موجودہ †موجودہ پتہ: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
ری ایکشن سینٹر لائٹ ہارویسٹنگ کمپلیکس 1 (RC-LH1) جامنی فوٹوٹروفک بیکٹیریا کا بنیادی فوٹو سنتھیٹک جز ہے۔ ہم نے Rhodopseudomonas palustris سے RC-LH1 کمپلیکس کے دو کریو الیکٹران مائکروسکوپی ڈھانچے متعارف کرائے ہیں۔ RC-LH114-W کمپلیکس کا 2.65-Å ریزولیوشن ڈھانچہ RC کے ارد گرد 14 ذیلی یونٹ LH1 لوپس پر مشتمل ہے، جس میں پروٹین ڈبلیو مداخلت کرتا ہے، جب کہ پروٹین-W کے بغیر کمپلیکس مکمل طور پر RC سے گھرا ہوا ہے۔ بند 16 ذیلی یونٹ LH1 لوپ۔ ان ڈھانچے کا موازنہ RC-LH1 کمپلیکس میں کوئینون کی حرکیات کے بارے میں بصیرت فراہم کرتا ہے، بشمول RC QB سائٹ پر کوئینون کو بائنڈنگ کرتے وقت پہلے سے غیر متعین تبدیلیاں، نیز معاون کوئینون بائنڈنگ سائٹس کا مقام، جو انہیں RC تک پہنچانے میں مدد کرتا ہے۔ ڈبلیو پروٹین کی منفرد ساخت LH1 لوپ کو بند ہونے سے روکتی ہے، اس طرح کوئینون/کوئنولون ایکسچینج کو تیز کرنے کے لیے ایک چینل بناتا ہے۔
فوٹو سنتھیس کے ذریعے فراہم کی جانے والی توانائی زمین پر تقریباً تمام زندگی کو برقرار رکھ سکتی ہے، اور اس میں شمسی حیاتیاتی ٹیکنالوجی کی بڑی صلاحیت ہے۔ عالمی فوٹو سنتھیسز کو فروغ دینے کے دوران، جامنی فوٹوٹروفک بیکٹیریا مختلف توانائی کے طریقوں اور میٹابولک صلاحیتوں کو بھی ظاہر کرتے ہیں۔ وہ فوٹو سنتھیس سے بچ سکتے ہیں اور اندھیرے میں ہیٹروٹروفک بیکٹیریا کے طور پر بڑھ سکتے ہیں، نائٹروجن اور کاربن ڈائی آکسائیڈ کو ٹھیک کر سکتے ہیں، ہائیڈروجن پیدا کر سکتے ہیں، اور خوشبو دار مرکبات کو کم کر سکتے ہیں (1-3)۔ ان عملوں کے لیے توانائی فراہم کرنے کے لیے، روشنی کو جلد اور مؤثر طریقے سے کیمیائی توانائی میں تبدیل ہونا چاہیے۔ یہ عمل اس وقت شروع ہوتا ہے جب لائٹ ٹریپ کرنے والا اینٹینا کمپلیکس روشنی کو جذب کرتا ہے اور پھنسی ہوئی توانائی کو ری ایکشن سینٹر (RC) میں منتقل کرتا ہے، اس طرح چارج علیحدگی شروع ہوتا ہے (4 – 7)۔ جامنی رنگ کے فوٹوٹروفک بیکٹیریا میں فوٹو سنتھیسز کی بنیادی اکائی قسم 2 RC پر مشتمل ہے، جس کے چاروں طرف ہلکی کٹائی کرنے والے کمپلیکس 1 (LH1) سے گھرا ہوا ہے، جو RC-LH1 کور کمپلیکس بناتا ہے۔ LH1 مڑے ہوئے αβ heterodimers کی ایک صف سے بنتا ہے، جن میں سے ہر ایک دو بیکٹیریل کلوروفل (BChl) ایک مالیکیول اور ایک یا دو کیروٹینائڈز (8-12) کو جوڑتا ہے۔ سب سے آسان LH1 اینٹینا 16 یا 17 αβ heterodimers پر مشتمل ہوتا ہے جو ایک بند لوپ میں RC (9-13) کو گھیرتا ہے، لیکن دوسرے بنیادی کمپلیکس میں، ٹرانس میبرن پیپٹائڈز ارد گرد کے LH1 کے تسلسل میں خلل ڈالتے ہیں، اس طرح quinol/quinone diffusion اور RC11 کے درمیان کمپلیکس کو فروغ دیتے ہیں۔ 13-15)۔ جامنی رنگ کا فوٹوٹروفک پلانٹ روڈوپسیوڈوموناس (Rps.) ایک ماڈل جاندار ہے جو کہ توانائی اور الیکٹران کی منتقلی کو سمجھ سکتا ہے جو فوٹو سنتھیسز کو سپورٹ کرتا ہے۔ Rps کا پہلا کرسٹل ڈھانچہ۔ palustris RC-LH1 کمپلیکس کا ماڈل RC ہے، جس کے چاروں طرف 15 heterodimeric LH1 لوپس ہیں، جو "پروٹین ڈبلیو" (14) نامی ایک نامعلوم پروٹین کے ذریعے رکاوٹ بنتے ہیں۔ پروٹین-W کو بعد میں RPA4402 کے طور پر شناخت کیا گیا، جو کہ تین پیش گوئی شدہ ٹرانس میبرن ہیلائسز (TMH) (16) کے ساتھ ایک غیر مخصوص 10.5kDa پروٹین ہے۔ ہم تجویز کرتے ہیں کہ rpa4402 جین انکوڈنگ پروٹین W کا نام تبدیل کرکے pufW رکھا جائے تاکہ RC-L، M (pufL، pufM) اور LH1α، β (pufA، pufB) ذیلی یونٹس کو انکوڈنگ کرنے والے جین کے لیے استعمال ہونے والے نام کے مطابق ہو۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ پروٹین-W صرف RC-LH1 کے تقریباً 10% میں موجود ہے، جو Rps کو ظاہر کرتا ہے۔ palustris دو مختلف RC-LH1 کمپلیکس تیار کرتا ہے۔ یہاں، ہم دو بنیادی کمپلیکس کے ہائی ریزولوشن cryo-EM (cryo-EM) ڈھانچے کی اطلاع دیتے ہیں، ایک پروٹین W اور 14 αβ heterodimers کے ساتھ، دوسرا بغیر پروٹین W اور بند 16 Heterodimer LH1 لوپ کے ساتھ۔ ہمارا ڈھانچہ Rps کے RC-LH1 کمپلیکس کی تفہیم میں ایک قدم تبدیلی کی نمائندگی کرتا ہے۔ palustris، کیونکہ ہم نے ہر ایک متغیر کی یکساں آبادی کا تجزیہ کیا ہے اور ہر پیپٹائڈ اور پابند روغن اور متعلقہ لپڈز اور کوئنز کو واضح طور پر تفویض کرنے کے لیے کافی ریزولوشن موجود ہے۔ ان ڈھانچوں کا موازنہ ظاہر کرتا ہے کہ تین TMH پروٹین-W جو اب تک کسی دوسرے RC-LH1 کمپلیکس میں نہیں پائے گئے ہیں، کوئینون/کوئنولون ایکسچینج کو تیز کرنے کے لیے کوئینون چینل بناتے ہیں۔ متعدد محفوظ لپڈ اور کوئینون بائنڈنگ سائٹس کی نشاندہی کی گئی ہے، اور ہم نے کوئینون اور آر سی کے امتزاج کے بعد ایک نئی تبدیلی کا انکشاف کیا ہے، جو آکسیجن والے فوٹوٹروفک جانداروں کے فوٹو سسٹم II (PSII) RC کے لیے موزوں ہو سکتی ہے۔ ہماری تلاشیں جامنی فوٹوٹروفک بیکٹیریا کے RC-LH1 کور کمپلیکس میں کوئینون/کوئنولون بائنڈنگ اور ایکسچینج کے حرکیات کے بارے میں نئی ​​بصیرت فراہم کرتی ہیں۔
Rps میں پائے جانے والے دو احاطے کے تفصیلی مطالعہ کی سہولت کے لیے۔ palustris، ہم ہر RC-LH1 کو بائیو کیمیکل طریقوں سے الگ کرتے ہیں۔ پروٹین ڈبلیو کی کمی کا کمپلیکس (جس کے بعد ΔpufW کہا جاتا ہے) کو اس تناؤ سے پاک کیا گیا تھا جس میں pufW جین (16) کی کمی تھی، اور صرف ایک RC-LH1 کمپلیکس تیار کیا جا سکتا ہے۔ پروٹین ڈبلیو پر مشتمل کمپلیکس ایک تناؤ سے تیار ہوتا ہے۔ اس تناؤ کے پروٹین ڈبلیو کو اس کے سی ٹرمینس پر 10x اس کے ٹیگ کے ساتھ تبدیل کیا گیا ہے، تاکہ پروٹین ڈبلیو پر مشتمل کمپلیکس کو دھات کو متحرک کرکے زیادہ تر پروٹین ڈبلیو کے ساتھ مؤثر طریقے سے ملایا جاسکے۔ کمپلیکس کو مؤثر طریقے سے الگ کیا گیا ہے (16) افینیٹی کرومیٹوگرافی (IMAC)۔
جیسا کہ شکل 1 میں دکھایا گیا ہے، دونوں کمپلیکس میں تین ذیلی یونٹ RC (RC-L، RC-M اور RC-H) ہوتے ہیں جو ایک LH1 اینٹینا سے گھرے ہوئے ہیں۔ کمپلیکس کا 2.80-A ڈھانچہ جس میں پروٹین-W کی کمی ہے، 16 αβ ہیٹروڈیمر دکھاتا ہے، جو RC کے ارد گرد ایک بند LH1 لوپ بناتا ہے، جسے بعد میں RC-LH116 کمپلیکس کہا جاتا ہے۔ پروٹین-W- پر مشتمل کمپلیکس کے 2.65Å ڈھانچے میں ایک 14-ہیٹروڈیمر LH1 ہے جو پروٹین-W کے ذریعے مداخلت کرتا ہے، جسے بعد میں RC-LH114-W کہا جاتا ہے۔
(A اور B) مرکب کی سطح کی نمائندگی۔ (C اور D) بانڈڈ پگمنٹس کا اظہار چھڑیوں میں۔ (E اور F) سائٹوپلاسمک سطح سے مشاہدہ کیے گئے کمپلیکس میں کارٹونوں میں پیپٹائڈس اور LH1 ذیلی اکائیوں کی نمائندگی کی گئی ہے، اور پروٹین-ڈبلیو گیپ سے گھڑی کی سمت میں شمار کیے گئے ہیں [Rba نمبرنگ کے ساتھ ہم آہنگ۔ اسفیرائڈز کمپلیکس (13)]۔ LH1-α کے لیے، پروٹین کے ذیلی یونٹ کا رنگ پیلا ہے۔ LH1-β کے لیے، پروٹین کے ذیلی یونٹ کا رنگ نیلا ہے۔ پروٹین-W کے لیے، پروٹین سرخ ہے؛ RC-H کے لیے، یہ سیان ہے۔ RC-L کے لیے، یہ اورنج ہے۔ RC-M کے لیے، میجنٹا۔ کوفیکٹرز کی نمائندگی سلاخوں سے ہوتی ہے، سبز رنگ BChl اور BPh مالیکیولز کی نمائندگی کرتا ہے، جامنی رنگ کیروٹینائڈز کی نمائندگی کرتا ہے، اور پیلا رنگ UQ10 مالیکیولز کی نمائندگی کرتا ہے۔ (G اور H) RC-LH114-W کمپلیکس (G) اور RC-LH116 کمپلیکس (H) کے مساوی خطے میں پروٹین-W کے فرق کا بڑا منظر۔ کوفیکٹرز اسپیس فلنگ کی شکل میں دکھائے جاتے ہیں، چیلیٹڈ کوئینون نیلے رنگ میں ظاہر ہوتا ہے۔ پروٹین-W کے فرق کو (G) میں نیلے رنگ کی ڈیشڈ لائن سے نمایاں کیا جاتا ہے، اور چھوٹے سوراخ جہاں LH116 رنگ پر کوئنون/کوئنولول پھیلتے ہیں (H) میں سیاہ ڈیشڈ لائن کے ذریعے نمایاں ہوتے ہیں۔
