر 0 سے 15٪ B؛ 0.1 سے 0.5 منٹ پر 15 سے 17٪ B؛ B 17 سے 55% پر 0.5 سے 14 منٹ پر؛ B 55 سے 70% 14 سے 14.5 منٹ پر؛ 18 منٹ پر 14.5 سے 70 سے 100٪ B پر؛ 18 سے 19 منٹ پر 100٪ B؛ 19 سے 19.1 منٹ پر 100 سے 0% B؛ 0% B 19.1 سے 28 منٹ پر (55, 56)۔ QE-HF ماس اسپیکٹومیٹر مثبت آئنائزیشن موڈ میں m/z (ماس/چارج ریشو) 50 سے 750 کے بڑے پیمانے پر کام کرتا ہے۔ لاگو ریزولوشن 60,000 ہے، اور حاصل کردہ گین کنٹرول (AGC) آئن ہدف 3×106 ہے، اور زیادہ سے زیادہ آئن ٹائم 100 ملی سیکنڈ ہے۔ گرم الیکٹرو سپرے آئنائزیشن (ESI) ذریعہ 3.5 kV کے سپرے وولٹیج، 250 ° C کے کیپلیری درجہ حرارت، 60 AU (منمانی یونٹس) کے میان ہوا کا بہاؤ، اور 20 AU کے معاون ہوا کے بہاؤ پر کام کرتا ہے۔ 250°C ایس لینس 60 AU پر سیٹ ہے۔
13C لیبل والے نامیاتی تیزاب کا anion chromatography-MS تجزیہ۔ بقیہ میٹابولائٹ پریپیٹیٹ (55μl) کا تجزیہ Dionex آئن کرومیٹوگرافی سسٹم (ICS 5000+، تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا جو ایک QE-HF ماس اسپیکٹومیٹر (تھرمو فشر سائنٹیفک) سے منسلک ہے۔ مختصراً، 5μl میٹابولائٹ ایکسٹریکٹ کو ایک Dionex IonPac AS11-HC کالم میں HPLC (2 mm×250 mm، پارٹیکل سائز 4μm، تھرمو فشر سائنٹیفک) میں پش ان پارشل لوپ موڈ میں داخل کیا گیا جس کا فلنگ ریشو 1. AGguard11-Donac. (2 ملی میٹر x 50 ملی میٹر، 4μm، تھرمو فشر سائنٹیفک)۔ کالم کا درجہ حرارت 30 ° C پر برقرار رکھا جاتا ہے، اور آٹو سیمپلر کو 6 ° C پر سیٹ کیا جاتا ہے۔ الیونٹ جنریٹر کے ذریعے پوٹاشیم ہائیڈرو آکسائیڈ گریڈینٹ پیدا کرنے کے لیے ڈیونائزڈ پانی کے ساتھ فراہم کردہ پوٹاشیم ہائیڈرو آکسائیڈ کارتوس استعمال کریں۔ 380μl/منٹ کی بہاؤ کی شرح پر میٹابولائٹس کی علیحدگی، درج ذیل گریڈینٹ کا اطلاق: 0 سے 3 منٹ، 10 ایم ایم KOH؛ 3 سے 12 منٹ، 10 سے 50 ایم ایم کوہ؛ 12 سے 19 منٹ، 50 سے 100 ایم ایم کوہ؛ 19 سے 21 منٹ، 100 ایم ایم کوہ؛ 21 سے 21.5 منٹ، 100 سے 10 ایم ایم کوہ۔ کالم کو 8.5 منٹ کے لیے 10 mM KOH کے تحت دوبارہ متوازن کیا گیا تھا۔
ایلیوٹڈ میٹابولائٹس کو کالم کے بعد 150μl/min isopropanol سپلیمنٹ سٹریم کے ساتھ ملایا جاتا ہے اور پھر منفی آئنائزیشن موڈ میں کام کرنے والے ہائی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹر کی طرف جاتا ہے۔ MS 60,000 کے ریزولوشن کے ساتھ m/z 50 سے 750 تک بڑے پیمانے پر رینج کی نگرانی کر رہا ہے۔ AGC 1×106 پر سیٹ کیا گیا ہے، اور زیادہ سے زیادہ آئن ٹائم 100 ms پر رکھا گیا ہے۔ گرم ESI ذریعہ 3.5 kV کے سپرے وولٹیج پر چلایا جاتا تھا۔ آئن سورس کی دیگر سیٹنگیں حسب ذیل ہیں: کیپلیری درجہ حرارت 275 °C؛ میان گیس کا بہاؤ، 60 AU؛ معاون گیس کا بہاؤ، 300 ° C پر 20 AU، اور S لینس کی ترتیب 60 AU پر۔
13C لیبل والے میٹابولائٹس کا ڈیٹا تجزیہ۔ آاسوٹوپ تناسب کے ڈیٹا کے تجزیہ کے لیے ٹریس فائنڈر سافٹ ویئر (ورژن 4.2، تھرمو فشر سائنٹیفک) استعمال کریں۔ ہر کمپاؤنڈ کی شناخت کی تصدیق ایک قابل اعتماد حوالہ کمپاؤنڈ سے کی گئی اور آزادانہ طور پر تجزیہ کیا گیا۔ آاسوٹوپ افزودگی کا تجزیہ کرنے کے لیے، ہر 13C آاسوٹوپ (Mn) کے نکالے گئے آئن کرومیٹوگرام (XIC) کا رقبہ [M + H] + سے نکالا گیا تھا، جہاں n ہدف والے مرکب کا کاربن نمبر ہے، جو امینو ایسڈ کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے یا [MH] + anions کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ XIC کی بڑے پیمانے پر درستگی پانچ حصوں فی ملین سے کم ہے، اور RT کی درستگی 0.05 منٹ ہے۔ افزودگی کا تجزیہ متعلقہ کمپاؤنڈ کے تمام آاسوٹوپس کے مجموعے سے ہر ایک پائے جانے والے آاسوٹوپ کے تناسب کا حساب لگا کر کیا جاتا ہے۔ یہ تناسب ہر ایک آاسوٹوپ کے لیے فیصد کی قدروں کے طور پر دیے جاتے ہیں، اور نتائج کو داڑھ پرسنٹ افزودگی (MPE) کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (42)۔
منجمد نیوران گولی کو 80% میتھانول (v/v) میں یکساں بنایا گیا تھا، بھنور بنا ہوا تھا، اور 30 ​​منٹ تک -20 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ نمونے کو دوبارہ بھنور بنائیں اور 30 ​​منٹ تک +4 ° C پر ہلائیں۔ نمونے کو 21,000 g پر 5 منٹ کے لیے 4 ° C پر سینٹرفیوج کیا گیا تھا، اور پھر نتیجے میں آنے والے سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا تھا اور بعد کے تجزیہ کے لیے 25 ° C پر SpeedVac concentrator کا استعمال کرتے ہوئے خشک کیا گیا تھا۔ جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، LC-MS تجزیہ ترتیب شدہ خلیوں کے امینو ایسڈ پر کیا گیا تھا۔ ٹریس فائنڈر (ورژن 4.2، تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے، ڈیٹا کا تجزیہ ہر کمپاؤنڈ کے مونوسوٹوپک ماس کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ میٹابولائٹ ڈیٹا کی کوانٹائل نارملائزیشن پری پروسیس کور سافٹ ویئر پیکج (57) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔
سلائس کی تیاری۔ ماؤس کو کاربن ڈائی آکسائیڈ کے ساتھ جلدی سے بے ہوشی کی گئی اور سر کاٹ دیا گیا، دماغ کو جلد سے کھوپڑی سے نکال دیا گیا، اور برف سے بھرے ہلنے والے چاقو (HM-650 V، تھرمو فشر سائنٹیفک، والڈورف، جرمنی) کو اسے 300 سے 375 μm میں کاٹنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ CO2) کم Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڈیم فاسفیٹ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گلوکوز، 1.0 mM CaCl2 اور 6.0 mM سے 7.0mM سے 7.00 تک Adv. 330 ایم او ایس ایم)۔ حاصل شدہ دماغی ٹکڑوں کو ایک چیمبر میں منتقل کریں جس میں زیادہ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوڈیم فاسفیٹ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-glucose، 4. mCm d-glucose، 4.mCl20mc اور 4. پی ایچ 7.4 اور 310 سے 320 ایم او ایس ایم)۔ سلائسوں کو 20 سے 30 منٹ تک ذخیرہ کریں تاکہ ریکارڈنگ سے پہلے انہیں بحال کیا جا سکے۔
ریکارڈنگ تمام ریکارڈنگ کے لیے ایک فکسڈ ریکارڈنگ چیمبر اور 20x واٹر وسرجن آبجیکٹیو لینس (سائنٹیفیکا) سے لیس ایک مائکروسکوپ اسٹیج استعمال کیا گیا تھا۔ پوٹیٹیو پورکنجی خلیوں کی شناخت (i) جسم کے سائز، (ii) سیربیلم کے جسمانی مقام، اور (iii) فلوروسینٹ mtYFP رپورٹر جین کے اظہار سے ہوئی۔ 5 سے 11 megohms کی ٹپ ریزسٹنس کے ساتھ پیچ پائپیٹ کو بوروسیلیکیٹ گلاس کیپلیری (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) اور ایک افقی پائپیٹ انسٹرومنٹس (P-100), Sutterva, No. تمام ریکارڈنگز ELC-03XS npi پیچ کلیمپ یمپلیفائر (npi الیکٹرانک GmbH، Tam، Germany) کے ذریعے کی گئیں، جسے سافٹ ویئر سگنل (ورژن 6.0، کیمبرج الیکٹرانک، کیمبرج، یو کے) کے ذریعے کنٹرول کیا گیا تھا۔ تجربہ 12.5 کلو ہرٹز کے نمونے لینے کی شرح پر ریکارڈ کیا گیا تھا۔ سگنل کو بالترتیب 1.3 اور 10 kHz کی کٹ آف فریکوئنسی کے ساتھ دو شارٹ پاس بیسل فلٹرز کے ساتھ فلٹر کیا جاتا ہے۔ جھلی اور پائپیٹ کی اہلیت کو یمپلیفائر کا استعمال کرتے ہوئے معاوضہ سرکٹ کے ذریعہ معاوضہ دیا جاتا ہے۔ تمام تجربات Orca-Flash 4.0 کیمرے (Hamamatsu, Gerden, Germany) کے کنٹرول میں کیے گئے، جسے Hokawo سافٹ ویئر (ورژن 2.8، Hamamatsu، Gerden، Germany) کے ذریعے کنٹرول کیا گیا۔
روٹین پورے سیل کی ترتیب اور تجزیہ۔ ریکارڈنگ سے فوراً پہلے، پائپیٹ کو اندرونی محلول سے بھریں جس میں درج ذیل مادّہ ہوں: 4.0 mM KCl، 2.0 mM NaCl، 0.2 mM EGTA، 135.0 mM پوٹاشیم گلوکوونیٹ، 10.0 mM ہیپس، 4.0 mM ATP (Mg)، 0.0.0 mM ATP (Mg) . (Na) اور 10.0 ایم ایم کریٹینائن فاسفیٹ کو پی ایچ 7.25 میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا، اور اوسموٹک پریشر 290 ایم او ایس ایم (سوکروز) تھا۔ جھلی کو پھٹنے کے لیے 0 PA کی قوت لگانے کے فوراً بعد، باقی جھلی کی صلاحیت کی پیمائش کی گئی۔ ان پٹ مزاحمت کی پیمائش -40، -30، -20، اور -10 PA کے ہائپر پولرائزڈ کرنٹ لگا کر کی جاتی ہے۔ وولٹیج کے ردعمل کی شدت کی پیمائش کریں اور ان پٹ مزاحمت کا حساب لگانے کے لیے اوہم کا قانون استعمال کریں۔ وولٹیج کلیمپ میں 5 منٹ کے لیے خود بخود سرگرمی ریکارڈ کی گئی، اور sPSC کی شناخت اور پیمائش آئیگور پرو (ورژن 32 7.01، WaveMetrics، Lake Oswego، Oregon، USA) میں نیم خودکار شناختی اسکرپٹ کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ IV منحنی خطوط اور مستحکم حالت کا کرنٹ مختلف پوٹینشلز (-110 mV سے شروع) پر بیٹری کو بند کرکے اور 5 mV قدموں میں وولٹیج کو بڑھا کر ماپا جاتا ہے۔ اے پی کی پیداوار کو ڈی پولرائزنگ کرنٹ لگا کر جانچا گیا۔ ڈیپولرائزنگ کرنٹ پلس لگاتے ہوئے سیل کو -70 ایم وی پر کلیمپ کریں۔ ہر ریکارڈنگ یونٹ کے سٹیپ سائز کو الگ سے ایڈجسٹ کریں (10 سے 60 پی اے)۔ زیادہ سے زیادہ AP فریکوئنسی کا حساب لگا کر دستی طور پر نبض کے اسپائکس کو شمار کریں جو سب سے زیادہ AP فریکوئنسی کا سبب بنتے ہیں۔ اے پی تھریشولڈ کا تجزیہ ڈیپولرائزیشن پلس کے دوسرے مشتق کو استعمال کرکے کیا جاتا ہے جو پہلے ایک یا زیادہ اے پی کو متحرک کرتا ہے۔
سوراخ شدہ پیچ کی ترتیب اور تجزیہ۔ معیاری پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے سوراخ شدہ پیچ ریکارڈنگ انجام دیں۔ ATP- اور GTP سے پاک پائپیٹ کا استعمال کریں جس میں درج ذیل اجزاء شامل نہ ہوں: 128 mM گلوکوونیٹ K، 10 mM KCl، 10 mM Hepes، 0.1 mM EGTA اور 2 mM MgCl2، اور pH 7.2 (KOH استعمال کرتے ہوئے) کو ایڈجسٹ کریں۔ ATP اور GTP کو خلیے کی جھلی کی بے قابو پارگمیتا کو روکنے کے لیے انٹرا سیلولر محلول سے خارج کر دیا جاتا ہے۔ پیوند شدہ پیوند ریکارڈ حاصل کرنے کے لیے پیچ پائپیٹ کو امفوٹیرسن پر مشتمل اندرونی محلول (تقریباً 200 سے 250μg/ml؛ G4888، سگما-الڈرچ) سے بھرا ہوا ہے۔ Amphotericin dimethyl سلفوکسائڈ میں تحلیل کیا گیا تھا (حتمی ارتکاز: 0.1 سے 0.3٪؛ DMSO؛ D8418، سگما-الڈرچ)۔ استعمال شدہ DMSO کی حراستی کا مطالعہ کیے گئے نیوران پر کوئی خاص اثر نہیں ہوا۔ چھدرن کے عمل کے دوران، چینل کی مزاحمت (Ra) کی مسلسل نگرانی کی گئی، اور Ra اور AP کے طول و عرض کے مستحکم ہونے کے بعد تجربہ شروع کیا گیا (20-40 منٹ)۔ بے ساختہ سرگرمی وولٹیج اور/یا کرنٹ کلیمپ میں 2 سے 5 منٹ تک ناپی جاتی ہے۔ ڈیٹا کا تجزیہ Igor Pro (ورژن 7.05.2، WaveMetrics، USA)، Excel (ورژن 2010، Microsoft Corporation، Redmond, USA) اور GraphPad Prism (ورژن 8.1.2، GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ ریاستہائے متحدہ)۔ بے ساختہ APs کی شناخت کے لیے، IgorPro کا NeuroMatic v3.0c پلگ ان استعمال کیا جاتا ہے۔ دی گئی حد کا استعمال کرتے ہوئے خود بخود APs کی شناخت کریں، جسے ہر ریکارڈ کے لیے انفرادی طور پر ایڈجسٹ کیا جاتا ہے۔ سپائیک وقفہ کا استعمال کرتے ہوئے، زیادہ سے زیادہ فوری سپائیک فریکوئنسی اور اوسط سپائیک فریکوئنسی کے ساتھ سپائیک فریکوئنسی کا تعین کریں۔
پی این تنہائی۔ پہلے شائع شدہ پروٹوکول کو اپناتے ہوئے، PNs کو ایک مخصوص مرحلے (58) پر ماؤس سیربیلم سے پاک کیا گیا تھا۔ مختصراً، سیریبیلم کو آئس کولڈ ڈسوسی ایشن میڈیم [بغیر HBSS Ca2+ اور Mg2+ کے، 20 ایم ایم گلوکوز، پینسلن (50 U/ml) اور اسٹریپٹومائسن (0.05 mg/ml) کے ساتھ ضمیمہ] میں کاٹا اور کیما بنایا گیا۔ 1-cysteine·HCl (1 mg/ml)، papain (16 U/ml) اور deoxyribonuclease I (DNase I؛ 0.1 mg/ml)] 30 ° C پر 30 منٹ تک علاج کریں۔ پہلے HBSS میڈیم میں ٹشوز کو دھوئیں جن میں انڈے کی بلغم (10 mg/ml)، BSA (10 mg/ml) اور DNase (0.1 mg/ml) کو کمرے کے درجہ حرارت پر دھوئیں، اور پھر HBSS میڈیم میں جس میں 20 mM گلوکوز شامل ہو آہستہ سے HBSS (pnicillin/50ml) میں پیسیں۔ mg/ml) اور DNase (0.1 mg/ml) واحد خلیات جاری کرتے ہیں۔ نتیجے میں سیل کی معطلی کو 70μm سیل سٹرینر کے ذریعے فلٹر کیا گیا، پھر خلیوں کو سینٹرفیوگریشن (1110 rpm، 5 منٹ، 4°C) کے ذریعے چھیڑ دیا گیا اور چھانٹنے والے درمیانے درجے میں دوبارہ معطل کر دیا گیا [HBSS، 20 mM گلوکوز کے ساتھ ضمیمہ، 20% فینیل، 20 فیصد U/ml) اور streptomycin (0.05 mg/ml)]؛ پروپیڈیم آئوڈائڈ کے ساتھ سیل کی قابل عملیت کا اندازہ کریں اور سیل کی کثافت کو 1×106 سے 2×106 سیل/ملی تک ایڈجسٹ کریں۔ فلو سائٹومیٹری سے پہلے، معطلی کو 50 μm سیل اسٹرینر کے ذریعے فلٹر کیا گیا تھا۔
فلو سائٹو میٹر۔ FACSAria III مشین (BD Biosciences) اور FACSDiva سافٹ ویئر (BD Biosciences، ورژن 8.0.1) کا استعمال کرتے ہوئے سیل کی چھانٹی 4°C پر کی گئی۔ سیل معطلی کو 100 μm نوزل ​​کا استعمال کرتے ہوئے 20 psi کے دباؤ میں ~ 2800 واقعات/سیکنڈ کی شرح سے ترتیب دیا گیا تھا۔ چونکہ روایتی گیٹنگ کے معیارات (خلیہ کا سائز، بیموڈل امتیاز، اور بکھرنے والی خصوصیات) دیگر سیل اقسام سے PN کی درست تنہائی کو یقینی نہیں بنا سکتے، اس لیے گیٹنگ کی حکمت عملی YFP کی شدت اور mitoYFP+ ​​میں آٹو فلوروسینس اور کنٹرول mitoYFP − چوہوں کے براہ راست موازنہ پر مبنی ہے۔ YFP 488 nm لیزر لائن کے ساتھ نمونے کو شعاع دے کر پرجوش ہے، اور 530/30 nm بینڈ پاس فلٹر کا استعمال کرتے ہوئے سگنل کا پتہ چلا ہے۔ mitoYFP+ ​​چوہوں میں، Rosa26-mitoYFP رپورٹر جین کی نسبتاً طاقت بھی نیورونل باڈی اور ایکسون کے ٹکڑوں میں فرق کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ 7-AAD 561 nm پیلے رنگ کے لیزر کے ساتھ پرجوش ہے اور مردہ خلیوں کو خارج کرنے کے لیے 675/20 nm بینڈ پاس فلٹر کے ساتھ پتہ چلا ہے۔ ایک ہی وقت میں ایسٹروائٹس کو الگ کرنے کے لیے، سیل کی معطلی کو ACSA-2-APC سے داغ دیا گیا تھا، پھر نمونے کو 640 nm لیزر لائن سے شعاع کیا گیا تھا، اور سگنل کا پتہ لگانے کے لیے 660/20 nm بینڈ پاس فلٹر استعمال کیا گیا تھا۔