شکل 1 (A اور B) LH1αβ heterodimers کی کھلی یا بند صفوں سے گھرا ہوا RC دکھاتا ہے، جن میں سے ہر ایک دو BChl اور ایک کیروٹینائڈ (شکل 1، C اور D) کو باندھتا ہے۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ Rps LH1 کمپلیکس ہے۔ spirulina xanthin کے حیاتیاتی مصنوعی راستے میں، یہ پرجاتیوں میں carotenoids کی مخلوط آبادی ہوتی ہے (17)۔ تاہم، spiropyrroxanthin غالب کیروٹینائڈ ہے اور اس کی کثافت تسلی بخش ہے۔ لہذا، ہم نے تمام LH1 بائنڈنگ سائٹس پر spiroxanthin کو ماڈل کرنے کا انتخاب کیا۔ الفا اور بیٹا پولی پیپٹائڈس واحد TMHs ہیں جن میں چھوٹی جھلی کے بیرونی حصے ہوتے ہیں (شکل 1، A، B، E، اور F)۔ اگرچہ سی ٹرمینس پر 17 اوشیشوں کی کثافت کا مشاہدہ نہیں کیا گیا تھا، الفا پولی پیپٹائڈ کو دونوں کمپلیکس میں Met1 سے Ala46 تک صاف کیا گیا تھا۔ β پولی پیپٹائڈ کو RC-LH116 میں Gly4 سے Tyr52 میں، اور RC-LH114-W میں Ser5 سے Tyr52 تک کم کیا گیا تھا۔ 3 یا 4 N-ٹرمینل یا 13 C-ٹرمینل کی باقیات کی کثافت نہیں دیکھی گئی (شکل S1)۔ جنگلی قسم کے تناؤ سے تیار کردہ مخلوط RC-LH1 کمپلیکس کے ماس اسپیکٹومیٹری تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ گمشدہ خطہ ان پیپٹائڈس (فگر S1 اور S2) کے ہیٹرولوگس کلیویج کا نتیجہ تھا۔ α-Met1 کی N-ٹرمینل تشکیل بھی دیکھی گئی (f)۔ تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ α-peptide fMet1 سے Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 تک کی باقیات پر مشتمل ہے، اور β-پیپٹائڈ باقیات Ser2 سے Ala53 پر مشتمل ہے، جو کم درجہ حرارت EM کثافت کے نقشے کے ساتھ اچھے معاہدے میں ہے۔
α-His29 اور β-His36 کا ہم آہنگی BChls کو آمنے سامنے بناتا ہے۔ ہر ایک αβ heterodimer اپنے پڑوسیوں کے ساتھ اکٹھا ہوتا ہے تاکہ RC کے ارد گرد ایک کھلا لوپ (RC-LH114-W) یا ایک بند لوپ (RC-LH116) تشکیل دے سکے۔ RC-LH114-W کے 877 nm بینڈ کے مقابلے میں، RC-LH116 کی 880 nm جذب ریڈ شفٹ 3 nm ہے (شکل 2A)۔ تاہم، سرکلر ڈیکروزم سپیکٹرم تقریباً ایک جیسا ہے (شکل 2B)، یہ ظاہر کرتا ہے کہ اگرچہ کھلے اور بند لوپ میں واضح فرق ہے، BChls کا مقامی ماحول بہت ملتا جلتا ہے۔ جذب ریڈ شفٹ بند لوپ (18, 19) پر تھرمل حرکت میں کمی اور استحکام میں اضافہ کا نتیجہ ہو سکتا ہے، بند لوپ (20, 21) کی وجہ سے روغن کے جوڑے میں تبدیلی یا ان دو اثرات (11) کے امتزاج کا نتیجہ ہو سکتا ہے۔
(A) الٹرا وائلٹ/دیکھنے والا/قریب اورکت جذب کرنے والا سپیکٹرم، جس کی چوٹیوں کو ان کے متعلقہ روغن سے نشان زد کیا جاتا ہے اور 775 nm پر BPh چوٹی پر نارمل کیا جاتا ہے۔ (B) سرکلر ڈیکروزم سپیکٹرم کو 805 nm پر BChl جاذب میں معمول بنایا گیا۔ (C اور D) RC-LH114-W کمپلیکس (C) اور RC-LH116 کمپلیکس (D) کے وقت سے حل شدہ جذب سپیکٹرا سے منتخب کردہ ΔA سپیکٹرا۔ بہتر موازنہ کے لیے، تمام سپیکٹرا کو 0.2 ps پر −A کے ∆A پر معمول بنایا جاتا ہے۔ (E) UQ2 کی مختلف ارتکاز کی موجودگی میں شعاع ریزی کے بعد سائٹوکوم c2 آکسیڈیشن کی شرح (خام ڈیٹا کے لیے تصویر S8 دیکھیں)۔ (F) کم، درمیانی یا زیادہ شدت والی روشنی (بالترتیب 10، 30 یا 300μMm-2 s-1) کے تحت اگنے والے خلیوں میں، پیوریفائیڈ کمپلیکس میں پروٹین W اور RC-L ذیلی یونٹس اور علیحدہ جھلی کا تناسب۔ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis اور immunoassay کے ذریعے پروٹین کی سطح کا تعین کریں (خام ڈیٹا کے لیے شکل S9 دیکھیں)۔ پیوریفائیڈ RC-LH114-W کمپلیکس کے نسبت تناسب کا تعین کریں۔ کمپلیکس کے RC-L کا پروٹین-W کا stoichiometric تناسب 1:1 ہے۔
RC-LH114-W (شکل 1, A, C, اور E) کے بگڑے ہوئے αβ14 لوپ میں پوزیشن 1 پر موجود BChls RC-LH116 میں مساوی BChls کے مقابلے 6.8Å زیادہ RC پرائمری ڈونر (P) کے قریب ہیں (شکل 1, B, D, اور F, S3)؛ تاہم، دو کمپلیکس کے عارضی جذب حرکیات سے پتہ چلتا ہے کہ RC-LH114-W اور RC-LH116 کے لیے، LH1 سے RC تک جوش توانائی کی منتقلی کا وقت 40 ±4 اور 44±3 ps ہے (شکل 2)۔ ، C اور D، شکل S4 اور Table S2)۔ RC (Figure S5 اور متعلقہ ضمنی متن) کے اندر الیکٹرانک ٹرانسفر میں بھی کوئی خاص فرق نہیں ہے۔ ہمیں شبہ ہے کہ LH1 اور RC-P کے درمیان توانائی کی منتقلی کے وقت کی قریبی خط و کتابت دو LH1 لوپس میں زیادہ تر BChl کی یکساں فاصلے، زاویہ اور ممکنہ توانائی کی وجہ سے ہے۔ ایسا لگتا ہے کہ کم سے کم فاصلے تک پہنچنے کے لیے LH1 انرجی پیٹرن کو تلاش کرنا ذیلی جگہوں سے RC تک براہ راست توانائی کی منتقلی سے زیادہ تیز نہیں ہے۔ RC-LH114-W میں اوپن لوپ LH1 لوپ ساختی تجزیہ کے لیے کم درجہ حرارت کے حالات میں بھی غیر معمولی تھرمل حرکت سے گزر سکتا ہے، اور RC 1 کی پوزیشن پر βBChls کے پگمنٹیشن فاصلے سے کمرے کے درجہ حرارت پر ایک طویل αβ14 رنگ کی تشکیل ہوتی ہے۔
RC-LH116 کمپلیکس 32 BChls اور 16 carotenoids پر مشتمل ہے، اور اس کا مجموعی انتظام وہی ہے جو تھرموکرومیٹیم (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9)، Thiorhodovibrio (Trv.) ID 970 (ID1R) اور ID970 طحالب (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10)۔ صف بندی کے بعد، αβ heterodimers کی پوزیشنوں میں صرف چھوٹے انحرافات دیکھے گئے، خاص طور پر 1-5، 15، اور 16 (شکل S6)۔ پروٹین-W کی موجودگی کا LH1 کی ساخت پر خاصا اثر پڑتا ہے۔ اس کے تین ٹی ایم ایچ مختصر لوپس کے ذریعے جڑے ہوئے ہیں، کمپلیکس کے لیمن سائیڈ پر N-ٹرمینل اور سائٹوپلاسمک سائیڈ پر C-ٹرمینل کے ساتھ (اعداد و شمار 1A اور 3، A سے D)۔ پروٹین-ڈبلیو بڑی حد تک ہائیڈروفوبک ہے (شکل 3B)، اور TMH2 اور TMH3 LH1αβ-14 کے ساتھ تعامل کرتے ہیں تاکہ ٹرانس میمبرن سطح بن سکے (شکل 3، B اور E سے G)۔ انٹرفیس بنیادی طور پر ٹرانس میمبرین کے علاقے میں Phe، Leu اور Val کی باقیات پر مشتمل ہے۔ یہ باقیات ہائیڈروفوبک امینو ایسڈز اور αβ-14 روغن سے بھری ہوئی ہیں۔ کچھ قطبی باقیات بھی تعامل میں حصہ ڈالتے ہیں، بشمول پیچیدہ گہا کی سطح پر W-Thr68 اور β-Trp42 کے درمیان ہائیڈروجن بانڈ (شکل 3, F اور G)۔ سائٹوپلازم کی سطح پر، Gln34 αβ-14 carotenoids کے کیٹو گروپ سے ملحق ہے۔ اس کے علاوہ، n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) مالیکیول کو حل کیا گیا، اور اس کی ہائیڈروفوبک دم پروٹین-W اور αβ-14 کے درمیان انٹرفیس تک پھیل گئی، اور لپڈ دم جسم میں واقع ہو سکتی ہے۔ ہم نے یہ بھی دیکھا کہ پروٹین ڈبلیو اور آر سی ایچ کے سی ٹرمینل ریزولوشن والے علاقے بہت قریب ہیں، لیکن مخصوص تعاملات کی تشکیل کے دائرہ کار میں نہیں ہیں (شکل 1، اے اور ای)۔ تاہم، ان دو پروٹینوں کے غیر حل شدہ C-ٹرمینل امینو ایسڈز میں تعامل ہو سکتا ہے، جو RC-LH114-W کمپلیکس کی اسمبلی کے دوران پروٹین-W کی بھرتی کے لیے ایک طریقہ کار فراہم کر سکتا ہے۔
(A) پروٹین-W، جو کارٹون کی شکل میں LH1αβ14 کے ساتھ انٹرفیس کا سامنا کرتا ہے، اس میں چھڑی کی شکل کی سائیڈ چین (سرخ) ہے، جو الیکٹرو سٹیٹک پوٹینشل ڈایاگرام (0.13 کے سموچ کی سطح کے ساتھ شفاف سرمئی سطح) کے ایک حصے میں ظاہر ہوتا ہے۔ (B) پروٹین-W جس کی نمائندگی ہائیڈروفوبک رنگ کی سطح سے ہوتی ہے۔ قطبی اور چارج شدہ علاقے سیان میں دکھائے جاتے ہیں، ہائیڈروفوبک علاقے سفید میں دکھائے جاتے ہیں، اور مضبوط ہائیڈروفوبک علاقے نارنجی رنگ میں دکھائے جاتے ہیں۔ (C اور D) پروٹین-W کو کارٹون میں دکھایا گیا ہے، اس کی واقفیت (A) (C) جیسی ہے، اور 180° (D) سے گھمائی گئی ہے۔ ترتیب میں پوزیشن کے مطابق، امتیازی باقیات قوس قزح کی رنگ سکیم کو اپناتے ہیں، جہاں N-ٹرمینل نیلا اور C-ٹرمینل سرخ ہے۔ (E) Protein-W اسی نظریے میں جیسا کہ (A) میں ہے، اور پروٹین-W:LH1 کے انٹرفیس پر باقیات کو منسلک نشانوں والی سلاخوں کے ذریعے دکھایا گیا ہے۔ (F) پروٹین-W کو کارٹون کی نمائندگی میں (E) اور LH1αβ14 کی نسبت 90° گھمایا جاتا ہے، اور بار کی نمائندگی میں انٹرفیس کی باقیات کے نسبت سے۔ بیٹا پولی پیپٹائڈ سے زیادہ لٹکنے والی باقیات پر لیبل لگا ہوا ہے۔ کوفیکٹر کو شکل 1 کے رنگ سے مماثل ایک بار کے طور پر دکھایا گیا ہے، سڑے ہوئے β-DDM کو بھوری رنگ میں دکھایا گیا ہے، اور آکسیجن کو سرخ رنگ میں دکھایا گیا ہے۔ (G) (F) میں منظر کو 180° گھمایا جاتا ہے، جس میں لیبل والے الفا پولی پیپٹائڈ کی نمایاں باقیات ہیں۔
پروٹین-W ایک αβ heterodimer (شکل 1F میں 15 واں) کی جگہ لے لیتا ہے، اس طرح لوپ بند ہونے سے روکتا ہے اور پہلے تین αβ ہیٹروڈیمر کو جھکاتا ہے۔ یہ دیکھا گیا کہ فلم نارمل کی نسبت پہلے αβ-1 heterodimer کا زیادہ سے زیادہ جھکاؤ کا زاویہ 25° سے 29° (شکل 1, A اور E) تھا، جو RC A میں αβ-1 کے 2° سے 8° جھکاؤ کے ذریعے تشکیل دیا گیا تھا۔ دوسرے اور تیسرے ہیٹروڈیمر بالترتیب 12° سے 22° اور 5° سے 10° پر مائل ہوتے ہیں۔ RC کی سٹرک رکاوٹ کی وجہ سے، αβ-1 کے جھکاؤ میں αβ کا دوسرا جوڑا شامل نہیں ہے (جو کہ شکل 1F میں 16ویں αβ سے مساوی ہے)، اس طرح LH1 رنگ میں ایک واضح خلا بنتا ہے (شکل 1, A اور E)۔ دو αβ heterodimers کی کمی کی وجہ سے، چار BChl اور دو carotenoids کے نقصان کے ساتھ، carotenoids میں سے کوئی بھی بٹی ہوئی αβ-1 subunit سے منسلک نہیں ہوتا ہے، جس کے نتیجے میں LH114-W رنگ میں 13 carotenoids Vegetarian اور 28 BChls شامل ہیں۔ αβ1 سے 7 خطوں میں دو کمپلیکس کے مقامی ریزولوشن کے تخمینے LH1 لوپ کے باقی حصوں سے کم ہیں، جو RC QB سائٹ (شکل 4) سے ملحق LH1 سبونائٹ کی موروثی پلاسٹکٹی کی عکاسی کر سکتے ہیں۔
RC-LH114-W (A اور B) اور RC-LH116 (C اور D) کی تصویریں ایک ہی ٹاپ ویو/سائیڈ ویو (A اور B) (A اور C) اور تصویر 1. (B اور D) کی گہا کی سطح سے دکھائی گئی ہیں۔ رنگین چابیاں دائیں طرف دکھائی دیتی ہیں۔
1:14 کے اسٹوچیومیٹرک تناسب کے ساتھ واحد دوسرا خصوصیت والا بنیادی کمپلیکس روڈوکوکس اسفیرائڈز (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13) ہے۔ تاہم، پروٹین ڈبلیو اور پف ایکس میں کوئی واضح ہم آہنگی نہیں ہے، اور ان کے متعلقہ LH1 ڈھانچے پر نمایاں اثر پڑتا ہے۔ PufX ایک واحد TMH ہے جس میں N-ٹرمینل سائٹوپلاسمک ڈومین ہے جو Rps کے مساوی مقام پر RC-H سبونائٹ (13) کے سائٹوپلاسمک سائیڈ کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔ palustris LH116αβ-16. PufX RC-LH1 اور cytochrome bcl کمپلیکس کے درمیان quinone/quinolone کے تبادلے کے لیے ایک چینل بناتا ہے اور تمام Rba میں موجود ہے۔ اسفیرائڈز کور کمپلیکس (13)۔ اگرچہ monomer-monomer انٹرفیس Rba میں ہے۔ sphaeroides RC-LH1-PufX dimer RC-LH114-W میں پروٹین W کی بائنڈنگ پوزیشن پر واقع ہے، اور PufX اور پروٹین-W کی طرف سے پیدا ہونے والا خلا مساوی پوزیشن پر ہے (شکل S7A)۔ RC-LH114-W میں خلا بھی Pseudomonas rosea LH1 کے فرضی کوئینون چینل (8) کے ساتھ منسلک ہے، جو پیپٹائڈس سے بنتا ہے جو کہ پروٹین W یا PufX (Figure S7B) سے متعلق نہیں ہیں۔ اس کے علاوہ، Blc میں quinone چینل. زمرد سبز LH1 ایک γ سبونائٹ (7) کو چھوڑ کر تشکیل دیا گیا ہے اسی طرح کی پوزیشن میں واقع ہے (شکل S7C)۔ اگرچہ مختلف پروٹینوں کے ذریعے ثالثی کی گئی، RC-LH1 کمپلیکس میں مشترکہ پوزیشن میں ان کوئنون/کوئنولول چینلز کی ظاہری شکل متضاد ارتقاء کی ایک مثال معلوم ہوتی ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ پروٹین ڈبلیو کے ذریعے پیدا ہونے والا خلا کوئنون چینل کے طور پر کام کر سکتا ہے۔
LH114-W لوپ میں موجود خلا RC-LH114-W کمپلیکس کی اندرونی جگہ اور بلک میمبرین (شکل 1G) کے درمیان ایک مسلسل جھلی کے خطہ کی تشکیل کی اجازت دیتا ہے، بجائے اس کے کہ دو ڈومینز کو ایک پروٹین کے سوراخ کے ذریعے جوڑ کر جیسا کہ پروٹین میں ہوتا ہے۔ RC-LH116 کمپلیکس بند Tch کی طرح ہے۔ سوئی جیسا پیچیدہ (22) (شکل 1H)۔ چونکہ جھلی کے ذریعے کوئنون کا پھیلاؤ تنگ پروٹین چینل کے ذریعے پھیلاؤ سے زیادہ تیز ہے، اس لیے کھلا LH114-W لوپ بند LH116 لوپ کے مقابلے میں تیزی سے RC ٹرن اوور کی اجازت دے سکتا ہے، اور RC میں کوئینون کا پھیلاؤ زیادہ محدود ہو سکتا ہے۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا پروٹین ڈبلیو RC کے ذریعے کوئنونز کی تبدیلی کو متاثر کرتا ہے، ہم نے ubiquinone 2 (UQ2) کی ایک مخصوص ارتکاز پر ایک cytochrome oxidation asay (قدرتی UQ10 کا ایک چھوٹا آئسوپرین دم کے ساتھ ایک اینالاگ) (شکل 2E) کیا۔ اگرچہ chelated quinone کی موجودگی واضح Michaelis Constant کے درست تعین میں رکاوٹ بنتی ہے (RC-LH114-W اور RC-LH116 بالترتیب 0.2±0.1μM اور 0.5±0.2μM کے لیے موزوں ہیں)، RC-LH114-W کی زیادہ سے زیادہ شرح (4.6±-114-4.6٪) ہے۔ RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) سے بڑا۔
ہم نے ابتدائی طور پر اندازہ لگایا کہ پروٹین-W بنیادی کمپلیکس کے تقریباً 10% میں موجود ہے (16)؛ یہاں، کم روشنی، درمیانی روشنی، اور زیادہ روشنی والے بڑھنے والے خلیات کے قبضے کی شرح بالترتیب 15±0.6%، 11±1% اور 0.9±0.5 ہیں، % (شکل 2F)۔ ماس سپیکٹومیٹری کے مقداری موازنہ سے پتہ چلتا ہے کہ ہسٹائڈائن ٹیگ کے اضافے سے جنگلی قسم کے تناؤ (P = 0.59) کے مقابلے میں پروٹین-W کی نسبتا کثرت میں کمی نہیں آئی، لہذا یہ سطحیں ترمیم شدہ پروٹین-W (Figure S10) کا نمونہ نہیں ہیں۔ تاہم، RC-LH1 کمپلیکس میں پروٹین-W کی یہ کم موجودگی کچھ RCs کو تیز رفتار سے پلٹنے کی اجازت دے سکتی ہے، اس طرح RC-LH116 کمپلیکس میں سست کوئنون/کوئنولون ایکسچینج کو کم کر سکتا ہے۔ ہم نے دیکھا کہ ہائی لائٹ قبضے کی شرح حالیہ ٹرانسکرپٹومکس ڈیٹا سے مطابقت نہیں رکھتی ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ مضبوط روشنی (فگر S11) (23) کے تحت pufW جین کا اظہار بڑھتا ہے۔ RC-LH1 کمپلیکس میں pufW ٹرانسکرپشن اور پروٹین-W شامل کرنے کے درمیان فرق مبہم ہے اور یہ پروٹین کے پیچیدہ ضابطے کی عکاسی کر سکتا ہے۔
RC-LH114-W میں، 6 cardiolipin (CDL)، 7 phosphatidylcholine (POPC)، 1 phosphatidylglycerol (POPG) اور 29 β-DDM مالیکیولز مختص کیے گئے ہیں اور اس میں 6 CDLs، 24 POPCs، 2 POPGs اور βD1s۔ RC-LH116 (شکل 5، A اور B)۔ ان دو ڈھانچے میں، CDL تقریباً کمپلیکس کے سائٹوپلاسمک سائیڈ پر واقع ہے، جبکہ POPC، POPG اور β-DDM زیادہ تر luminal طرف واقع ہیں۔ RC-LH114-W کمپلیکس (شکل 5A) کے αβ-1 سے αβ-6 خطے میں دو لپڈ اور ڈٹرجنٹ مالیکیول الگ تھلگ تھے، اور پانچ کو RC-LH116 (شکل 5B) کے مساوی علاقے میں الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ کمپلیکس کے دوسری طرف زیادہ لپڈز پائے گئے، بنیادی طور پر CDL، جو RC اور αβ-7 سے αβ-13 (شکل 5، A اور B) کے درمیان جمع ہوتے ہیں۔ دیگر ساختی طور پر حل شدہ لپڈز اور ڈٹرجنٹ LH1 رنگ کے باہر واقع ہیں، اور اچھی طرح سے حل شدہ ایسیل چینز LH1 ذیلی یونٹس کے درمیان پھیلی ہوئی ہیں، جنہیں عارضی طور پر RC-LH114-W میں β-DDM کے طور پر نامزد کیا گیا ہے، اور β-DDM اور PO6LDH1 کے مرکب RC میں β-DDM کے طور پر بیان کیا گیا ہے۔ ہمارے ڈھانچے میں چیلیٹنگ لپڈس اور ڈٹرجنٹ کی ملتی جلتی پوزیشنیں اس بات کی نشاندہی کرتی ہیں کہ وہ جسمانی لحاظ سے متعلقہ بائنڈنگ سائٹس ہیں (فگر S12A)۔ Tch میں مساوی مالیکیولز کی پوزیشن بھی اچھی مستقل مزاجی رکھتی ہے۔ نرم اور Trv. سٹرین 970 RC-LH1s (Figure S12, B to E) (9, 12) اور لپڈ ہیڈ گروپ کے ہائیڈروجن بانڈنگ کی باقیات نے ترتیب کی ترتیب (Figure S13) میں کافی اچھا تحفظ ظاہر کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ Conserved CDL جو منسلک ہوتا ہے، ان سائٹوں میں conserved RC-4 ہو سکتا ہے۔
(A اور B) RC-LH114-W (A) اور RC-LH116 (B) پیپٹائڈس کی نمائندگی کارٹونز کے ذریعے کی گئی ہے، اور رنگوں کو چھڑیوں کے ذریعے دکھایا گیا ہے، شکل 1 میں رنگ سکیم کا استعمال کرتے ہوئے، لپڈس کو سرخ رنگ میں دکھایا گیا ہے، اور ڈٹرجنٹ خاکستری میں دکھائے گئے ہیں۔ RC QA اور QB سائٹس کا پابند UQ پیلا ہے، جبکہ الگ تھلگ UQ نیلا ہے۔ (C اور D) وہی خیالات جیسے (A) اور (B)، لپڈز کو چھوڑ کر۔ (E سے G) RC-LH116 سے Q1(E)، Q2(F) اور Q3(G) کا بڑا منظر، ایک دوسرے پر اثر انداز ہونے والی سائیڈ چینز کے ساتھ۔ ہائیڈروجن بانڈز کو سیاہ ڈیشڈ لائنوں کے طور پر دکھایا گیا ہے۔
RC-LH116 میں، دونوں RC QA اور QB UQ، جو چارج علیحدگی کے عمل میں الیکٹران کی منتقلی میں حصہ لیتے ہیں، اپنی بائنڈنگ سائٹس میں گل جاتے ہیں۔ تاہم، RC-LH114-W میں، QB کوئینون حل نہیں ہوا ہے اور ذیل میں تفصیل سے بات کی جائے گی۔ QA اور QB quinones کے علاوہ، دو چیلیٹڈ UQ مالیکیولز (RC-LH1 حلقوں کے درمیان واقع ہیں) RC-LH114-W ڈھانچے میں ان کے اچھی طرح سے حل شدہ ہیڈ گروپس (بالترتیب Q1 اور Q2 میں واقع) کے مطابق مختص کیے گئے ہیں۔ خلا)۔ شکل 5C)۔ دو isoprene یونٹس Q1 کو تفویض کیے گئے ہیں، اور کثافت کا نقشہ Q2 کی مکمل 10 isoprene ٹیل کو حل کرتا ہے۔ RC-LH116 کی ساخت میں، تین چیلیٹڈ UQ10 مالیکیولز (Q1 سے Q3، Figure 5D) کو حل کیا گیا تھا، اور تمام مالیکیولز کی پوری دم میں واضح کثافت ہوتی ہے (شکل 5، D سے G)۔ دو ڈھانچے میں، Q1 اور Q2 کے کوئنون ہیڈ گروپس کی پوزیشنیں بہترین مستقل مزاجی (فگر S12F) رکھتی ہیں، اور وہ صرف RC کے ساتھ تعامل کرتے ہیں۔ Q1 RC-LH114-W (شکل 1G اور 5, C, D اور E) کے W خلا کے داخلی دروازے پر واقع ہے، اور Q2 QB بائنڈنگ سائٹ (شکل 5, C, D) اور F) کے قریب واقع ہے۔ محفوظ شدہ L-Trp143 اور L-Trp269 باقیات Q1 اور Q2 کے بہت قریب ہیں اور ممکنہ π-اسٹیکنگ تعاملات فراہم کرتے ہیں (شکل 5، E اور F، اور شکل S12)۔ L-Gln88، Q1 کی ڈسٹل آکسیجن سے 3.0 Å، ایک مضبوط ہائیڈروجن بانڈ فراہم کرتا ہے (شکل 5E)؛ یہ باقیات تمام RCs میں محفوظ ہیں سوائے انتہائی دور دراز کے تعلق کے (شکل S13)۔ L-Ser91 قدامت پسندی سے دوسرے RCs میں Thr کا متبادل ہے (شکل S13)، Q1 کے میتھائل آکسیجن سے 3.8 اینگسٹروم ہے، اور کمزور ہائیڈروجن بانڈز فراہم کر سکتا ہے (شکل 5E)۔ Q3 کا کوئی خاص تعامل نظر نہیں آتا، لیکن یہ RC-M سبونائٹ اور LH1-α سبونائٹ 5 سے 6 (شکل 5، D اور G) کے درمیان ہائیڈروفوبک خطے میں واقع ہے۔ Q1، Q2 اور Q3 یا قریبی chelated quinones کو بھی Tch میں حل کیا گیا ہے۔ نرم، Trv. تناؤ 970 اور Blc۔ ایرس کا ڈھانچہ (9, 10, 12) RC-LH1 کمپلیکس (Figure S12G) میں ایک محفوظ معاون کوئینون بائنڈنگ سائٹ کی طرف اشارہ کرتا ہے۔ RC-LH116 میں پانچ سڑے ہوئے UQs ہر کمپلیکس کے 5.8±0.7 کے ساتھ اچھے معاہدے میں ہیں جو ہائی پرفارمنس لیکویڈ کرومیٹوگرافی (HPLC) کے ذریعے متعین ہوتے ہیں، جب کہ RC-LH114-W میں تین سڑے ہوئے UQs 6.2±0.3 کی پیمائش شدہ قدر سے کم ہیں (تصویر میں S14 کی ساخت کی نشاندہی نہیں کی گئی ہے)۔