جمع کردہ خلیوں کو سینٹرفیوگریشن (1110 rpm، 5 منٹ، 4 ° C) کے ذریعے گولی ماری گئی اور استعمال تک -80 ° C پر محفوظ کیا گیا۔ Mfn2cKO چوہوں اور ان کے کوڑے کے پپلوں کو ایک ہی دن درجہ بندی کیا جاتا ہے تاکہ طریقہ کار کی تغیر کو کم کیا جا سکے۔ FACS ڈیٹا پریزنٹیشن اور تجزیہ FlowJo سافٹ ویئر (FlowJo LLC، Ashland، Oregon، USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔
جیسا کہ اوپر ذکر کیا گیا ہے (59)، ریئل ٹائم پی سی آر کا استعمال بعد کے ایم ٹی ڈی این اے کوانٹیفیکیشن کے لیے ترتیب شدہ نیوران سے ڈی این اے کو الگ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ خطوط اور حد کی حساسیت کا ابتدائی طور پر مختلف تعداد میں خلیوں پر کیو پی سی آر چلا کر تجربہ کیا گیا۔ مختصراً، 50 mM tris-HCl (pH 8.5)، 1 mM EDTA، 0.5% Tween 20 اور proteinase K (200 ng/ml) پر مشتمل ایک lysis بفر میں 300 PN جمع کریں اور 55°C 120 منٹ پر انکیوبیٹ کریں۔ پروٹینیز K کے مکمل غیر فعال ہونے کو یقینی بنانے کے لیے خلیوں کو مزید 95 ° C پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ mt-Nd1 کے لیے مخصوص TaqMan پروب (تھرمو فشر) کا استعمال کرتے ہوئے، mtDNA کو 7900HT ریئل ٹائم پی سی آر سسٹم (تھرمو فشر سائنٹفک) میں نیم مقداری پی سی آر کے ذریعے ماپا گیا۔ سائنس، کیٹلاگ نمبر Mm04225274_s1)، mt-Nd6 (تھرمو فشر سائنٹیفک، کیٹلاگ نمبر AIVI3E8) اور 18S (تھرمو فشر سائنٹیفک، کیٹلاگ نمبر Hs99999901_s1) جین۔
پروٹوم نمونے کی تیاری۔ محلول کو 10 منٹ کے لیے 95 ° C پر گرم کرکے اور سونیکیٹ کرکے، لیسیز بفر میں [6 M guanidine کلورائیڈ، 10 mM tris(2-carboxyethyl) فاسفائن ہائیڈروکلورائیڈ، 10 mM chloroacetamide اور 100 mM tris- Lyse pellets H] C میں منجمد کریں۔ Bioruptor (Diagenode) پر 10 منٹ (30 سیکنڈ پلس / 30 سیکنڈ وقفہ وقفہ)۔ نمونے کو 20 ایم ایم ٹرائس-ایچ سی ایل (پی ایچ 8.0) میں 1:10 پتلا کیا گیا، 300 این جی ٹرپسن گولڈ (پرومیگا) کے ساتھ ملایا گیا، اور مکمل ہاضمہ حاصل کرنے کے لیے رات بھر 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ دوسرے دن، نمونے کو 20 منٹ کے لیے 20،000 گرام پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرناٹینٹ کو 0.1% فارمک ایسڈ سے پتلا کیا گیا تھا، اور اس محلول کو خود ساختہ اسٹیج ٹپس سے صاف کیا گیا تھا۔ نمونے کو اسپیڈ ویک انسٹرومنٹ (ایپینڈورف کنسنٹریٹر پلس 5305) میں 45 ° C پر خشک کیا گیا تھا، اور پھر پیپٹائڈ کو 0.1% فارمک ایسڈ میں معطل کر دیا گیا تھا۔ تمام نمونے ایک ہی شخص نے بیک وقت تیار کیے تھے۔ ایسٹروسائٹ کے نمونوں کا تجزیہ کرنے کے لیے، 4 μg ڈیسالٹڈ پیپٹائڈس پر ٹینڈم ماس ٹیگ (TMT10plex، کیٹلاگ نمبر 90110، تھرمو فشر سائنٹیفک) کا لیبل لگایا گیا تھا جس کا پیپٹائڈ سے TMT ریجنٹ تناسب 1:20 تھا۔ TMT لیبلنگ کے لیے، 0.8 ملی گرام TMT ریجنٹ کو 70 μl اینہائیڈروس ACN میں دوبارہ معطل کیا گیا تھا، اور خشک پیپٹائڈ کو 9 μl 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) میں دوبارہ تشکیل دیا گیا تھا، جس میں 7 μl TMT ریجنٹ شامل کیا گیا تھا۔ ارتکاز 43.75% تھا۔ انکیوبیشن کے 60 منٹ کے بعد، رد عمل کو 2 μl 5% ہائیڈروکسیلامین کے ساتھ بجھایا گیا۔ لیبل لگے پیپٹائڈس کو 200μl 0.1% فارمک ایسڈ (FA) میں جمع کیا گیا، خشک کیا گیا، دوبارہ معطل کیا گیا، دو حصوں میں تقسیم کیا گیا، اور پھر خود ساختہ اسٹیج ٹپس کا استعمال کرتے ہوئے ان کو صاف کیا گیا۔ الٹی میٹ 3000 الٹرا ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگراف (الٹی میٹ 3000 الٹرا ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگراف) کا استعمال کرتے ہوئے، دو حصوں میں سے ایک کو 1 ملی میٹر x 150 ملی میٹر ایکویٹی کرومیٹوگرافک کالم پر تقسیم کیا گیا تھا۔ SKU: 186006935)۔ تھرمو فشر سائنٹیفک)۔ 30μl/منٹ کی بہاؤ کی شرح پر پیپٹائڈس کو الگ کریں، 85 منٹ کے لیے 1% سے 50% بفر B سے 96 منٹ کے مرحلہ وار میلان کے ساتھ، 50% سے 95% بفر B تک 3 منٹ کے لیے، پھر 95% Buffer B کے لیے 8 منٹ؛ بفر A 5% ACN اور 10 mM امونیم بائک کاربونیٹ (ABC) ہے، اور بفر B 80% ACN اور 10 mM ABC ہے۔ ہر 3 منٹ بعد مختلف حصوں کو جمع کریں اور انہیں دو گروپس (1 + 17، 2 + 18 وغیرہ) میں جوڑیں اور انہیں ویکیوم سینٹری فیوج میں خشک کریں۔
LC-MS/MS تجزیہ۔ ماس سپیکٹرو میٹری کے لیے، پیپٹائڈس (نمبر r119.aq) کو 25 سینٹی میٹر، 75 μm اندرونی قطر کے PicoFrit تجزیاتی کالم (نیا مقصدی لینس، حصہ نمبر PF7508250) پر الگ کیا گیا تھا جس میں 1.9 μm ReproSil-Cm.20PurMed-Comed. Maisch, mat), EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germany) استعمال کریں۔ کالم کو 50 ° C پر برقرار رکھا گیا تھا۔ بفرز A اور B پانی میں 0.1% فارمک ایسڈ اور 80% ACN میں بالترتیب 0.1% فارمک ایسڈ ہیں۔ پیپٹائڈس کو 65 منٹ کے لیے 6% سے 31% بفر B سے اور 31% سے 50% بفر B سے 5 منٹ کے لیے 200 nl/min کے میلان کے ساتھ الگ کیا گیا۔ ایلوٹڈ پیپٹائڈس کا تجزیہ آربٹریپ فیوژن ماس اسپیکٹومیٹر (تھرمو فشر سائنٹیفک) پر کیا گیا۔ پیپٹائڈ پیشگی m/z پیمائش 350 سے 1500 m/z کی حد میں 120,000 کی ریزولوشن کے ساتھ کی جاتی ہے۔ 27% نارمل تصادم توانائی کا استعمال کرتے ہوئے، 2 سے 6 کی چارج حالت کے ساتھ مضبوط ترین پیشرو کو ہائی انرجی C ٹریپ ڈسوسی ایشن (HCD) کلیویج کے لیے منتخب کیا جاتا ہے۔ سائیکل کا وقت 1 سیکنڈ پر سیٹ کیا گیا ہے۔ پیپٹائڈ کے ٹکڑے کی m/z قدر کو آئن ٹریپ میں 5×104 کے سب سے چھوٹے AGC ہدف اور 86 ms کے زیادہ سے زیادہ انجیکشن ٹائم کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ ٹکڑے کرنے کے بعد، پیشگی کو 45 سیکنڈ کے لیے متحرک اخراج کی فہرست میں رکھا گیا تھا۔ ٹی ایم ٹی کے لیبل والے پیپٹائڈس کو 50 سینٹی میٹر، 75 μm ایککلیم پیپ میپ کالم (تھرمو فشر سائنٹیفک، کیٹلاگ نمبر 164942) پر الگ کیا گیا تھا، اور ہجرت کے سپیکٹرا کا تجزیہ ایک آربیٹریپ لوموس ٹرائبرڈ ماس اسپیکٹرومیٹر (تھرمو فشرمی ہائی فیلڈ کے ساتھ کیا گیا تھا)۔ (FAIMS) کا سامان (تھرمو فشر سائنٹیفک) −50 اور −70 V کے دو معاوضے کے وولٹیج پر کام کرتا ہے۔ ہم وقت سازی کے پیشگی کی بنیاد پر منتخب کردہ MS3 TMT رپورٹ آئن سگنل کی پیمائش کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ پیپٹائڈ کی علیحدگی EASY-nLC 1200 پر کی گئی تھی، 90% لکیری گریڈینٹ ایلیوشن کا استعمال کرتے ہوئے، جس کا بفر ارتکاز 6% سے 31% تھا۔ بفر A 0.1% FA تھا، اور بفر B 0.1% FA اور 80% ACN تھا۔ تجزیاتی کالم 50 ° C پر چلتا ہے۔ FAIMS معاوضہ وولٹیج کے مطابق اصل فائل کو تقسیم کرنے کے لیے FreeStyle (ورژن 1.6، Thermo Fisher Scientific) کا استعمال کریں۔