pseudo-symmetric L اور M پولی پیپٹائڈس میں سے ہر ایک میں پانچ TMHs ہوتے ہیں اور ایک ہیٹروڈائمر بناتے ہیں جو ایک BChl dimer، دو BChl monomers، دو بیکٹیریوفیج (BPh) مونومر، اور ایک غیر ہیم آئرن اور ایک یا دو UQ10 مالیکیولز کو ملاتا ہے۔ ٹرمینل کیٹون گروپ پر ہائیڈروجن بانڈز کی موجودگی اور Rps میں اس کے معلوم جمع ہونے کے ذریعے، کیروٹینائڈز کو M-subunit میں شامل کیا جاتا ہے، جس کا نام cis-3,4-dehydroorhodopin ہے۔ انواع (25)۔ RC-H کا بیرونی جھلی کا ڈومین ایک ہی TMH کے ذریعہ جھلی کے ساتھ لنگر انداز ہوتا ہے۔ RC کا مجموعی ڈھانچہ متعلقہ پرجاتیوں (جیسے Rba) کے تین ذیلی یونٹ RC جیسا ہے۔ sphaeroides (PDB ID: 3I4D)۔ BChl اور BPh کے میکرو سائیکل، کیروٹینائڈ بیک بون اور نان ہیم آئرن ان ڈھانچے کی ریزولوشن رینج کے اندر اوورلیپ ہوتے ہیں، جیسا کہ QA سائٹ پر UQ10 ہیڈ گروپ اور RC-LH116 (Figure S15) پر QB کوئینون۔
مختلف QB سائٹ پر قبضے کی شرحوں کے ساتھ دو RC ڈھانچے کی دستیابی QB کوئینون بائنڈنگ کے ساتھ مستقل تبدیلیوں کی جانچ کرنے کا ایک نیا موقع فراہم کرتی ہے۔ RC-LH116 کمپلیکس میں، QB quinone مکمل طور پر پابند "قریبی" پوزیشن (26) میں واقع ہے، لیکن RC-LH114-W کی علیحدگی میں QB کوئینون نہیں ہے۔ RC-LH114-W میں کوئی QB quinone نہیں ہے، جو حیران کن ہے کیونکہ کمپلیکس فعال ہے، RC-LH116 کمپلیکس سے زیادہ ساختی طور پر حل شدہ QB quinone کے ساتھ۔ اگرچہ دو LH1 رِنگز تقریباً چھ کونونز کو چیلیٹ کرتے ہیں، پانچ کو ساختی طور پر بند RC-LH116 رنگ میں حل کیا جاتا ہے، جبکہ صرف تین کھلے RC-LH114-W رنگ میں ساختی طور پر محدود ہوتے ہیں۔ یہ بڑھتی ہوئی ساختی خرابی RC-LH114-W QB سائٹس کی تیزی سے تبدیلی، کمپلیکس میں تیز ترین کوئنون کائینیٹکس، اور LH1 لوپ کو عبور کرنے کے بڑھتے ہوئے امکانات کی عکاسی کر سکتی ہے۔ ہم تجویز کرتے ہیں کہ RC-LH114-W کی RC QB سائٹ میں UQ کی کمی زیادہ پیچیدہ اور زیادہ فعال کمپلیکس کا نتیجہ ہو سکتی ہے، اور RC-LH114-W کی QB سائٹ کو فوری طور پر UQ ٹرن اوور میں منجمد کر دیا گیا ہے مخصوص مرحلہ (QB سائٹ کا داخلہ بند کر دیا گیا ہے) اس سرگرمی کی تشکیل کو ظاہر کرتا ہے۔
QB کے بغیر، L-Phe217 کی ایک ایسی پوزیشن پر گردش جو UQ10 بائنڈنگ سے مطابقت نہیں رکھتی، کیونکہ یہ دم کی پہلی آئسوپرین یونٹ (شکل 6A) کے ساتھ مقامی تصادم کا سبب بنے گی۔ اس کے علاوہ، واضح بنیادی تبدیلیاں واضح ہیں، خاص طور پر ہیلکس ڈی (ٹی ایم ایچ ڈی اور ای کے درمیان لوپ میں مختصر ہیلکس) جہاں L-Phe217 کو QB بائنڈنگ جیب میں منتقل کیا جاتا ہے اور L-Tyr223 کی گردش (شکل 6A) ہائیڈروجن بانڈ کو توڑنے کے لیے QB4sp کے فریم کے ساتھ ہائیڈروجن بانڈ کو بند کر دیتا ہے۔ بائنڈنگ سائٹ (شکل 6B)۔ ہیلکس ڈی پیوٹ اس کی بنیاد پر، L-Ser209 کا Cα 0.33Å سے شفٹ ہوا ہے، جبکہ L-Val221Cα کو 3.52Å سے شفٹ کیا گیا ہے۔ TMH D اور E میں کوئی قابل مشاہدہ تبدیلیاں نہیں ہیں، جو دونوں ڈھانچے (شکل 6A) میں غیر معمولی ہیں۔ جہاں تک ہم جانتے ہیں، قدرتی RC میں یہ پہلا ڈھانچہ ہے جو QB سائٹ کو بند کرتا ہے۔ مکمل (QB- پابند) ڈھانچے کے ساتھ موازنہ ظاہر کرتا ہے کہ کوئنون کو کم کرنے سے پہلے، اسے کوئینون میں داخل کرنے کے لیے ایک تبدیلی کی ضرورت ہوتی ہے۔ L-Phe217 کوئنون ہیڈ گروپ کے ساتھ ایک π-اسٹیکنگ تعامل بنانے کے لیے گھومتا ہے، اور ہیلکس باہر کی طرف شفٹ ہوتا ہے، جس سے L-Gly222 کے کنکال اور L-Tyr223 کے سائیڈ چین کو ایک مستحکم ہائیڈروجن بانڈ کی ساخت کے ساتھ ہائیڈروجن بانڈ نیٹ ورک بنانے کی اجازت ملتی ہے (شکل 6 اور تصویر)۔
(A) ہولوگرام (L چین، اورنج/M چین، میجنٹا) اور apo (گرے) ڈھانچے کا اوور لیپنگ کارٹون، جس میں کلیدی باقیات کو چھڑی نما نمائندگی کی شکل میں ظاہر کیا جاتا ہے۔ UQ10 کی نمائندگی پیلے رنگ کی بار سے ہوتی ہے۔ نقطے والی لائن پورے ڈھانچے میں بننے والے ہائیڈروجن بانڈز کی نشاندہی کرتی ہے۔ (B اور C) بالترتیب نیلے رنگ میں L-Phe217 اور L-Tyr223 کی سائیڈ چین آکسیجن کو نمایاں کرتے ہوئے، اپولیپوپروٹین اور پورے رنگ کے ڈھانچے کی سطح کی نمائندگی۔ L subunit نارنجی ہے؛ M اور H ذیلی یونٹ رنگین نہیں ہیں۔ (D اور E) Apolipoprotein (D) اور پوری (E) RC QB سائٹس [رنگ بذریعہ (A) بالترتیب] اور Thermophilus thermophilus PSII (سبز، نیلے رنگ کے ساتھ پلاسٹک کوئینون؛ PDB ID: 3WU2) الائن (58)۔
غیر متوقع طور پر، اگرچہ LH1 کے بغیر QB کی کمی والے RCs کے کئی ڈھانچے دستیاب ہیں، اس مطالعے میں مشاہدہ کی گئی تبدیلیوں کی پہلے اطلاع نہیں دی گئی ہے۔ ان میں Blc سے QB کی کمی کا ڈھانچہ شامل ہے۔ viridis (PDB ID: 3PRC) (27)، Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) اور Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29)، یہ سب تقریباً ان کی مجموعی QB ساخت کے برابر ہیں۔ 3PRC کے قریبی معائنے سے یہ بات سامنے آئی کہ LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ڈٹرجنٹ کے مالیکیول QB پوزیشن کے داخلی دروازے پر جکڑے ہوئے ہیں، جو کہ بند شکل میں دوبارہ ترتیب دینے سے روک سکتے ہیں۔ اگرچہ LDAO 1EYS یا 1OGV میں ایک ہی پوزیشن پر نہیں گلتا ہے، لیکن یہ RCs ایک ہی صابن کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے جاتے ہیں اور اس لیے وہی اثر پیدا کر سکتے ہیں۔ Rba کا کرسٹل ڈھانچہ۔ Sphaeroides RC کو cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) کے ساتھ مل کر کرسٹلائز کیا گیا ہے ایسا لگتا ہے کہ ایک بند QB سائٹ بھی ہے۔ تاہم، اس معاملے میں، RC-M پولی پیپٹائڈ کا N-ٹرمینل علاقہ (Q helix پر Tyr کی باقیات کے H بانڈ کے ذریعے QB بائنڈنگ سائٹ کے ساتھ تعامل کرتا ہے) ایک غیر فطری تبدیلی کو اپناتا ہے، اور QB کی تبدیلی کی مزید تلاش نہیں کی جاتی ہے (30)۔ جو بات تسلی بخش ہے وہ یہ ہے کہ ہم نے RC-LH114-W ڈھانچے میں M پولی پیپٹائڈ کی اس قسم کی خرابی نہیں دیکھی ہے، جو کہ تقریباً RC-LH116 RC کے N-ٹرمینل خطے کے برابر ہے۔ یہ بھی واضح رہے کہ ڈٹرجنٹ پر مبنی LH1 اینٹینا کے خاتمے کے بعد، PDB میں apolipoprotein RCs کو حل کیا گیا تھا، جس نے RC اور ارد گرد کے LH1 رنگ کی اندرونی سطح کے درمیان خلا میں موجود اندرونی کوئنون پولز اور لپڈز کو ختم کر دیا تھا (31، 32)۔ RC فعال رہتا ہے کیونکہ یہ تمام کوفیکٹرز کو برقرار رکھتا ہے، سوائے گلنے والے QB کوئینون کے، جو کم مستحکم ہوتا ہے اور تیاری کے عمل کے دوران اکثر ضائع ہو جاتا ہے (33)۔ اس کے علاوہ، یہ معلوم ہے کہ RC سے LH1 اور قدرتی سائیکلک لپڈز کو ہٹانے سے افعال پر اثر پڑ سکتا ہے، جیسے کہ چارج سے الگ P+QB-ریاست (31, 34, 35) کی مختصر عمر۔ لہذا، ہم قیاس کرتے ہیں کہ RC کے ارد گرد مقامی LH1 رنگ کا وجود "بند" QB سائٹ کو برقرار رکھ سکتا ہے، اس طرح QB کے قریب مقامی ماحول کو محفوظ رکھتا ہے۔
اگرچہ apolipoprotein (QB quinone کے بغیر) اور مکمل ڈھانچہ QB سائٹ کے ٹرن اوور کے صرف دو اسنیپ شاٹس کی نمائندگی کرتا ہے، بجائے اس کے کہ واقعات کی ایک سیریز کے، اس بات کے اشارے موجود ہیں کہ بائنڈنگ کو ہائیڈروکوئنون کے ذریعے ری بائنڈنگ کو روکنے کے لیے گیٹ کیا جا سکتا ہے تاکہ سبسٹریٹ کی روک تھام کو روکا جا سکے۔ اپولیپوپروٹین کی کیو بی سائٹ کے قریب کوئینولول اور کوئنون کا تعامل مختلف ہو سکتا ہے، جس کی وجہ سے RC کی طرف سے اسے مسترد کر دیا جاتا ہے۔ یہ طویل عرصے سے تجویز کیا گیا ہے کہ تعمیراتی تبدیلیاں کوئنز کے پابند اور کمی میں کردار ادا کرتی ہیں۔ تاریک موافقت کے بعد کوئنونز کو کم کرنے کے لیے منجمد RCs کی صلاحیت خراب ہو جاتی ہے (36)؛ ایکس رے کرسٹالوگرافی سے پتہ چلتا ہے کہ یہ نقصان کیو بی کوئنز کے فعال قربت کی پوزیشن سے تقریباً 4.5 Å ایک "ڈسٹل" کنفارمیشن میں پھنس جانے کی وجہ سے ہوا ہے (26)، 37)۔ ہم تجویز کرتے ہیں کہ یہ ڈسٹل بائنڈنگ کنفارمیشن اپولیپوپروٹین اور مکمل انگوٹھی کے ڈھانچے کے درمیان درمیانی حالت کا ایک سنیپ شاٹ ہے، جو کوئینون کے ساتھ ابتدائی تعامل اور کیو بی سائٹ کے افتتاح کی پیروی کرتی ہے۔
مخصوص فوٹوٹروفک بیکٹیریا اور سیانو بیکٹیریا، طحالب اور پودوں کے PSII کمپلیکس میں پائی جانے والی قسم II RC میں ساختی اور فعال تحفظ (38) ہے۔ شکل 6 (D اور E) میں دکھائی گئی ساختی سیدھ PSII RCs اور بیکٹیریل RC کمپلیکس کی QB سائٹ کے درمیان مماثلت پر زور دیتی ہے۔ یہ موازنہ طویل عرصے سے کوئینون بائنڈنگ اور کمی کے قریب سے متعلقہ نظاموں کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک ماڈل رہا ہے۔ پچھلی اشاعتوں نے تجویز کیا کہ تعمیری تبدیلیوں کے ساتھ PSII کوئنز کی کمی (39، 40) کے ساتھ ہے۔ لہذا، RC کے ارتقائی تحفظ پر غور کرتے ہوئے، یہ پہلے سے غیر مشاہدہ شدہ پابند طریقہ کار آکسیجن والے فوٹوٹروفک پودوں میں PSII RC کی QB سائٹ پر بھی لاگو ہو سکتا ہے۔
Rps ΔpufW (بغیر لیبل لگا ہوا pufW حذف) اور PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W قدرتی pufW لوکس سے ظاہر کیا گیا) تناؤ۔ palustris CGA009 ہمارے پچھلے کام (16) میں بیان کیا گیا تھا۔ یہ تناؤ اور آئسوجینک جنگلی قسم کے والدین کو PYE (ہر 5 جی لیٹر -1) (LB میں -80 ° C پر LB میں ذخیرہ کرکے، 50٪ (w/v) گلیسرول پر مشتمل) پروٹین، خمیر کا عرق اور succinate) agar [pw]%5/v. پلیٹ کو رات بھر کمرے کے درجہ حرارت پر انیروبک حالات میں اندھیرے میں سینک دیا جاتا تھا، اور پھر OSRAM 116-W ہالوجن بلب (RS Components، UK) کے ذریعے فراہم کردہ سفید روشنی (~50 μmolm-2 s-1) سے روشن کیا جاتا تھا جب تک کہ ایک کالونی ظاہر نہ ہو۔ ایک واحد کالونی کو 10 ملی لیٹر M22+ میڈیم (41) ٹیکہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا جس میں 0.1% (w/v) کاسامینو ایسڈز (اس کے بعد M22 کہا جاتا ہے) کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا تھا۔ کلچر کو کم آکسیجن حالات میں اندھیرے میں 34 ° C پر اگایا گیا تھا اور 48 گھنٹے تک 180 rpm پر ہلایا گیا تھا، اور پھر کلچر کے 70 ملی لیٹر کو 24 گھنٹے تک انہی حالات میں ٹیکہ لگایا گیا تھا۔ 1 ملی لیٹر کے حجم کے ساتھ ایک نیم ایروبک کلچر 30 ملی لیٹر یونیورسل اسکرو ٹاپ شفاف شیشے کی بوتل میں 30 ملی لیٹر M22 میڈیم کو ٹیکہ لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے اور جراثیم سے پاک مقناطیسی قوت Stirring کے ذریعے 48 گھنٹے تک ایجی ٹیشن (~50μmolm-2 s-1) کے ساتھ شعاع کیا جاتا ہے۔ پھر 30 ملی لیٹر کلچر کو انہی حالات میں تقریباً 1 لیٹر کلچر کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا، جس کے بعد 72 گھنٹے کے لیے 200 μmolm-2 s-1 پر روشن ہونے والے تقریباً 9 لیٹر کلچر کو ٹیکہ لگایا گیا۔ خلیوں کو 30 منٹ کے لیے 7132 RCF پر سینٹرفیوگریشن کے ذریعے کاٹا گیا، 20 mM tris-HCl (pH 8.0) کے ~ 10 ملی لیٹر میں دوبارہ معطل کیا گیا، اور ضرورت پڑنے تک -20 ° C پر محفوظ کیا گیا۔
پگھلنے کے بعد، دوبارہ معطل شدہ خلیوں میں deoxyribonuclease I (Merck, UK)، lysozyme (Merck, UK) اور دو Roche holoenzyme protease inhibitor گولیاں (Merck, UK) کے کچھ کرسٹل شامل کریں۔ 20,000 psi فرانسیسی پریشر سیل (Aminco، USA) میں، خلیات 8 سے 12 بار منقطع ہوئے۔ 18,500 RCF پر 4 ° C پر 15 منٹ کے لیے سینٹرفیوگریشن کے ذریعے غیر ٹوٹے ہوئے خلیات اور ناقابل حل ملبے کو ہٹانے کے بعد، 43,000 ° C پر 2 گھنٹے کے لیے 113,000 RCF پر سنٹرفیوگریشن کے ذریعے جھلی کو پگمنٹڈ لائسیٹ سے نکالا گیا۔ گھلنشیل حصے کو ضائع کریں اور رنگین جھلی کو 100 سے 200 ملی لیٹر 20 ملی میٹر tris-HCl (pH 8.0) میں دوبارہ بند کریں اور اس وقت تک ہم آہنگ کریں جب تک کہ کوئی ظاہری مجموعے نہ ہوں۔ معلق جھلی کو 20 ایم ایم tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace، USA) میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا جس میں 2% (w/v) β-DDM 1 گھنٹہ اندھیرے میں 4 ° C پر ہلکی ہلکی ہلچل کے ساتھ تھا۔ پھر 70°C پر سینٹرفیوج کریں تاکہ 150,000 RCF کو 4°C پر 1 گھنٹہ کے لیے تحلیل کیا جا سکے تاکہ باقی ماندہ غیر حل پذیری کو دور کیا جا سکے۔
ΔpufW تناؤ سے حل کرنے والی جھلی کو 50 ملی لیٹر DEAE Sepharose آئن ایکسچینج کالم پر لاگو کیا گیا تھا جس میں بائنڈنگ بفر [20 mM tris-HCl (pH 8.0) 0.03% (w/v) β-DDM] کے تین کالم والیوم (CV) کے ساتھ تھا۔ کالم کو دو CV بائنڈنگ بفرز سے دھوئیں، اور پھر کالم کو دو بائنڈنگ بفرز سے دھوئیں جن میں 50 mM NaCl ہو۔ RC-LH116 کمپلیکس کو 1.75 CV پر 150 سے 300 mM NaCl (بائنڈنگ بفر میں) کے لکیری گریڈینٹ کے ساتھ ایلوٹ کیا گیا تھا، اور باقی بائنڈنگ کمپلیکس کو 0.5 CV پر 300 mM NaCl پر مشتمل بائنڈنگ بفر کے ساتھ ایلوٹ کیا گیا تھا۔ جذب سپیکٹرم کو 250 اور 1000 nm کے درمیان جمع کریں، جاذب تناسب (A880/A280) کے ساتھ حصہ کو 880 سے 280 nm پر 1 سے زیادہ رکھیں، اسے بائنڈنگ بفر میں دو بار پتلا کریں، اور اسی طریقہ کار کو ڈی ای اے ای پورم پر دوبارہ استعمال کریں۔ 1.7 سے زیادہ A880/A280 تناسب اور 3.0 سے زیادہ A880/A805 تناسب والے حصوں کو پتلا کریں، آئن ایکسچینج کا تیسرا دور انجام دیں، اور A880/A280 تناسب 2.2 سے زیادہ اور A880/A805 تناسب سے زیادہ کے ساتھ فریکشنز کو برقرار رکھیں۔ جزوی طور پر پیوریفائیڈ کمپلیکس کو ایمیکون 100,000 مالیکیولر ویٹ کٹ آف (MWCO) سینٹری فیوگل فلٹر (Merck, UK) میں ~ 2 ملی لیٹر پر مرتکز کیا گیا تھا اور اسے سپرڈیکس 200 16/600 سائز کے اخراج کالم (GE Healthcare, US) پر لوڈ کیا گیا تھا جس میں m2000 پر مشتمل تھا 1.5 CV پر بفر۔ سائز کے اخراج کے حصے کے جذب سپیکٹرا کو اکٹھا کریں، اور A880/A280 تناسب کے ساتھ 2.4 سے زیادہ اور A880/A805 تناسب کے ساتھ جذب سپیکٹرا کو 5.8 سے 100 A880 پر مرکوز کریں، اور انہیں فوری طور پر cryo-TEM گرڈ کی تیاری کے لیے استعمال کریں جب تک کہ 8 ڈگری سینٹی گریڈ کی تیاری یا اسٹوریج کی ضرورت نہ ہو۔
PufW-His strain سے گھلنشیل جھلی 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose کالم (20 mM tris-HCl (pH 8.0) پر IMAC بفر (GE Health) میں 200 mM NaCl اور 0.03% (w/w)) پر لگائی گئی تھی۔ v) β-DDM]۔ کالم کو IMAC بفر کے پانچ CVs سے دھویا گیا، اور پھر IMAC بفر کے پانچ CVs کے ساتھ جس میں 10 ایم ایم ہسٹیڈائن ہے۔ بنیادی کمپلیکس کالم سے 100 ایم ایم ہسٹائڈائن پر مشتمل پانچ IMAC بفروں کے ساتھ الگ کیا گیا تھا۔ RC-LH114-W کمپلیکس پر مشتمل حصہ Amicon 100,000 MWCO فلٹر (Merck, UK) سے لیس ایک ہلائے ہوئے ٹینک میں ~ 10 ملی لیٹر تک مرتکز ہوتا ہے، بائنڈنگ بفر کے ساتھ 20 بار پتلا کیا جاتا ہے، اور پھر 25 ملی لیٹر میں شامل کیا جاتا ہے، DEAnUd سیفاروس کو ایڈوانس میں فورورم بفرز میں استعمال کیا جاتا ہے۔ کالم کو چار CV بائنڈنگ بفرز سے دھوئیں، پھر 0 سے 100 mM NaCl (بائنڈنگ بفر میں) کے لکیری گریڈینٹ پر آٹھ CVs پر کمپلیکس کو ایلیٹ کریں، اور بقیہ چار CVs جن میں 100 mM بائنڈنگ بفر شامل ہیں، سوڈیم کلورائڈ A80/8080 سے زیادہ سوڈیم کلورائڈ پر مشتمل بقایا کمپلیکس 2.4 اور A880/A805 کا تناسب 4.6 فریکشنز سے زیادہ ایک ایمیکون 100,000 MWCO سینٹری فیوگل فلٹر میں ~ 2 ملی لیٹر پر مرکوز کیا گیا تھا، اور پیشگی بفر میں 1.5 CV IMAC سے بھرا گیا تھا 1.5 CV سے زیادہ بفر۔ سائز کے اخراج کے حصوں کے جذب سپیکٹرا کو جمع کریں اور A880/A280 تناسب کے ساتھ 2.1 سے زیادہ اور A880/A805 تناسب کے ساتھ 4.6 سے 100 A880 کے ساتھ جذب سپیکٹرا کو مرتکز کریں، جو فوری طور پر TEM گرڈ کی تیاری یا سٹور پر منجمد کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