پروٹین کی شناخت اور مقدار کا تعین۔ انٹیگریٹڈ اینڈرومیڈا سرچ انجن کا استعمال کرتے ہوئے، MaxQuant ورژن 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) کا استعمال کرتے ہوئے اصل ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔ Aequorea وکٹوریہ سے حاصل کردہ Cre recombinase اور YFP تسلسل کے علاوہ، پیپٹائڈ فریگمنٹ سپیکٹرا کو ماؤس ریفرنس پروٹوم (Proteome ID UP000000589، UniProt سے مئی 2017 میں ڈاؤن لوڈ کیا گیا) کی کینونیکل ترتیب اور isoform تسلسل کے لیے تلاش کیا گیا۔ میتھیونین آکسیڈیشن اور پروٹین این ٹرمینل ایسٹیلیشن کو متغیر ترمیم کے طور پر سیٹ کیا گیا تھا۔ سیسٹین کارباموائل میتھیلیشن کو مقررہ ترمیم کے طور پر مقرر کیا گیا تھا۔ عمل انہضام کے پیرامیٹرز کو "خصوصیت" اور "ٹرپسن/P" پر سیٹ کیا گیا ہے۔ پروٹین کی شناخت کے لیے استعمال ہونے والے پیپٹائڈز اور ریزر پیپٹائڈس کی کم از کم تعداد 1 ہے۔ منفرد پیپٹائڈس کی کم از کم تعداد 0 ہے۔ پیپٹائڈ میپ میچنگ کی شرائط کے تحت، پروٹین کی شناخت کی شرح 0.01 تھی۔ "دوسرا پیپٹائڈ" اختیار فعال ہے۔ مختلف اصل فائلوں کے درمیان کامیاب شناخت منتقل کرنے کے لیے "رنز کے درمیان میچ" کا اختیار استعمال کریں۔ لیبل فری کوانٹیفیکیشن (LFQ) (60) کے لیے LFQ کم از کم تناسب شمار 1 کا استعمال کریں۔ LFQ کی شدت کو ہر ٹائم پوائنٹ پر کم از کم ایک جین ٹائپ گروپ میں کم از کم دو درست قدروں کے لیے فلٹر کیا جاتا ہے، اور اس کی چوڑائی کے ساتھ عام تقسیم سے نکالا جاتا ہے۔ 0.3 اور نیچے 1.8 منتقل کریں۔ LFQ کے نتائج کا تجزیہ کرنے کے لیے Perseus کمپیوٹنگ پلیٹ فارم (https://maxquant.net/perseus/) اور R (https://r-project.org/) کا استعمال کریں۔ لمما سافٹ ویئر پیکیج سے ایک دو طرفہ اعتدال پسند ٹی ٹیسٹ تفریق اظہار تجزیہ (61) کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ ایکسپلورٹری ڈیٹا کا تجزیہ ggplot، FactoMineR، factoextra، GGally اور pheatmap کا استعمال کرتے ہوئے کیا جاتا ہے۔ TMT پر مبنی پروٹومکس ڈیٹا کا تجزیہ MaxQuant ورژن 1.6.10.43 کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ UniProt کے انسانی پروٹومکس ڈیٹا بیس سے خام پروٹومکس ڈیٹا تلاش کریں، جسے ستمبر 2018 میں ڈاؤن لوڈ کیا گیا تھا۔ تجزیہ میں مینوفیکچرر کی طرف سے فراہم کردہ آاسوٹوپ پیوریٹی درست کرنے کا عنصر شامل ہے۔ امتیازی اظہار کے تجزیہ کے لیے R میں limma استعمال کریں۔ اصل ڈیٹا، ڈیٹا بیس کی تلاش کے نتائج، اور ڈیٹا کے تجزیہ کے ورک فلو اور نتائج سبھی کو ڈیٹا سیٹ شناخت کنندہ PXD019690 کے ساتھ PRIDE پارٹنر ریپوزٹری کے ذریعے ProteomeXchange اتحاد میں محفوظ کیا جاتا ہے۔
فنکشنل تشریحات تجزیہ کو تقویت بخشتی ہیں۔ Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ٹول کا استعمال 8 ہفتوں (شکل 1) پر سیٹ کردہ ڈیٹا کی فنکشنل تشریح کی شرائط کی بھرپوریت کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ مختصراً، LC-MS/MS (ٹینڈم ماس اسپیکٹومیٹری) ڈیٹا تجزیہ سے حاصل کردہ مقداری پروٹین کی فہرست کو درج ذیل فلٹر کے معیار کے ساتھ استعمال کیا جاتا ہے: Mus musculus کو انواع اور پس منظر کے طور پر منتخب کیا جاتا ہے، اور زمرہ ظاہر کرتا ہے کہ P قدر کو افزودگی 0.05 یا اس سے کم کے لیے بینجمنی کے ذریعے ایڈجسٹ کیا گیا ہے۔ اس گراف کے لیے، ایڈجسٹ شدہ P قدر کی بنیاد پر ہر کلسٹر میں ٹاپ پانچ اضافی زمرے دکھائے گئے ہیں۔ ایک سے زیادہ ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے، بنجمینی، کریگر، اور یکوتیلی (Q = 5%) کے دو مراحل کے لکیری بوسٹ پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے، ہر زمرے میں شناخت کیے گئے اہم امیدواروں پر ٹائم کورس پروٹین ایکسپریشن تجزیہ کیا جاتا ہے، اور ہر قطار کا الگ الگ تجزیہ کیا جاتا ہے۔ مستقل ایس ڈی کو اپنانے کی ضرورت نہیں ہے۔
شائع شدہ ڈیٹا بیس کے ساتھ اس مطالعہ کے نتائج کا موازنہ کرنے اور شکل 1 میں وین ڈایاگرام بنانے کے لیے، ہم نے مقداری پروٹین کی فہرست کو MitoCarta 2.0 تشریحات (24) کے ساتھ ملایا۔ خاکہ تیار کرنے کے لیے آن لائن ٹول Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) کا استعمال کریں۔
پروٹومکس تجزیہ کے لیے استعمال کیے جانے والے شماریاتی طریقہ کار کے بارے میں تفصیلی معلومات کے لیے، براہِ کرم مواد اور طریقوں کے متعلقہ حصے سے رجوع کریں۔ دیگر تمام تجربات کے لیے، تفصیلی معلومات متعلقہ لیجنڈ میں مل سکتی ہیں۔ جب تک کہ دوسری صورت میں وضاحت نہ کی جائے، تمام اعداد و شمار کو اوسط ± SEM کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے، اور تمام شماریاتی تجزیے گراف پیڈ پرزم 8.1.2 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تھے۔
اس مضمون کے ضمنی مواد کے لیے، براہ کرم دیکھیں http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
یہ تخلیقی العام انتساب-غیر تجارتی لائسنس کی شرائط کے تحت تقسیم کیا گیا ایک کھلا رسائی مضمون ہے، جو کسی بھی میڈیم میں استعمال، تقسیم اور تولید کی اجازت دیتا ہے، جب تک کہ حتمی استعمال تجارتی فائدے کے لیے نہ ہو اور بنیاد یہ ہے کہ اصل کام درست ہے۔ حوالہ۔
نوٹ: ہم آپ سے صرف اپنا ای میل ایڈریس فراہم کرنے کو کہتے ہیں تاکہ آپ جس شخص کو صفحہ پر تجویز کرتے ہیں اسے معلوم ہو کہ آپ چاہتے ہیں کہ وہ ای میل دیکھیں اور یہ سپیم نہیں ہے۔ ہم کسی بھی ای میل ایڈریس پر قبضہ نہیں کریں گے۔
یہ سوال یہ جانچنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے کہ آیا آپ وزیٹر ہیں اور خودکار سپیم جمع کرانے سے روکتے ہیں۔
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. لارسن
غیر فعال نیوران کے پروٹومکس تجزیہ نے انکشاف کیا کہ میٹابولک پروگرام نیوروڈیجنریشن کا مقابلہ کرنے کے لیے چالو ہوتے ہیں۔
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. لارسن
غیر فعال نیوران کے پروٹومکس تجزیہ نے انکشاف کیا کہ میٹابولک پروگرام نیوروڈیجنریشن کا مقابلہ کرنے کے لیے چالو ہوتے ہیں۔
©2020 امریکن ایسوسی ایشن فار دی ایڈوانسمنٹ آف سائنس۔ تمام حقوق محفوظ ہیں۔ AAAS HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef اور COUNTER کا پارٹنر ہے۔ سائنس ایڈوانسز ISSN 2375-2548۔