ایک Leica EM GP وسرجن فریزر کم درجہ حرارت TEM گرڈ تیار کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ کمپلیکس کو IMAC بفر میں 50 کے A880 میں پتلا کر دیا گیا تھا، اور پھر 5μl کو ایک نئے گلو سے خارج ہونے والے QUANTIFOIL 1.2/1.3 کاربن لیپت تانبے کی جالی (Agar Scientific، UK) پر لاد دیا گیا تھا۔ گرڈ کو 20 ڈگری سینٹی گریڈ اور 60 فیصد رشتہ دار نمی پر 30 سیکنڈ تک انکیوبیٹ کریں، پھر اسے 3 سیکنڈ کے لیے خشک کریں، اور پھر اسے مائع ایتھین میں -176 ڈگری سینٹی گریڈ پر بجھائیں۔
RC-LH114-W کمپلیکس کا ڈیٹا eBIC (الیکٹرانک بائیو امیجنگ سینٹر) (برٹش ڈائمنڈ لائٹ سورس) پر ٹائٹن کریوس مائیکروسکوپ کے ساتھ ریکارڈ کیا گیا، جو 300kV کے تیز رفتار وولٹیج پر کام کرتا ہے، جس میں برائے نام اضافہ 130,000× اور ایک گیپ کی چوز کی توانائی ہے۔ ڈیٹا اکٹھا کرنے کے لیے کاؤنٹنگ موڈ میں تصاویر کو ریکارڈ کرنے کے لیے K2 چوٹی ڈیٹیکٹر کے ساتھ ایک Gatan 968 GIF کوانٹم استعمال کیا گیا۔ کیلیبریٹڈ پکسل سائز 1.048Å ہے، اور خوراک کی شرح 3.83 e-Å-2s-1 ہے۔ فلم کو 11 سیکنڈ میں اکٹھا کیا اور اسے 40 حصوں میں تقسیم کیا۔ مائکروسکوپ کو دوبارہ فوکس کرنے کے لیے کاربن لیپت والے علاقے کا استعمال کریں، اور پھر فی سوراخ تین فلمیں جمع کریں۔ مجموعی طور پر، -1 اور -3μm کے درمیان ڈیفوکس ویلیوز کے ساتھ، 3130 فلمیں جمع کی گئیں۔
RC-LH116 کمپلیکس کا ڈیٹا اسی خوردبین کا استعمال کرتے ہوئے Asterbury Biostructure Laboratory (یونیورسٹی آف لیڈز، UK) میں جمع کیا گیا تھا۔ ڈیٹا کو گنتی کے موڈ میں 130 k کی میگنیفیکیشن کے ساتھ اکٹھا کیا گیا تھا، اور پکسل سائز کو 4.6 e-Å-2s-1 کی خوراک کے ساتھ 1.065 Å پر کیلیبریٹ کیا گیا تھا۔ فلم 12 سیکنڈ میں ریکارڈ کی گئی اور اسے 48 حصوں میں تقسیم کیا گیا۔ مجموعی طور پر، 3359 فلمیں جمع کی گئیں، جن میں -1 اور -3μm کے درمیان ڈیفوکس ویلیوز تھیں۔
تمام ڈیٹا پروسیسنگ ریلیون 3.0 پائپ لائن (42) میں کی جاتی ہے۔ خوراک کے وزن کے ذریعے بیم کی حرکت کو درست کرنے کے لیے Motioncorr 2 (43) کا استعمال کریں، اور پھر CTF (کنٹراسٹ ٹرانسفر فنکشن) پیرامیٹر کا تعین کرنے کے لیے CTFFIND 4.1 (44) استعمال کریں۔ پروسیسنگ کے ان ابتدائی مراحل کے بعد عام فوٹومیکروگرافس کو شکل 2. S16 میں دکھایا گیا ہے۔ خودکار انتخاب کا ٹیمپلیٹ 250 پکسل فریم میں 1000 ذرات کے تقریباً 250 پکسلز کو دستی طور پر منتخب کرکے اور کوئی حوالہ دو جہتی (2D) درجہ بندی کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے، اس طرح ان درجہ بندیوں کو مسترد کر دیا جاتا ہے جو نمونے کی آلودگی کو پورا کرتے ہیں یا کوئی قابل فہم خصوصیات نہیں رکھتے۔ پھر، تمام مائیکرو فوٹوگرافس پر خودکار انتخاب کیا گیا، اور RC-LH114-W 849,359 ذرات تھے، اور RC-LH116 کمپلیکس 476,547 ذرات تھے۔ تمام منتخب ذرات غیر حوالہ 2D درجہ بندی کے دو دوروں سے گزر چکے ہیں، اور ہر دوڑ کے بعد، وہ ذرات جو کاربن کے علاقے سے ملتے ہیں، نمونے کی آلودگی، کوئی واضح خصوصیات یا مضبوطی سے اوورلیپنگ پارٹیکلز کو مسترد کر دیا گیا ہے، جس کے نتیجے میں 772,033 (90.9%) اور 359,678 (75.5%D کی درجہ بندی کے لیے استعمال کیے گئے ہیں) RC-LH114-W اور RC-LH116 بالترتیب۔ ابتدائی 3D حوالہ ماڈل اسٹاکسٹک گریڈینٹ ڈیسنٹ طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ ابتدائی ماڈل کو بطور حوالہ استعمال کرتے ہوئے، منتخب ذرات کو 3D میں چار زمروں میں درجہ بندی کیا گیا ہے۔ اس زمرے میں ماڈل کو حوالہ کے طور پر استعمال کرتے ہوئے، سب سے بڑے زمرے میں ذرات پر 3D ریفائننگ انجام دیں، پھر سالوینٹ ایریا کو کور کرنے کے لیے ابتدائی 15Å کم پاس فلٹر استعمال کریں، 6 پکسلز نرم کناروں کا اضافہ کریں، اور ٹاپ ڈیٹیکٹر کے Gatan K2 چوٹی کے ماڈیولیشن ٹرانسفر فنکشن کو درست کرنے کے لیے پکسلز کو پوسٹ پروسیس کریں۔ RC-LH114-W ڈیٹاسیٹ کے لیے، اس ابتدائی ماڈل میں ماسک کے کناروں پر مضبوط کثافت کو ہٹا کر ترمیم کی گئی تھی (UCSF Chimera میں بنیادی پیچیدہ کثافت سے منقطع)۔ نتیجے میں آنے والے ماڈل (RC-LH114-W اور RC-LH116 کی قراردادیں بالترتیب 3.91 اور 4.16 Å ہیں) 3D درجہ بندی کے دوسرے دور کے حوالے کے طور پر استعمال ہوتے ہیں۔ استعمال شدہ ذرات کو ابتدائی 3D کلاس میں گروپ کیا گیا ہے اور ان میں پڑوس کے ساتھ مضبوط تعلق نہیں ہے۔ اوورلیپ یا واضح ساختی خصوصیات کی کمی۔ 3D درجہ بندی کے دوسرے راؤنڈ کے بعد، سب سے زیادہ ریزولوشن والے زمرے کا انتخاب کیا گیا [RC-LH114-W کے لیے، ایک زمرہ 377,703 ذرات (44.5%) ہے، RC-LH116 کے لیے، دو قسمیں ہیں، کل 260,752 ذرات (54.7%)، جہاں ابتدائی فرق کے بعد صرف ایک ہی فرق کے ساتھ۔ منتخب ذرات کو 400 پکسل باکس میں دوبارہ نکالا جاتا ہے اور 3D ریفائننگ کے ذریعے بہتر کیا جاتا ہے۔ سالوینٹ ماسک ابتدائی 15Å کم پاس فلٹر، 3 پکسل میپ ایکسپینشن اور 3 پکسل نرم ماسک کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا جاتا ہے۔ فی پارٹیکل سی ٹی ایف ریفائنمنٹ کا استعمال کرتے ہوئے، فی پارٹیکل موشن کریکشن اور فی پارٹیکل سی ٹی ایف ریفائنمنٹ کا دوسرا راؤنڈ، 3D ریفائنمنٹ، سالوینٹ ماسکنگ اور پوسٹ پروسیسنگ ہر قدم کے بعد نتیجے میں آنے والی ساخت کو مزید بہتر کرنے کے لیے انجام دیا جاتا ہے۔ 0.143 کی FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) کٹ آف ویلیو کا استعمال کرتے ہوئے، RC-LH114-W اور RC-LH116 کے فائنل ماڈلز کی ریزولوشنز بالترتیب 2.65 اور 2.80Å ہیں۔ فائنل ماڈل کا FSC وکر شکل 2. S17 میں دکھایا گیا ہے۔
تمام پروٹین کی ترتیب UniProtKB: LH1-β (PufB؛ UniProt ID: Q6N9L5) سے ڈاؤن لوڈ کی جاتی ہے۔ LH1-α (PufA؛ UniProtID: Q6N9L4)؛ RC-L (PufL؛ UniProt ID: O83005)؛ RC-M (PufM؛ UniProt ID: A0A4Z7)؛ RC-H (PuhA؛ UniProt ID: A0A4Z9)؛ پروٹین-W (PufW؛ UniProt ID: Q6N1K3)۔ SWISS-MODEL (45) کا استعمال RC کے ہومولوجی ماڈل کی تعمیر کے لیے کیا گیا تھا، جس میں RC-L، RC-M اور RC-H کے پروٹین کی ترتیب اور Rba کا کرسٹل ڈھانچہ شامل ہے۔ sphaeroides RC کو بطور ٹیمپلیٹ استعمال کیا گیا تھا (PDB ID: 5LSE) (46)۔ UCSF Chimera میں "فٹ میپ" ٹول کا استعمال کریں تاکہ تیار کردہ ماڈل کو نقشے میں فٹ کیا جا سکے (47)، پروٹین کی ساخت کو بہتر بنائیں، اور کوفیکٹر [4×BChl a (monomer library residue name = BCL)، 2×BPh a (BPH)، ایک یا دو قسم کے UQ10 (U10)، ایک نان ہیم آئرن اور ون ہائیڈرول لائن (F3-Hyme iron) (QAK)] شامل کرنے کے لیے Coot (48) کا استعمال کریں۔ چونکہ QAK مونومر لائبریری میں دستیاب نہیں ہے، اس لیے اسے PHENIX (49) میں eLBOW ٹول کا استعمال کرتے ہوئے پیرامیٹرائز کیا گیا تھا۔
اگلا، LH1 ذیلی یونٹ تعمیر کیا گیا تھا. ابتدائی طور پر، PHENIX (49) میں خودکار کنسٹرکشن ٹول کا استعمال خود بخود LH1 ترتیب کا حصہ بنانے کے لیے نقشہ اور LH1-α اور LH1-β پروٹین کی ترتیب کو بطور ان پٹ استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا تھا۔ سب سے مکمل LH1 ذیلی یونٹ کو منتخب کریں، اسے نکالیں اور Coot میں لوڈ کریں، اس میں دستی طور پر گمشدہ ترتیب کو شامل کریں، اور دو BCls a (BCL) اور ایک spirilloxanthin (CRT) شامل کرنے سے پہلے پورے ڈھانچے کو دستی طور پر بہتر کریں پرجاتیوں (17)]۔ مکمل LH1 ذیلی یونٹ کو کاپی کریں، اور LH1 کثافت کے ملحقہ غیر ماڈل والے علاقے میں ڈاک کرنے کے لیے UCSF Chimera "ڈاکنگ میپ ٹول" کا استعمال کریں، اور پھر اسے Coot میں بہتر کریں۔ اس عمل کو اس وقت تک دہرائیں جب تک کہ تمام LH1 ذیلی یونٹس کو ماڈل نہ کیا جائے۔ RC-LH114-W ڈھانچے کے لیے، Coot میں غیر مختص کثافت کو نکال کر، USCF Chimera کے نقشے میں پروٹین کو بقیہ غیر پروٹین اجزاء سے الگ کیا جاتا ہے اور ابتدائی ماڈل قائم کرنے کے لیے Autobuild ٹول کا استعمال کیا جاتا ہے، اور بقیہ ذیلی یونٹس (پروٹین-W) ماڈلنگ۔ فینکس (49) میں۔ Coot (48) کے نتیجے میں آنے والے ماڈل میں کسی بھی گمشدہ ترتیب کو شامل کریں، اور پھر پوری ذیلی یونٹ کو دستی طور پر بہتر کریں۔ بقیہ غیر مختص شدہ کثافت لپڈز (CDL = CDL کی PDB monomer لائبریری ID، POPC = 6PL اور POPG = PGT)، β-DDM ڈٹرجنٹ (LMT) اور UQ10 مالیکیولز (U10) کے مجموعے پر فٹ بیٹھتی ہے۔ مکمل ابتدائی ماڈل کو مکمل کرنے کے لیے Coot (48) میں PHENIX آپٹیمائزیشن (49) اور دستی اصلاح کا استعمال کریں جب تک کہ ماڈل کے اعداد و شمار اور فٹ کے بصری معیار کو مزید بہتر نہ کیا جائے۔ آخر میں، مقامی نقشے کو تیز کرنے کے لیے LocScale (50) کا استعمال کریں، اور پھر غیر مختص کثافت اور خودکار اور دستی اصلاح کے ماڈلنگ کے کئی دوسرے چکر انجام دیں۔
متعلقہ پیپٹائڈس، کوفیکٹرز اور دیگر لپڈز اور کوئنونز ان کی متعلقہ کثافتوں کے اندر ڈوب گئے ہیں جو اعداد و شمار 1 اور 2 میں دکھائے گئے ہیں۔ S18 سے S23 تک۔ حتمی ماڈل کی شماریاتی معلومات ٹیبل S1 میں دکھائی گئی ہیں۔
جب تک کہ دوسری صورت میں وضاحت نہ کی گئی ہو، UV/Vis/NIR جذب سپیکٹرا کو Cary60 اسپیکٹرو فوٹومیٹر (Agilent، USA) پر 250 nm سے 1000 nm تک 1 nm وقفوں پر اور 0.1s کے انضمام کا وقت جمع کیا گیا تھا۔
نمونے کو کوارٹج کیویٹ میں 1 کے A880 کے 2 ملی میٹر راستے کے ساتھ پتلا کریں، اور 400 اور 1000 nm کے درمیان جذب سپیکٹرم کو جمع کریں۔ سرکلر ڈیکروک سپیکٹرا کو Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco, Japan) پر 1 nm وقفوں پر 400 nm اور 950 nm کے درمیان 20 nm منٹ-1 کی اسکین کی شرح پر جمع کیا گیا تھا۔
داڑھ کے ختم ہونے کے قابلیت کا تعین کور کمپلیکس کو تقریباً 50 کے A880 میں گھٹا کر کیا جاتا ہے۔ 10μl والیوم کو 990μl بائنڈنگ بفر یا میتھانول میں پتلا کریں، اور BChl انحطاط کو کم کرنے کے لیے فوری طور پر جذب سپیکٹرم جمع کریں۔ ہر میتھانول کے نمونے کے BChl مواد کو 54.8 mM-1 cm-1 کے 771 nm پر ختم ہونے والے گتانک کے ذریعہ شمار کیا گیا تھا، اور معدومیت کے گتانک کا تعین کیا گیا تھا (51)۔ بنیادی پیچیدہ ارتکاز کا تعین کرنے کے لیے ناپے گئے BChl ارتکاز کو 32 (RC-LH114-W) یا 36 (RC-LH116) سے تقسیم کریں، جو پھر بفر ایکسٹینکشن کوفیشنٹ میں جمع کردہ اسی نمونے کے جذب سپیکٹرم کا تعین کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ متوازی ہر نمونے کے لیے تین بار بار پیمائش کی گئی تھی، اور حساب کے لیے زیادہ سے زیادہ BChl Qy کی اوسط جذب کا استعمال کیا گیا تھا۔ 878 nm پر ماپا جانے والے RC-LH114-W کا معدومیت کا گتانک 3280±140 mM-1 cm-1 ہے، جبکہ RC-LH116 کا معدومیت کا گتانک 880 nm پر ماپا گیا ہے 3800±30 mM-1 cm-1 ہے۔
(52) میں طریقہ کے مطابق UQ10 کی مقدار درست کی گئی۔ مختصراً، ریورس فیز HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ 50:50 میتھانول کے 50μl میں RC-LH116 یا RC-LH114-W کے تقریبا 0.02 nmol کو تحلیل کریں: 0.02% (w/v) فیرک کلورائڈ پر مشتمل کلوروفارم، اور پہلے سے متوازن بیک مین کولٹر الٹراسفیئر ODS-1 ملی میٹر 1 ملی میٹر -1 ملی میٹر ڈس اسفیئر میں انجیکشن لگائیں۔ HPLC سالوینٹ (80:20 میتھانول: 2-propanol) × 25 سینٹی میٹر کالم پر 40°C پر۔ 1 گھنٹے کے لیے 275 nm (UQ10)، 450 nm (carotenoids) اور 780 nm (BChl) پر جاذبیت کی نگرانی کے لیے HPLC سالوینٹس میں isocratic elution انجام دیں۔ 25.5 منٹ پر 275 nm کرومیٹوگرام میں چوٹی کو مربوط کیا گیا تھا، جس میں کوئی اور قابل شناخت مرکبات شامل نہیں تھے۔ انٹیگریٹڈ ایریا کو 0 سے 5.8 nmol (فگر S14) کے خالص معیارات کے انجیکشن سے شمار کیے جانے والے کیلیبریشن کریو کے حوالے سے نکالی گئی UQ10 کی داڑھ کی مقدار کا حساب لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ ہر نمونے کا تجزیہ تین نقلوں میں کیا گیا تھا، اور اطلاع دی گئی غلطی اوسط کے SD سے مساوی ہے۔
0.1 کے زیادہ سے زیادہ Qy جذب کے ساتھ RC-LH1 کمپلیکس پر مشتمل ایک حل 30 μM کم ہارس ہارٹ سائٹوکوم c2 (Merck، UK) اور 0 سے 50 μMUQ2 (Merck، UK) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔ ہر UQ2 ارتکاز پر 1-ml کے تین نمونے تیار کیے گئے تھے اور پیمائش سے پہلے اندھیرے میں مکمل موافقت کو یقینی بنانے کے لیے 4°C پر راتوں رات اندھیرے میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس محلول کو OLIS RSM1000 ماڈیولر سپیکٹرو فوٹومیٹر میں لوڈ کیا گیا تھا جو 300 nm شعلہ/500 لائن گریٹنگ، 1.24 ملی میٹر انلیٹ، 0.12 ملی میٹر درمیانی اور 0.6 ملی میٹر آؤٹ لیٹ سلٹس سے لیس تھا۔ ایک 600 nm لمبا پاس فلٹر نمونہ فوٹو ٹیوب کے داخلی دروازے پر رکھا جاتا ہے اور جوش کی روشنی کو خارج کرنے کے لیے حوالہ فوٹو ملٹی پلیئر ٹیوب۔ جاذب کی نگرانی 550 nm پر 0.15 s کے انضمام وقت کے ساتھ کی گئی۔ ایکسائٹیشن لائٹ 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) سے 90% شدت پر فائبر آپٹک کیبل کے ذریعے DC2200 کنٹرولر (Thorlabs Ltd., UK) کے ذریعے خارج ہوتی ہے اور 90° پر روشنی کے منبع میں خارج ہوتی ہے۔ ماپنے والی شہتیر آئینے کے خلاف ہے کسی بھی روشنی کو واپس کرنے کے لیے جو ابتدائی طور پر نمونے سے جذب نہیں ہوئی تھی۔ 50 سیکنڈ کی روشنی سے 10 سیکنڈ پہلے جذب کی نگرانی کریں۔ پھر اندھیرے میں 60 سیکنڈ تک جاذبیت کی مزید نگرانی کی گئی تاکہ اس حد تک اندازہ لگایا جا سکے کہ کوئنولول بے ساختہ سائٹوکوم c23 + کو کس حد تک کم کرتا ہے (خام ڈیٹا کے لیے تصویر S8 دیکھیں)۔
ڈیٹا پر 0.5 سے 10 سیکنڈ کے اندر ایک لکیری ابتدائی شرح (UQ2 ارتکاز پر منحصر ہے) کو فٹ کر کے اور ہر UQ2 ارتکاز پر تینوں نمونوں کی شرحوں کا اوسط لگا کر کارروائی کی گئی۔ RC-LH1 ارتکاز جس کا حساب متعلقہ معدومیت کے قابلیت کے ذریعے کیا گیا تھا اس کا استعمال شرح کو اتپریرک کارکردگی میں تبدیل کرنے کے لیے کیا گیا تھا، جس کی منصوبہ بندی Origin Pro 2019 (OriginLab، USA) میں کی گئی تھی، اور Km اور Kcat کی ظاہری قدروں کا تعین کرنے کے لیے Michaelis-Menten ماڈل میں فٹ کیا گیا تھا۔
عارضی جذب کی پیمائش کے لیے، RC-LH1 نمونے کو IMAC بفر میں ~ 2μM تک پتلا کیا گیا تھا جس میں 50 mM سوڈیم ascorbate (Merck, USA) اور 0.4 mM Terbutin (Merck, USA) شامل تھے۔ Ascorbic ایسڈ کو قربانی کے الیکٹران ڈونر کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، اور tert-butaclofen کو QB inhibitor کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے تاکہ اس بات کو یقینی بنایا جا سکے کہ پیمائش کے پورے عمل میں مرکزی RC ڈونر کم رہے (یعنی فوٹو آکسائیڈ نہیں)۔ تقریباً 3 ملی لیٹر نمونہ حسب ضرورت گھومنے والے سیل (تقریباً 0.1 میٹر قطر، 350 RPM) میں 2 ملی میٹر آپٹیکل پاتھ کی لمبائی کے ساتھ شامل کیا جاتا ہے تاکہ اس بات کو یقینی بنایا جا سکے کہ لیزر پاتھ میں موجود نمونے میں جوش کی دالوں کے درمیان تاریک موافقت کے لیے کافی وقت ہے۔ Ti: Sapphire لیزر سسٹم (Spectra Physics, USA) کو 1 kHz کی تکرار کی شرح پر 880 nm پر نمونے کو اکسانے کے لیے ~100-fs لیزر دالیں استعمال کریں (NIR کے لیے 20 nJ یا Vis کے لیے 100 nJ)۔ ڈیٹا اکٹھا کرنے سے پہلے، نمونے کو تقریباً 30 منٹ تک جوش کی روشنی کے سامنے رکھیں۔ نمائش QA کو غیر فعال کرنے کا سبب بنے گی (ممکنہ طور پر QA کو ایک یا دو بار کم کرنا)۔ لیکن براہ کرم نوٹ کریں کہ یہ عمل الٹنے والا ہے کیونکہ طویل عرصے تک تاریک موافقت کے بعد، RC آہستہ آہستہ QA سرگرمی میں واپس آجائے گا۔ ایک ہیلیوس سپیکٹرومیٹر (الٹرا فاسٹ سسٹمز، یو ایس اے) کو -10 سے 7000 پی ایس کے تاخیری وقت کے ساتھ عارضی سپیکٹرا کی پیمائش کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ڈیٹا سیٹس کو غیر گروپ کرنے کے لیے Surface Xplorer سافٹ ویئر (Ultrafast Systems, USA) کا استعمال کریں، پھر انضمام اور معیاری بنائیں۔ کارپٹ ویو سافٹ ویئر پیکج (لائٹ کنورژن لمیٹڈ، لتھوانیا) استعمال کریں مشترکہ ڈیٹا سیٹ کا استعمال ڈے سے متعلق تفریق اسپیکٹرا حاصل کرنے کے لیے کریں، یا ایک فنکشن استعمال کریں جس میں آلے کے ردعمل کے ساتھ ایک سے زیادہ ایکسپوننٹ شامل ہوں تاکہ Origin (OriginLab، USA) میں سنگل ویو لینتھ اسپیکٹرل ایوولوشن کو فٹ کر سکیں۔
جیسا کہ اوپر ذکر کیا گیا ہے (53)، LH1 کمپلیکس پر مشتمل ایک فوٹوسنتھیٹک فلم تیار کی گئی تھی جس میں RC اور پیریفرل LH2 اینٹینا دونوں کی کمی تھی۔ جھلی کو 20 ایم ایم ٹریس (پی ایچ 8.0) میں پتلا کیا گیا تھا اور پھر 2 ملی میٹر آپٹیکل راستے کے ساتھ کوارٹج کیویٹ میں لاد دیا گیا تھا۔ ایک 30nJ لیزر پلس 540 nm پر -10 سے 7000 ps کی تاخیر کے وقت کے ساتھ نمونے کو پرجوش کرنے کے لیے استعمال کی گئی تھی۔ ڈیٹا سیٹ پر عمل کریں جیسا کہ Rps کے لیے بیان کیا گیا ہے۔ دوست نمونہ.
جھلی کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے 150,000 RCF پر 4 ° C پر 2 گھنٹے کے لیے گولی ماری گئی، اور پھر 880 nm پر اس کی جاذبیت کو 20 mM tris-HCl (pH 8.0) اور 200 mM NaCl میں دوبارہ معطل کر دیا گیا۔ 2% (w/v) β-DDM میں 1 گھنٹہ اندھیرے میں 4°C پر آہستہ آہستہ ہلاتے ہوئے جھلی کو تحلیل کریں۔ نمونے کو 100 ایم ایم ٹرائیتھیلمونیم کاربونیٹ (پی ایچ 8.0) (ٹی ای بی؛ مرک، یو کے) میں 2.5 ملی گرام ایم ایل -1 (بائیو ریڈ تجزیہ) کے پروٹین کی حراستی میں گھٹا دیا گیا تھا۔ مزید پروسیسنگ پہلے شائع شدہ طریقہ (54) سے کی گئی تھی، جس کا آغاز 50 μg پروٹین کو 50 μl TEAB میں کرتے ہوئے کیا گیا تھا جس میں 1٪ (w/v) سوڈیم لاوریٹ (مرک، یو کے) شامل تھے۔ 60 سیکنڈ تک سونیکیشن کے بعد، اسے 30 منٹ کے لیے 37 ° C پر 5 mM tris (2-carboxyethyl) فاسفائن (Merck، UK) کے ساتھ کم کیا گیا۔ S-alkylation کے لیے، نمونے کو 10 mM میتھائل S-methylthiomethanesulfonate (Merck، UK) کے ساتھ انکیوبیٹ کریں اور اسے 200 mM isopropanol سٹاک محلول سے کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے شامل کریں۔ پروٹولیٹک عمل انہضام 2 μg ٹرپسن/اینڈوپروٹینیز لائس-سی مکسچر (پرومیگا یوکے) شامل کرکے کیا گیا تھا اور 37 ° C پر 3 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ لاوریٹ سرفیکٹنٹ کو 50 μl ethyl acetate اور 10 μl 10% (v/v) LC گریڈ trifluoroacetic acid (TFA؛ Thermo Fisher Scientific, UK) شامل کرکے اور 60 s کے لیے vortexing کرکے نکالا گیا تھا۔ مرحلے کی علیحدگی کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے 15,700 RCF پر 5 منٹ کے لیے فروغ دیا گیا۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، ایک C18 اسپن کالم (تھرمو فشر سائنٹیفک، یو کے) کو پیپٹائڈ پر مشتمل نچلے مرحلے کو احتیاط سے ایسپریٹ کرنے اور صاف کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ویکیوم سینٹرفیوگریشن کے ذریعے خشک ہونے کے بعد، نمونے کو 0.5% TFA اور 3% acetonitrile میں تحلیل کر دیا گیا، اور 500 ng کا تجزیہ nanoflow RP کرومیٹریگرافی کے ساتھ ساتھ ماس اسپیکٹومیٹری کے ساتھ پہلے بیان کردہ سسٹم کے پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔
Rps کی تلاش کے لیے پروٹین کی شناخت اور مقدار کے تعین کے لیے MaxQuant v.1.5.3.30 (56) استعمال کریں۔ palustris proteome ڈیٹا بیس (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426)۔ ماس اسپیکٹومیٹری پروٹومکس ڈیٹا کو ڈیٹاسیٹ شناخت کنندہ PXD020402 کے تحت PRIDE پارٹنر ریپوزٹری (http://proteomecentral.proteomexchange.org) کے ذریعے ProteomeXchange الائنس میں جمع کیا گیا ہے۔
الیکٹرو سپرے آئنائزیشن ماس اسپیکٹومیٹری کے ساتھ مل کر RPLC کے تجزیہ کے لیے، RC-LH1 کمپلیکس جنگلی قسم کے Rps سے تیار کیا گیا تھا۔ پہلے شائع شدہ طریقہ (16) کا استعمال کرتے ہوئے، پیلسٹریس سیلز میں پیدا ہونے والی پروٹین کا ارتکاز 2 mg ml-1 تھا 20 mM Hepes (pH 7.8) میں، 100 mM NaCl اور 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، 2D پیوریفیکیشن کٹ (GE Healthcare, USA) استعمال کریں تاکہ 10 μg پروٹین کو ترسیب کے طریقہ سے نکالیں، اور precipitate کو 20 μl 60% (v/v) فارمک ایسڈ (FA)، 20% (v/v) Acetonitrile اور 20% (v/v) پانی میں تحلیل کریں۔ RPLC (Dionex RSLC) کے ذریعہ ماس اسپیکٹومیٹری (Maxis UHR-TOF، Bruker) کے ساتھ پانچ مائیکرو لیٹرز کا تجزیہ کیا گیا۔ 60°C اور 100μlmin -1 پر علیحدگی کے لیے MabPac 1.2×100 ملی میٹر کالم (Thermo Fisher Scientific, UK) کا استعمال کریں، جس کا گریڈینٹ 85% (v/v) سالوینٹ A [0.1% (v/v) FA اور 0.02% (V/v) %5/v) سے BvFA حل [0.1%(v/v) FA اور 0.02%(v/v) in 90%(v/v) acetonitrile TFA] معیاری الیکٹرو سپرے آئنائزیشن سورس اور ڈیفالٹ پیرامیٹرز کو 60 منٹ سے زیادہ استعمال کرتے ہوئے، ماس سپیکٹرو میٹر 100 سے 2750 m/z حاصل کرتا ہے (ماس سے چارج)۔ ExPASy بایو انفارمیٹکس ریسورس پورٹل FindPept ٹول (https://web.expasy.org/findpept/) کی مدد سے، کمپلیکس کے ذیلی یونٹس میں بڑے پیمانے پر سپیکٹرم کا نقشہ بنائیں۔
خلیوں کو 100 ملی لیٹر NF-low (10μMm-2 s-1)، درمیانے (30μMm-2 s-1) یا زیادہ (300μMm-2 s-1) روشنی کے تحت 72 گھنٹے تک بڑھایا گیا تھا۔ M22 میڈیم (M22 میڈیم جس میں امونیم سلفیٹ کو چھوڑ دیا جاتا ہے اور سوڈیم succinate کو سوڈیم acetate سے بدل دیا جاتا ہے) ایک 100 ملی لیٹر سکرو ٹاپ بوتل (23) میں۔ 30-s کے پانچ چکروں میں، 0.1 مائکرون شیشے کے موتیوں کو 1:1 کے حجم کے تناسب سے خلیات کو لیس کرنے کے لیے موتیوں سے باندھا گیا اور 5 منٹ تک برف پر ٹھنڈا کیا گیا۔ ناقابل حل مادہ، غیر ٹوٹے ہوئے خلیات اور شیشے کے موتیوں کو 16,000 RCF پر سینٹرفیوگریشن کے ذریعے 10 منٹ کے لیے بینچ ٹاپ مائیکرو سینٹرفیوج میں ہٹا دیا گیا۔ جھلی کو Ti 70.1 روٹر میں 100,000 RCF کے ساتھ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) میں 40/15% (w/w) سوکروز گریڈینٹ کے ساتھ 10 گھنٹے تک الگ کیا گیا تھا۔
جیسا کہ ہمارے پچھلے کام میں بیان کیا گیا ہے، PufW (16) پر اس کے ٹیگ کی مدافعتی شناخت۔ مختصراً، پیوریفائیڈ کور کمپلیکس (11.8 nM) یا 2x SDS لوڈنگ بفر (Merck, UK) میں RC کی یکساں ارتکاز پر مشتمل جھلی (آکسیڈیشن کے ذریعے کم فرق سپیکٹرم کو گھٹا کر اور داغ والے جیل پر بوجھ کو ملاتے ہوئے) کو دو بار پتلا کیا گیا۔ پروٹین کو 12٪ bis-tris NuPage جیل (تھرمو فشر سائنٹیفک، یو کے) کی نقل پر الگ کیا گیا تھا۔ RC-L سبونائٹ کو لوڈ کرنے اور اسے دیکھنے کے لیے Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad، UK) سے ایک جیل کا داغ لگایا گیا تھا۔ دوسرے جیل پر موجود پروٹین کو میتھانول ایکٹیویٹڈ پولی وینیلائیڈین فلورائیڈ (PVDF) جھلی (تھرمو فشر سائنٹیفک، یوکے) میں امیونوسے کے لیے منتقل کیا گیا تھا۔ PVDF جھلی کو 50 mM tris-HCl (pH 7.6)، 150 mM NaCl، 0.2% (v/v) Tween-20 اور 5% (w/v) سکمڈ دودھ پاؤڈر میں بلاک کیا گیا تھا، اور پھر اینٹی ہز پرائمری اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ 7.6)، 150 mM NaCl اور 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A، Bethyl Laboratories، USA) میں 4 گھنٹے کے لیے۔ اینٹی باڈی بفر میں 5 منٹ تک 3 بار دھونے کے بعد، جھلی کو ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز (سگما-الڈرچ، یو کے) اینٹی ماؤس سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ ملایا گیا (اینٹی باڈی بفر میں 1:10،000 کو پتلا کیا گیا) پتہ لگانے کی اجازت دینے کے لیے انکیوبیٹ (3 دھونے کے بعد 5 منٹ بعد) WESTA 2 میں اینٹی باڈی میں استعمال کیا گیا۔ سبسٹریٹ (Cyanagen، Italy) اور Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK)۔
امیج جے (57) میں ہر داغ والے جیل یا امیونوسے لین کی شدت کی تقسیم کو کھینچ کر، چوٹی کے نیچے کے علاقے کو یکجا کرکے اور RC-L (سٹینڈ جیل) اور پروٹین-W (امیونواسے) کی شدت کے تناسب کا حساب لگا کر، امیج پر کارروائی کریں۔ خالص RC-LH114-W نمونے میں RC-L سے پروٹین-W کا تناسب 1:1 تھا اور اس کے مطابق پورے ڈیٹا کو معمول پر لا کر ان تناسب کو داڑھ کے تناسب میں تبدیل کیا گیا۔
اس مضمون کے ضمنی مواد کے لیے، براہ کرم دیکھیں http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
یہ تخلیقی العام انتساب لائسنس کی شرائط کے تحت تقسیم کردہ ایک کھلا رسائی مضمون ہے۔ مضمون اس شرط کے تحت کسی بھی میڈیم میں غیر محدود استعمال، تقسیم اور تولید کی اجازت دیتا ہے کہ اصل کام کا صحیح حوالہ دیا گیا ہو۔
نوٹ: ہم آپ سے صرف اپنا ای میل ایڈریس فراہم کرنے کو کہتے ہیں تاکہ آپ جس شخص کو صفحہ پر تجویز کرتے ہیں اسے معلوم ہو کہ آپ چاہتے ہیں کہ وہ ای میل دیکھیں اور یہ سپیم نہیں ہے۔ ہم کسی بھی ای میل ایڈریس پر قبضہ نہیں کریں گے۔
یہ سوال یہ جانچنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے کہ آیا آپ وزیٹر ہیں اور خودکار سپیم جمع کرانے سے روکتے ہیں۔
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Hire C. کرسٹو کرسٹن، ہیلو کرسٹو ڈیوئی۔ شکاری
رد عمل کے مرکز میں لائٹ ٹریپ 1 کمپلیکس کا ہائی ریزولوشن ڈھانچہ کوئینون ڈائنامکس میں نئی ​​بصیرت فراہم کرتا ہے۔
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Hire C. کرسٹو کرسٹن، ہیلو کرسٹو ڈیوئی۔ شکاری
رد عمل کے مرکز میں لائٹ ٹریپ 1 کمپلیکس کا ہائی ریزولوشن ڈھانچہ کوئینون ڈائنامکس میں نئی ​​بصیرت فراہم کرتا ہے۔
©2021 امریکن ایسوسی ایشن فار دی ایڈوانسمنٹ آف سائنس۔ تمام حقوق محفوظ ہیں۔ AAAS HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef اور COUNTER کا پارٹنر ہے۔ سائنس ایڈوانسز ISSN 2375-2548۔